一种烯键还原酶及其制备方法和应用与流程

技术特征：

1.一种烯键还原酶基因，其特征在于：其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的烯键还原酶基因编码的烯键还原酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.包含如权利要求1所述的烯键还原酶基因的烯键还原酶重组表达载体。

4.一种烯键还原酶重组表达转化体，其特征在于：其包含如权利要求1所述的烯键还原酶基因、或如权利要求3所述的烯键还原酶重组表达载体。

5.如权利要求4所述的烯键还原酶重组表达转化体，其特征在于：

所述的烯键还原酶重组表达转化体由下述方法制得：通过引物，以紫红色红球菌Rhodococcus rhodochrousATCC 17895的全基因组为模板，经聚合酶链式反应进行基因扩增，得碱基序列如SEQ ID No.1所示的烯键还原酶基因，之后将烯键还原酶基因连接于载体上得包含SEQ ID No.1所示的烯键还原酶基因的重组表达载体；将所得烯键还原酶重组表达载体转化至宿主微生物中制得的异源表达菌株，即获得烯键还原酶重组表达转化体。

6.如权利要求5所述的烯键还原酶重组表达转化体，其特征在于：所述的引物为：

上游引物为GGAATTCCATATGGTTGCAGTAAAGCCTT，

下游引物为CCCAAGCTTTTACGCCTTGGTATCAATAG；

所述的宿主微生物为大肠杆菌；

所述的载体为质粒pET28a(+)。

7.一种重组烯键还原酶的制备方法，其特征在于，通过培养如权利要求4～6任一所述的烯键还原酶重组表达转化体，获得重组烯键还原酶。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，

将如权利要求4～6任一所述的烯键还原酶重组表达转化体接种至含卡那霉素的LB培养基中培养；

当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5-0.6，在终浓度为0.1-1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，即得高效表达的重组烯键还原酶。

9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，

所述的LB培养基包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0；

所述诱导的时间优选20-30℃，所述诱导的时间优选15-25h。

10.如权利要求2所述的烯键还原酶或权利要求7～8所制备的重组烯键还原酶在不对称还原α,β-不饱和化合物中C＝C双键中的应用，其特征在于，

所述α述征在不饱和化合物的结构式如式(I)或式(II)所示

其中，M为CR¹R²、NR³；

Q为C＝O、CR⁴R⁵；

R为氢、烷基或硝基；当R为硝基时，Q为CH₂；

n为0、1、2；

R¹、R²各自独立地为氢或烷基；

R³为取代或非取代的芳基；

R⁴和R⁵各自独立地为氢或烷基；

R⁶为取代或非取代烷基、烯基；

R⁷为氢或烷基。

11.如权利要求9所述的应用，其特征在于：在辅酶NADH的存在下，在所述的烯键还原酶或在重组烯键还原酶的作用下，将作为底物的α,β-不饱和化合物进行不对称还原反应，制得具有光学活性的带吸电子基团的化合物；

R为氢、C_1-4烷基或硝基；当R为硝基时，Q为CH₂；

n为0、1、2；

R¹、R²各自独立地为氢或C_1-4烷基；

R³为取代或非取代C_6-12芳基；

R⁴和R⁵各自独立地为氢或C_1-4烷基；

R⁶为取代或非取代C_1-4烷基、C_2-4烯基；

R⁷为氢或C_1-4烷基。

12.如权利要求9所述的应用，其特征在于：α,β-不饱和化合物的浓度为1-15mmol/L；所述的还原酶或重组酶的用量为80-400μg/L；辅酶NADH的用量为10-15mmol/L；所述的磷酸盐缓冲液浓度为50mmol/L，pH为5-9；所述的不对称还原反应的温度为20-40℃。

13.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的α,β-不饱和化合物的浓度为10mmol/L；所述的还原酶或重组酶的用量为400μg/L；辅酶NADH的用量为12.5mmol/L；所述的磷酸盐缓冲液浓度为50mmol/L，pH为7.0；所述的不对称还原反应的温度为30℃。