调控玉米雄穗分枝数主效QTL的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种调控玉米雄穗分枝数主效QTL的分子标记及其应用。

技术背景

雄穗作为玉米重要的生殖器官，其不仅直接影响玉米种子生产质量，而且与玉米产量形成密切相关。大量研究表明具有较小雄穗的玉米植株，群体下部的透光性强，雄穗生长对养分的消耗少，进而提高玉米产量。此外，学者研究还发现玉米雄穗与抗旱性紧密相关，干旱胁迫下玉米雄穗相关指标如雄穗主轴长和雄穗穗柄长等明显缩短、雄穗分枝数明显减少、抽雄吐丝时间间隔(anthesis-silking interval,ASI)明显延长，最终导致玉米严重减产。雄穗分枝数是雄穗大小的重要评价指标，因此深入剖析玉米雄穗分枝性状的遗传机理及揭示其与抗旱性的内在关系，对玉米高产育种具有重要意义。

雄穗分枝数差异是玉米雄穗的一个重要特征，不同遗传背景材料间的雄穗分枝数差异较大。有的自交系材料雄穗分枝数很多，但有的自交系材料雄穗分枝数很少，甚至无分枝。就遗传表现来说，雄穗分枝数是由多基因控制的复杂数量性状，机理极其复杂，且易受环境影响，因此这给玉米雄穗机理研究带来了诸多困难。近年来，随着分子生物学的深入研究和分子标记技术的不断完善，利用数量性状基因位点(quantitative trait locus,QTL)定位可以大致确定相关数量性状的基因位点和位置，估算各位点的遗传效应，进而为将来分子育种提供理论基础和技术支撑。目前，玉米雄穗分枝数QTL定位研究已成为学者和育种家关注的热点课题，但具有应用价值的雄穗分枝数QTL位点较少，因此，挖掘不同遗传背景下及不同环境下都稳定表达的雄穗分枝数主效QTL对玉米高产育种具有巨大的潜在应用价值。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种调控玉米雄穗分枝数主效QTL的分子标记，本发明还提供辅助选择雄穗分枝较少玉米的方法，本发明还提供调控玉米雄穗分枝数主效QTL的分子标记在玉米育种中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下三项技术方案：

第一、一种调控玉米雄穗分枝数主效QTL的分子标记，其特征在于：由umc2177和umc1378两对引物组成，所述引物umc2177的序列为：

Forward:5’-ACCATGCATGTCTCACGTCACT-3’

Reverse:5’-GGGTACGTGCTGTGGAGGAC-3’

所述引物umc1378的序列为：

Forward:5’-GAAGTCGCTGATGAGAACGTAACC-3’

Reverse:5’-GCTAGCTAGTGTGAGTTCTTCCGC-3’。

第二、一种辅助选择雄穗分枝较少玉米的方法，步骤如下：提取待测玉米的基因组DNA；用引物umc2177和umc1378进行PCR扩增；当得到长度为234bp和331bp的扩增产物，则待测玉米为雄穗分枝较少的玉米。

第三、调控玉米雄穗分枝数主效QTL的分子标记在玉米育种中的应用，其特征在于：用本发明提供的辅助选择雄穗分枝较少玉米的方法鉴定出候选雄穗分枝较少的玉米，再将候选雄穗分枝较小的玉米应用于玉米育种。

本发明通过对两套F_2:3家系的雄穗分枝数QTL进行分析，在多水分环境处理下发现在玉米第七染色体Bin7.00区域的umc2177和umc1378标记之间存在一个调控玉米雄穗分枝数的主效QTL，发明人将该主效QTL命名为qTBN-Ch.7-1。在多个水分环境处理下，该qTBN-Ch.7-1在两套F_2:3家系的累积表型贡献率分别为46.01％和34.09％。分析表明利用这两对SSR标记对待测玉米进行PCR扩增，可以对待测玉米的雄穗大小进行预测。

本发明的有益效果在于：通过本发明公布的分子标记进行分子标记辅助选择，只需检测分子标记的特征扩增条带，即可预测玉米雄穗大小，此鉴定方法易于操作、简单可行、选择效率高。可在玉米生育早期鉴定出雄穗较小的玉米单株，淘汰其它单株，选择目标明确，且不受环境影响，有效提高候选玉米的育种利用价值。

附图说明

图1 LTpop雄穗分枝数的频率分布图；

图2 CTpop雄穗分枝数的频率分布图；

图3 LTpop遗传连锁图谱及雄穗分枝数主效QTL定位示意图；

图4 CTpop遗传连锁图谱及雄穗分枝数主效QTL定位示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。

本实施例中，获得调控玉米雄穗分枝数主效QTL的分子标记的详细步骤如下：

1.玉米F_2:3群体构建及不同水分环境处理下雄穗分枝数的测定

以本课题组前期筛选获得的雄穗分枝数及抗旱性差异较大的3份自交系为亲本构建了两套F₂分离群体，F₂分离群体自交获得F_2:3家系。其中廊黄/昌7-2为雄穗分枝数少且强耐旱自交系作为母本，TS141为雄穗分枝数多且旱敏感自交系作为共同父本。廊黄与TS141构建的F_2:3家系简称为LTpop，其包含202个株系；昌7-2与TS141构建的F_2:3家系简称为CTpop，其包含218个株系。2014年于武威(37.97°N，102.63°E；1508m)和张掖(38.83°N，106.93°E；1536m)种植LTpop及相应亲本。2015年于古浪(36.67°N，102.85°E；1785m)和景泰(37.18°N，104.03°E；1640m)种植CTpop及相应亲本。两套F_2:3家系在四个试验点都分别进行干旱胁迫处理和正常供水处理，采用平膜滴灌技术，按完全随机区组设计，三次重复，双行区，行长6.0m，株距0.5m，行距0.6m。干旱胁迫处理是在大喇叭口期前到花期结束进行不灌水，其它时期每隔20d灌水一次。正常供水处理是在玉米生长过程中缺水时及时灌水。

在不同水分环境处理下，分别选择两套F_2:3家系中长势整体一致单株10株，待花期结束时测定每一单株的雄穗分枝数(tassel branch number，TBN；TBN为雄穗一级分枝数)，然后取其平均值代表每一株系的雄穗大小。根据公式：

计算广义遗传力(H²)，式中：为基因型方差，为基因型与环境互作方差，为误差，n为环境个数，r为重复数。2套F_2:3家系雄穗分枝数鉴定结果见表1。所得LTpop雄穗分枝数的频率分布图见图1所示；所得CTpop雄穗分枝数的频率分布图见图2所示。

表1两套F_2:3家系雄穗分枝数测定值

Table 1The value of tassel branch number(TBN)in two F_2:3populations,respectively

表中字符说明：W-W、S-W、W-Z、S-Z、W-G、S-G、W-J、S-J分别为武威正常供水处理、武威干旱胁迫处理、张掖正常供水处理、张掖干旱胁迫处理、古浪正常供水处理、古浪干旱胁迫处理、景泰正常供水处理、景泰干旱胁迫处理；以下同。

由表1可知：同一水分环境处理下，母本廊黄/昌7-2与父本TS141的雄穗分枝数差异显著；干旱胁迫处理下，3份自交系的雄穗分枝数都呈降低趋势，但旱敏感自交系TS141的雄穗分枝数降低程度远远高于强耐旱自交系廊黄/昌7-2。

由表1、图1和图2可知：不同水分环境处理下，构建的两套F_2:3家系的雄穗分枝数呈典型的正态分布，且雄穗分枝数的广义遗传力较大为78.69％和84.26％，表明雄穗分枝数是受多基因控制的数量性状，且受遗传本质影响较大，对其进行QTL分析是可行的。

2.SSR标记设计及其多态性筛选

在玉米基因组数据库MaizeGDB网站(http://www.maizegdb.org/)选择均匀分布于玉米10条染色体的SSR标记872对，上海Sangon合成。采用CTAB法提取亲本廊黄、昌7-2、TS141基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用德国IMPLEN微量分光光度仪检测DNA浓度。PCR反应体系见表2，PCR扩增反应程序见表3，扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染。

经分析，在亲本廊黄与TS141间筛选出213对条带清晰、多态性好的SSR标记，在亲本昌7-2与TS141间筛选出217对条带清晰、多态性好的SSR标记。这些多态性SSR标记将用于两套F₂分离群体基因型分析，并进入步骤3构建相应的遗传连锁图谱。

表2PCR反应体系

Table 1The PCR reaction system

表3PCR扩增反应程序

Table 2The PCR amplification reaction process

3.遗传连锁图谱构建

利用步骤1构建的两套F₂分离群体及步骤2筛选出的相应的多态性SSR标记，对两套相应的F₂分离群体进行基因型分析，并采用JoinMap4.0软件(http://www.kyazma.nl/index.php/mc.JoinMap/sc.Evaluate/)构建遗传连锁图谱，利用Kosambi函数计算遗传距离(centimorgan，cM)。所得LTpop的遗传连锁图谱见图3；所得CTpop的遗传连锁图谱见图4。

由图2和图3可知：构建的两套遗传连锁图谱分别各包含199和205对SSR标记，覆盖了玉米的10个连锁群，总遗传距离为1542.5cM和1648.8cM，分子标记间平均遗传距离为7.8cM和8.0cM。两套遗传图谱与IBM2 2008Neighbors(http://www.maizegdb.org/data_center/map)相比，标记在参考图谱上的相对顺序高度一致。

4.雄穗分枝数主效QTL定位

根据两套F_2:3家系在不同水分环境处理下的雄穗分枝数表型值，采用Windows QTL Cartographer version 2.5软件(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLcart.htm)中的复合区间作图法(composite interval mapping，CIM)检测相应的F_2:3家系的雄穗分枝数QTL。就CIM而言，采用Zmapqtl程序模块Model 6,窗口大小为10.0cM，每隔0.5cM对雄穗分枝数进行基因型扫描，通过1000次抽样确定LOD阈值(LOD>3.0)。根据显性效应(D)与加性效应(A)之比的绝对值来估计QTL作用方式(Stuberet al.1987)：|D/A|＝0.00～0.20为加性(A)，|D/A|＝0.21～0.80为部分显性(PD)，|D/A|＝0.81～1.20为显性(D)，|D/A|>1.20为超显性(OD)。QTL命名参照McCouch et al.(1997)的命名方法，即q+性状名称缩写+染色体名称+QTL在染色体上序号。采用Patentin version 3.5软件生成主效雄穗分枝数QTL两端SSR标记序列表；主效雄穗分枝数QTL两端SSR标记序列表在说明书末尾。所得LTpop雄穗分枝数主效QTL定位示意图见图3；所得CTpop雄穗分枝数主效QTL定位示意图见图4。两套F_2:3家系雄穗分枝数主效QTL检测结果见表4。

表4两套F_2:3家系雄穗分枝数QTL检测

Table 4The QTL analysis for tassel branch number(TBN)in two F_2:3populations,respectively

经CIM分析表明，由表4、图3和图4可知，两套F_2:3家系在多个水分环境下同时检测到了一个调控雄穗分枝数的主效QTL为命名为qTBN-Ch.7-1，其位于第七染色体Bin 7.00处，介于标记umc2177与umc1378之间，基因的作用方式以超显性效应为主，减小雄穗分枝数的等位基因均来源于亲本廊黄/昌7-2。在LTpop中该QTL在2个干旱胁迫处理下及1个正常供水处理下被同时检测到，其累积表型贡献率为46.01％，遗传距离为19.7cM。在CTpop中该QTL在2个干旱胁迫处理下及1个正常供水处理下被同时检测到，其累积表型贡献率为34.19％，遗传距离为0.6cM。表明qTBN-Ch.7-1为调控玉米雄穗分枝数的主效QTL，且与抗旱性密切相关，该QTL减少雄穗分枝数的等位基因来源于亲本廊黄/昌7-2，因此可用于对玉米雄穗大小进行预测，但由于该QTL的基因作用方式为超显性，因此在组配杂交种时要特别注意杂种优势对雄穗大小的影响。

上述调控玉米雄穗分枝数主效QTL的分子标记，由umc2177和umc1378两对SSR标记组成，其中标记umc2177的序列为：

Forward:5’-ACCATGCATGTCTCACGTCACT-3’

Reverse:5’-GGGTACGTGCTGTGGAGGAC-3’

所述引物umc1378的序列为：

Forward:5’-GAAGTCGCTGATGAGAACGTAACC-3’

Reverse:5’-GCTAGCTAGTGTGAGTTCTTCCGC-3’

利用上述调控玉米雄穗分枝数主效QTL的分子标记辅助选择雄穗分枝较少玉米的方法包括：提取待测玉米基因组DNA，用标记umc2177和umc1378进行PCR扩增，当得到长度为234bp和331bp的扩增产物，则待测玉米为候选雄穗分枝数较小的玉米单株，淘汰其它单株，有目的的组配杂交组合，选育出雄穗大小适中、高产玉米新品种，进而应用于生产实践中。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 甘肃农业大学

<120> 调控玉米雄穗分枝数主效QTL的分子标记及其应用

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 玉米属玉米（Zea mays L.)

<400> 1

accatgcatg tctcacgtca ct 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 玉米属玉米（Zea mays L.）

<400> 2

gggtacgtgc tgtggaggac 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 玉米属玉米（Zea mays L.）

<400> 3

gaagtcgctg atgagaacgt aacc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 玉米属玉米（Zea mays L.）

<400> 4

gctagctagt gtgagttctt ccgc 24

1