一种用于EBV‑CTL细胞的体外培养试剂盒的制作方法

本发明涉及临床应用研究及生物技术领域，具体的说是一种用于获得人外周血中单个核细胞诱导成EBV-CTL(nasopharyngeal carcinoma EB virus-CTL)的体外培养试剂盒。

背景技术：

据联合国卫生组织(WHO)的粗略估计，全世界的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)患者，约80％在中国，常见于中国南部，尤以广东地区发病率较高(20-50/100 000)，鼻咽癌是值得注意和重视的肿瘤。由于鼻咽癌发病部位的特殊性，周围有许多重要危及器官，无法进行根治性手术，因此放、化疗成为鼻咽癌的首选治疗方法。随着放、化疗技术的不断进步，鼻咽癌治疗的近期疗效显著提高。但局部复发和远处转移仍为鼻咽癌治疗失败的主要原因。因此有必要寻找一些新的治疗手段。

以肿瘤的免疫治疗为主的肿瘤生物治疗是目前临床治疗恶性肿瘤继手术、放、化疗之后的第4种模式，它既可以独立地治疗肿瘤，又可与手术及放、化疗结合，具有疗效高、特异性强、副作用小等优点，尤其对于中晚期已经发生转移的恶性肿瘤而言，它具有独到的治疗作用，近年来越来越受到人们的关注。基于肿瘤特异性抗原的免疫治疗可以启动以肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应为主的抗肿瘤效应，有效打击肿瘤，防止转移复发且不伤及无关组织。因其抗肿瘤特异性和免疫记忆性是其它方法所不能比拟的，故在肿瘤综合治疗中显示出很好的应用前景。随着对免疫应答机制的深入研究，人们已经意识到启动免疫应答程序的并不是整个抗原分子，而是与MHC分子结合的氨基酸短肽，即CTL表位，因此寻找特异性肿瘤抗原及其相应的CTL表位成为肿瘤免疫治疗的关键。

细胞毒T淋巴细胞(CTL)是目前研究较多的免疫活性细胞，用表达于肿瘤细胞表面的肿瘤抗原的CTL表位肽刺激机体，可以产生抗原特异性的CTL细胞，从而参与肿瘤免疫应答，其机理在于用CTL表位肽刺激机体后，可引起抗原特异性的CTL细胞的克隆增殖，而CD8+的CTL是目前认为抗肿瘤免疫的主要效应细胞，其向胞外释放穿孔素、细胞溶解素等物质或通过细胞表面的死亡受体(肿瘤坏死因子受体家族的成员，包括FAS)等溶解(即杀灭)靶细胞，同时亦可分泌IFN-γ等细胞因子间接杀伤肿瘤细胞，为杀伤肿瘤创造一个良好的微环境。体内的初始T淋巴细胞，经过肿瘤抗原刺激后可分化为效应性T细胞即CTL细胞，杀伤肿瘤，其中一部分效应T淋巴细胞可分化为效应型记忆T淋巴细胞，这种记忆性T淋巴细胞对肿瘤相关性抗原再次刺激后可表现出强烈有效的免疫应答，从而发挥杀伤功效，这也是临床应用CTL抗原肽杀伤肿瘤的一个理论基础。因此应用基于肿瘤抗原的CTL表位肽直接诱导特异性CTL抗肿瘤应答，已经成为一种方便有效的方法。

鼻咽癌常见的病理类型是未分化非角化性癌，这一类型的鼻咽癌与EB病毒(Epstein—Barr virus EBV)的感染有关，NPC患者90％以上有EBV感染。因而，针对EBV特异性多克隆CTL研究成为目前的研究热点。Comoli等在Ⅰ期临床研究(入组10例鼻咽癌患者)中证实CTL治疗鼻咽癌的安全性。Straathof等报告用EBV特异性多克隆CTL治疗6例复发的鼻咽癌患者，2例完全缓解、2例部分缓解、1例稳定、1例进展，有5例患者治疗后外周血EBV拷贝数明显降低，患者在输注EBV特异性多克隆CTL后没有明显毒副作用。Comoli等用EBV特异性CTL治疗10例难治性鼻咽癌患者(Ⅳ期)，治疗后所有患者的外周血均检测出EBV特异性CTL，治疗结果：部分缓解(PR)2例、稳定(SD)4例、进展(PD)4例。

综上所述，用基于肿瘤抗原的CTL表位肽直接诱导EBV特异性CTL的方法，是有效并安全的。急需寻找EBV相应的CTL表位肽，建立高效的EBV-CTL细胞体外培养方法，同时也更有必要设计与之相符的规范的试剂盒来保证培养方法的及时、准确、顺利进行。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于处理人外周血中单个核细胞EBV-CTL(nasopharyngeal carcinoma EB virus-CTL)体外培养的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种用于EBV-CTL细胞的体外培养试剂盒，包括以下组分：

诱导CTL细胞分化的EBV抗原肽包被瓶；

诱导T细胞分化的包被瓶；

使T细胞携带相关抗原刺激EBV-CTL细胞增殖的因子；

和，刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子。

所述体外培养试剂盒包括无血清培养基、分选细胞的细胞分选液和防止细胞聚集的细胞分散剂，防止细胞聚集的细胞分散剂为20％的人血清白蛋白。

所述诱导CTL细胞分化的包被瓶为经EBV抗原肽、CD137单克隆抗体、γ干扰素、白细胞介素15包被的包被瓶；

所述诱导T细胞分化的包被瓶为经抗CD3单克隆抗体、植物凝集素、白细胞介素21包被的包被瓶。

所述诱导CTL细胞分化的包被瓶为将EBV抗原肽、CD137单克隆抗体、γ干扰素、白细胞介素15充分溶解于磷酸盐缓冲液中得混合包被溶液，将所得包被溶液浸润整个培养瓶的底面；浸润后于4℃静置12-24小时，而后将经EBV抗原肽、CD137单克隆抗体、γ干扰素、白细胞介素15包被的培养瓶于冻干机器内启动冷冻干燥机的压缩机，使机器腔室内的温度降至-40℃，将初始CTL1包被瓶瓶口拧松，放入干燥室；开启真空泵，使压力达到＜1000Pa，抽干开始；自动运行5小时后，打开CO₂进气阀，关闭真空泵；待压力到110K后关闭CO₂进气阀，取出包被瓶，拧紧盖子，封好口，4℃保存；在规定的保质期内使用。其中，混合包被溶液中EBV抗原肽浓度为120-135ng/mL、CD137单克隆抗体浓度为80-90ng/mL、γ干扰素浓度为0.2-0.25万单位/mL、白细胞介素15浓度为40-45ng/mL；

所述诱导T细胞分化的包被瓶为将抗CD3单克隆抗体、植物凝集素、白细胞介素21充分溶解于磷酸盐缓冲液中得混合包被溶液，将所得包被溶液浸润整个培养瓶的底面。浸润后于4℃静置12-24小时，而后将经包被抗CD3单克隆抗体、植物凝集素、白细胞介素21的培养瓶于冻干机启动冷冻干燥机的压缩机，使机器腔室内的温度降至-40℃，将初始CTL2包被瓶瓶口拧松，放入干燥室；开启真空泵，使压力达到＜1000Pa，抽干开始；自动运行5小时后，打开CO₂进气阀，关闭真空泵；待压力到110K后关闭CO₂进气阀，取出包被瓶，拧紧盖子，封好口，4℃保存；在规定的保质期内使用。其中，混合包被溶液中抗CD3单克隆抗体浓度为200-220ng/mL、植物凝集素浓度为40-45μg/mL、白细胞介素21浓度为100-110ng/mL。

所述刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子为刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子1、细胞因子2和细胞因子4，其中，细胞因子1的成分为50万单位的IL-2，细胞因子2的成分为50万单位的IL-2，细胞因子4的成分为200万单位的IL-2；使T细胞携带相关抗原刺激细胞增殖因子为使T细胞携带相关抗原刺激EBV-CTL细胞增殖和成熟的细胞因子3，其中，细胞因子3为60ng的EBV抗原肽。

所述细胞因子1的使用浓度为0.35万单位/mL，细胞因子2的使用浓度为0.14万单位/mL，细胞因子3的使用浓度为3ng/ml，细胞因子4的使用浓度为0.13万单位/mL。

一种利用所述用于EBV-CTL细胞的体外培养试剂盒进行体外培养的方法，用于处理样品的外周血样品中的单个核细胞，诱导纯化获得EBV-CTL细胞克隆，并在体外进行大量扩增。

具体，将待培养细胞于所述试剂盒内细胞分选液内对T淋巴细胞进行定向分选：而后对CTL细胞及T淋巴细胞进行诱导、分化、培养；培养后经试剂盒内细胞因子而后对CTL细胞及T淋巴细胞进行扩增，扩增后再对特异性EBV-CTL细胞进行扩增，进而实现EBV-CTL细胞的体外培养。

具体操作步骤如下：

第一步、对T淋巴细胞进行定向分选：

将待检测血样按1：1的体积比缓慢注入试剂盒细胞分选液上，并离心处理；用移液管吸出分选后的第一层液体即血浆层，移入50mL离心管灭活备用，吸取第二层细胞即环状乳白色淋巴细胞于新的离心管中；向新收集的细胞中补加生理盐水，离心处理后弃上清；重复洗两次；

第二步、同时对CTL细胞及T淋巴细胞进行诱导、分化、培养：

取11mL无血清细胞培养基重悬第一步所得细胞，此为A管。从A管中取出1mL至一支新的50ml离心管中，并补加无血清细胞培养基至10mL，此为B管。

取用于诱导CTL细胞分化的“CTL1”包被瓶一个，所述包被瓶是预先包被了EBV抗原肽、CD137单克隆抗体、γ干扰素、白细胞介素15的细胞培养瓶，用生理盐水或培养基润洗一次并弃去，加入第一步分离所得血浆层的血浆1mL；将A管内细胞悬液移入CTL1瓶内；而后将包被瓶放入5％CO₂、37℃的培养箱中培养24h；

取用于诱导T细胞分化的“CTL2”包被瓶一个，所述包被瓶中预先包被了抗CD3单克隆抗体、植物凝集素、白细胞介素21；用生理盐水或培养基润洗一次并弃去，加入第一步分离所得血浆层的血浆1mL；将B管内细胞悬液移入CTL2瓶内；而后将包被瓶放入5％CO₂、37℃的培养箱中培养24h；

第三步、同时对CTL细胞及T淋巴细胞进行扩增：

用1mL无血清培养基溶解一支细胞因子1，即50万单位的白细胞介素-2，向“CTL1”中加入700μL，向“CTL2”中加入300μL；向“CTL1”瓶内添加无血清培养基至100mL，向“CTL2”瓶内添加无血清培养基至50mL，于5％CO₂，37℃培养箱中培养5-6天后，用1mL无血清培养基溶解一支细胞因子2，即50万单位的白细胞介素-2，向“CTL1”中加入700μL，向“CTL2”中加入300μL；向“CTL1”瓶内添加无血清培养基至250mL，向“CTL2”瓶内添加无血清培养基至250mL；再于5％CO₂，37℃培养箱中继续培养3-4天，

第四步、对特异性EBV-CTL细胞进行扩增：

用移液管吹下“CTL2”瓶内贴壁细胞，离心后弃去上清，用无血清培养基混匀后加入细胞因子3，即60ng的EBV抗原肽，于室温孵育1小时；孵育后离心，离心后弃去上清，无血清培养基混匀待用；用移液管吹下“CTL1”瓶内的贴壁细胞，向其中加入细胞因子4，即200万单位的白细胞介素-2，加入包被瓶中，同时加入10-12mL第一步分离所得血浆层的血浆，将培养瓶中的细胞培养液倒入培养袋中；将“CTL2”瓶中孵育后的细胞倒入培养袋中；用新鲜无血清培养基润洗“CTL1”包被瓶及载有“CTL2”瓶中孵育后细胞的离心管两次，将润洗无血清培养基一并倒入培养袋中，补加培养基至1500ml，将培养袋放入5％CO₂，37℃培养箱中培养；第二天，进行检菌。

EBV抗原肽是人工抗原多肽片段，即细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位肽，是抗原蛋白中经抗原提呈细胞(APCS)处理后，能与MHC-I类分子结合并共同被T细胞抗原受体(TCR)特异性识别从而诱导相应的CTL克隆产生免疫应答的短肽，在CTL活化过程中起着十分关键的作用，决定了CTL的特异性杀伤效应。

CD137(4-1BB)是肿瘤坏死因子受体(Tumonecrosis Factor Receptor，TNFR)超家族的新成员，是存在于细胞表面的II型膜蛋白，由255个氨基酸组成。与其配体CD137L(4-1BBL)结合后介导的共刺激信号，在细胞间相互作用、细胞粘附、抗原递呈、T细胞共刺激以及信号传导中起不同的作用，可促进T细胞和NK细胞增殖、细胞因子的分泌等。CD137单抗能协同CD3单抗诱导CD8+T、CD4+T细胞的活化，显著增强CTL特异性反应。

白细胞介素15(interleukin15,IL-15)是由多种细胞分泌的细胞因子，其本身就是一种潜在的免疫治疗方法，具有一定的抗肿瘤作用。该细胞因子能维持IL-2依赖细胞系CTL细胞的增殖,此外还具有调节B细胞、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能,诱导淋巴细胞产生IFN-γ及TNF-α的作用,诱导免疫球蛋白的分泌,具有抗肿瘤活性,对DNA疫苗亦有较好的免疫增强作用等。研究还表明,IL-15在抗微生物感染和免疫佐剂等方面表现出巨大的应用前景。

γ-干扰素是由CD4⁺或CD8⁺细胞产生的同源二聚体糖蛋白，可通过多种途径直接或间接发挥抗肿瘤作用，增强自然杀伤细胞、巨噬细胞以及细胞毒性T细胞的活性。γ-干扰素加入的顺序与细胞毒活性密切相关，先加入γ-干扰素后加入白细胞介素-2可提高细胞毒活性。这是因为先加入γ-干扰素可促使外周血单核细胞上白细胞介素-2受体数量增加，从而有效地激活了效应细胞。

抗CD3抗体或抗T细胞受体抗体能模拟生理配体体外激活静止的T细胞，使之大量增殖，表达白细胞介素-2受体，产生内源性白细胞介素-2。抗CD3单抗具有抗肿瘤转移的作用，抗体抑制恶性肿瘤的生长可能是免疫增强的效果，抗体使抗肿瘤特异性T细胞数量增多，活性增强，同时内源性细胞因子的诱导放大了这种作用。

植物血凝素(Phytohaemagglutinin,PHA)是一种T细胞的多克隆活化剂，它与T细胞表面识别丝裂原的膜分子结合，可直接使原处于静止期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而分裂增殖，释放淋巴因子，并能提高巨噬细胞的吞噬功能。作为干扰素诱导剂可以刺激机体产生白介素-2和干扰素，还可以刺激机体产生非特异性抗体。

白细胞介素21(interlekin21，IL-21)是Ⅰ类细胞因子，由活化的CD4+T细胞、NKT等细胞分泌，属于γc家族，与IL-2、IL-4、IL-15具有较高的同源性。IL-21是免疫调控网络中的重要细胞因子，具有广泛的免疫调节功能，可以增强淋巴细胞的细胞毒性，刺激有机体产生INF-γ，调控B细胞的增殖、分化。众多的研究发现，IL-21可有效地用于抗肿瘤治疗。

白细胞介素-2是T淋巴细胞分泌的一种细胞因子(由133个氨基酸组成的多肽，相对分子质量约为15×10³)。它是人体免疫应答的核心物质，具有免疫增强、抗肿瘤和抗感染等作用。临床上已用于肾癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肠癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、白血病及癌性胸腹水等病症的治疗。与放疗、化疗比较，白细胞介素-2对正常细胞毒副作用轻微，能减轻肿瘤患者的疼痛，提高患者生活质量。此外结核病、肝炎、艾滋病、性病、成瘾性吸毒者及其他免疫功能低下患者均可使用白细胞介素-2。

EBV-CTL细胞是由人工抗原刺激诱导，T细胞携带人工抗原进一步诱导催化，培养的一群异质细胞群，单独用人工抗原刺激诱导对EBV-CTL细胞的增殖及特异性作用小。结合人工抗原的T细胞能有效刺激CTL细胞中的EBV-CTL细胞，使EBV-CTL细胞快速增值，增强其特异性，促进特异性EBV-CTL细胞成熟。使其向胞外释放穿孔素、细胞溶解素等物质，分泌IFN-γ等细胞因子。

本发明具有的优点及积极效果是：本发明的培养方式，避免了传统以DC细胞作为抗原提呈细胞培养时间长、费用高昂的弊端。本发明将细胞分为两部分，一部分以抗原的多肽片段诱导CTL细胞，另一部分作为T细胞进行诱导分化，两部分同时进行，有效地缩短了培养时间。用人工抗原多肽片段孵育T细胞后，混合培养，进一步刺激CTL细胞，诱导EBV-CTL细胞大量分化增殖、缩短成熟时间，增强EBV-CTL细胞特异性。通过本发明培养方式诱导特异性EBV-CTL细胞分化是极有效、安全、经济的方式。同时，以多种细胞因子预先包被细胞培养瓶的方法诱导CTL和T细胞分化，不但增加了CTL细胞与多肽片段接触的面积和时间，使之更容易受到多肽片段刺激而被诱导为EBV-CTL细胞，增加了T细胞与细胞因子接触的面积和时间，使之更容易受到细胞因子刺激而迅速被诱导分化，而且多种细胞因子协同作用于诱导CTL和T细胞分化可有效提高细胞毒杀伤作用及增强细胞增殖效果，有助于特异性CTL细胞扩增。另外，本发明采用了抽干的方法制备因子包被瓶，可高效保证细胞因子的活性。如果这种方法应用于产业化生产，既可以延长包被瓶的保质期，又降低了对运输条件的要求，是一种适用于实际生产的优良方法。

另外，本发明试剂盒采用无血清培养基，无血清培养基可达到生物洁净要求，成分明确，质量稳定，便于质控，克服了人AB血清的缺点，能减少病人意外感染的机会，对于免疫治疗的推广应用有重要意义。与其他方法相比，该试剂盒具有操作简便、细胞生长快、诱导效率高、杀伤性强、成本低廉、易于规模化生产等突出优势，可以应用于EBV病毒感染的癌症治疗的基础研究及临床应用研究。该试剂盒将EBV-CTL细胞体外定向分选、诱导、分化、培养、扩增所需要的复杂试剂和耗材规范的组合在一起并制定了使用说明书，全部操作按照说明书进行，操作规范化、模式化，不仅提高了工作效率，而且降低了人员间操作带来的细胞质量和产量差异。该试剂盒制备简单，细胞产率高，活性强，适于工业化生产，开辟了新的过继性细胞的制备方法，同时也将加速免疫医学的发展。该试剂盒一旦应用于临床细胞生物治疗，可以有效杀伤肿瘤细胞，提高肿瘤患者生活质量并延长患者生命，对临床具有极其重要的意义。对于医院和实验室，使用该试剂盒，增加细胞培养的成功率、缩短培养时间、节省成本。使用本发明试剂盒处理人外周血样品中的单个核细胞，可以收获的CTL细胞总数可达到3×10^-8个以上，具有特异性杀伤作用的CD8⁺阳性CTL细胞数达到1.5×10⁷个以上。

附图说明

图1是人外周血经本发明试剂盒处理后所获得培养5天的40倍镜下CTL细胞实拍图；

图2是人外周血经本发明试剂盒处理后所获得培养5天的40倍镜下T细胞实拍图；

图3是人外周血经本发明试剂盒处理后所获得培养7天的40倍镜下CTL细胞实拍图；

图4是人外周血经本发明试剂盒处理后所获得培养7天的40倍镜下T细胞实拍图；

图5是人外周血经本发明试剂盒处理后所获得培养9天的40倍镜下CTL细胞实拍图；

图6是人外周血经本发明试剂盒处理后所获得培养9天的40倍镜下T细胞实拍图；

图7是人外周血经本发明试剂盒处理后所获得培养10天的25倍镜下CTL细胞实拍图；

图8是人外周血经本发明试剂盒处理后所获得培养10天的40倍镜下CTL细胞实拍图；

图9是人外周血经本发明试剂盒处理后所获得培养10天的25倍镜下T细胞实拍图；

图10是人外周血经本发明试剂盒处理后所获得培养10天的40倍镜下T细胞实拍图；

图11是人的外周血经本发明试剂盒处理后获得的CTL细胞，经流式细胞仪测定反馈出的可与CTL四聚体A2-1结合的CD8⁺CTL细胞散点图；其中，CTL四聚体-PE，CD8-PC5，根据CTL四聚体和CD8抗体将CD8⁺细胞分成四部分，右上方是CTL四聚体CD8⁺双阳细胞；右下方是CD8⁺单阳细胞；左下方是CD8^-阴性细胞；左上方是CTL四聚体单阳细胞；

图12是人的外周血经本发明试剂盒处理后获得的CTL细胞，经流式细胞仪测定反馈出的可与CTL四聚体A2-2结合的CD8⁺CTL细胞散点图；其中，CTL四聚体-PE，CD8-PC5，根据CTL四聚体和CD8抗体将CD8⁺细胞分成四部分，右上方是CTL四聚体CD8⁺双阳细胞；右下方是CD8⁺单阳细胞；左下方是CD8^-阴性细胞；左上方是CTL四聚体单阳细胞；

图13人的外周血经本发明试剂盒处理后获得的CTL细胞，经流式细胞仪测定反馈出的可与CTL四聚体A2-3结合的CD8⁺CTL细胞散点图；其中，CTL四聚体-PE，CD8-PC5，根据CTL四聚体和CD8抗体将CD8⁺细胞分成四部分，右上方是CTL四聚体CD8⁺双阳细胞；右下方是CD8⁺单阳细胞；左下方是CD8^-阴性细胞；左上方是CTL四聚体单阳细胞。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步描述。

本发明试剂盒将人的外周血样品中的单个核细胞诱导为EBV-CTL细胞的体外培养试剂盒，包括对T淋巴细胞进行定向分选、诱导、分化、培养、扩增，从根本上解决现有CTL细胞的体外培养方法存在的以DC细胞作为抗原提呈细胞培养时间长、成本高、目的细胞与抗原提成细胞培养时间不同步、使用材料、培养时间不一致，有效细胞的培养周期、细胞特异性杀伤效果和数量参差不齐的问题。试剂盒包括用于诱导CTL细胞分化的包被瓶，包被瓶中预先包被了EBV抗原肽、CD137单克隆抗体、γ干扰素、白细胞介素15；用于诱导T细胞分化的包被瓶，包被瓶中预先包被了抗CD3单克隆抗体、植物凝集素、白细胞介素21；用于刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子1、细胞因子2、细胞因子4，用于使T细胞携带相关抗原刺激EBV-CTL细胞增殖、成熟的细胞因子3，所述细胞因子1的成分为50万单位的IL-2，所述细胞因子2的成分为50万单位的IL-2，所述细胞因子3的成分为60ng的EBV抗原肽，所述细胞因子4的成分为200万单位的IL-2。

实施例1

本发明所述试剂盒是为CTL细胞体外培养方法准备的规范的、标准化仪器，以下对试剂盒内容物进行详细介绍：

该试剂盒内容物中包括：用于盛装液体的无菌离心管，10×15mL/个，17×50mL/个，6×250mL/个；用于吸放液体的无菌移液管，14×10ml/支；用于分选细胞的细胞分选液，10×5mL/支；用于诱导培养CTL细胞分化的EBV抗原肽包被瓶“CTL1”，1×175cm²/个；用于诱导培养T细胞分化的包被瓶“CTL2”，1×175cm²/个；用于为细胞提供生长所需营养的无血清培养基，2×1000mL/瓶；用于作为培养细胞容器的无菌细胞培养袋，1×2000mL/个；用于刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子1，即IL-2，1×50万IU/支；用于刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子2，即IL-2，1×50万IU/支；用于和T细胞结合的细胞因子3，即EBV抗原肽，1×60ng/支；用于刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子4，即IL-2，2×100万IU/支；用于检菌的双向血培养瓶，4个；用于防止细胞聚集的细胞分散剂，10×1mL/支；用于过滤细胞团的无菌过滤网，6个；用于盛装细胞悬液的无菌回输袋，6×200mL/个；用于标注回输信息的标签，6个。

本发明所述试剂盒内容物的制备及来源如下：

1.包被瓶的制备

(1)CTL1包被瓶的制备方法为：取10mL磷酸盐缓冲液溶解EBV抗原肽、CD137单克隆抗体、γ干扰素、白细胞介素15获得混合包被溶液，充分混匀，所得混合包被溶液中EBV抗原肽浓度为120ng/mL、CD137单克隆抗体浓度为80ng/mL、γ干扰素浓度为0.2万单位/mL、白细胞介素15浓度为40ng/mL；将获得混合包被溶液移入175cm²培养瓶中，摇匀，使包被液浸润整个培养瓶的培养面。4℃静置至少12小时，制成初始CTL1包被瓶；启动冷冻干燥机的压缩机，使机器腔室内的温度降至-40℃，将初始CTL1包被瓶瓶口拧松，放入干燥室；开启真空泵，使压力达到＜1000Pa，抽干开始；自动运行5小时后，打开CO₂进气阀，关闭真空泵；待压力到110K后关闭CO₂进气阀，取出CTL1细胞包被瓶，拧紧盖子，封好口，4℃保存；在规定的保质期内使用。

⑵CTL2包被瓶的制备方法为：取10mL磷酸盐缓冲液溶解抗CD3单克隆抗体、植物凝集素、白细胞介素21获得混合包被溶液，充分混匀；所得混合包被溶液中抗CD3单克隆抗体浓度为200ng/mL、植物凝集素浓度为40μg/mL、白细胞介素21浓度为100ng/mL，将该溶液移入175cm²培养瓶中，使包被液浸润整个培养瓶的培养面。4℃静置至少12小时，制成初始CTL2包被瓶；启动冷冻干燥机的压缩机，使机器腔室内的温度降至-40℃，将初始CTL2包被瓶瓶口拧松，放入干燥室；开启真空泵，使压力达到＜1000Pa，抽干开始；自动运行5小时后，打开CO₂进气阀，关闭真空泵；待压力到110K后关闭CO₂进气阀，取出CTL2细胞包被瓶，拧紧盖子，封好口，4℃保存；在规定的保质期内使用。

2.细胞分选液的制备

将CTL细胞分选液用无菌移液器分装到15mL离心管中，5mL/支。贴标签，4℃保存。

3.磷酸盐缓冲液购买于北京中杉金桥生物技术有限公司(2000mL/袋)；白细胞介素-2购买于北京双鹭药业股份有限公司(50万单位/支，100万单位/支)；EBV抗原肽，德国JPT公司(25μg/支)；抗CD3单克隆抗体购买于日本转基因公司(5mg/支)；γ-干扰素购买于山东泉港药业有限公司(100万单位/支)；CD137单克隆抗体购买于美国BIOLEGEND公司(100μg/支)；白细胞介素-15购买于美国Amoytop Biotech公司(100μg/支)；白细胞介素-21购买于美国Amoytop Biotech公司(100μg/支)；植物血球凝集素(PHA)购买于上海伊华公司(10mg/支)；T淋巴细胞分离液购买于SIGMA(500ml/瓶)；人血清白蛋白，购买于美国CSL Behring AG(10g/50mL/瓶)；无血清培养基购买于珠海贝索生物公司(1000mL/瓶)。离心管和移液管购买于美国康宁公司，培养袋购于NIPRO(SHANGHAI)Co.,Ltd。

本发明所述EBV-CTL细胞的体外培养试剂盒主要用于EBV-CTL细胞体外定向分选、诱导、分化、培养、扩增；主要应用于相应HLA分型的EBV感染的患者的临床细胞生物治疗，也可以应用于相关的基础医学研究、临床应用研究及生物技术研究。利用本发明试剂盒中内容物完成的具体培养方法如下：

实施例2

结合图1-10对本发明作详细描述。以人外周血为处理样品，使用本发明所述试剂盒中内容物分选诱导EBV-CTL细胞。具体操作步骤如下：一.血液处理

1.将50mL抗凝血注入1支50mL离心管中。

2.将血样缓慢注入细胞分选液上，每管6mL。

3.550xg，30min，4℃离心。

4.离心后的离心管中细胞由上至下分为四层。(第一层：血浆；第二层：环状乳白色淋巴细胞层；第三层：透明细胞分选液层；第四层：红细胞层。)收集第一层移入一支新的50mL离心管中，56℃灭活30min，即为自体血浆；收集第二层平均移入两支50mL新的离心管中，分别加入无血清细胞培养基ALyS505N至50mL，混匀。

5.将两管细胞离心，780xg，15min，4℃。

6.弃去上清，用无血清细胞培养基ALyS505N将两管细胞重悬后合为一管，补加无血清细胞培养基ALyS505N至50mL，离心，400xg，15min，4℃。

7.血浆灭活完成后，离心，2100xg，10min，4℃。

8.离心后的细胞弃去上清，移入11mL无血清细胞培养基ALyS505N充分混匀，此为A管。从A管中取出1mL至一支新的50ml离心管中，并补加无血清细胞培养基ALyS505N至10mL，此为B管。向两支离心管内各加入1mL上述血液处理过程中分离的第一层血浆。

9.将A管内细胞悬液移入CTL1瓶内，将B管内细胞悬液移入CTL2瓶内。

二.补液，加细胞因子1和2

1.血液处理第二天，取出培养物。向“CTL1”瓶内添加无血清细胞培养基ALyS505N至100mL，向“CTL2”瓶内添加细胞培养基至50mL。用1mL细胞培养基溶解一支50万IL-2，向“CTL1”中加入700μL，向“CTL2”中加入300μL。

2.血液处理第七天左右，分别向两瓶内添加细胞培养基至250mL。用1mL无血清细胞培养基ALyS505N溶解一支50万IL-2，向“CTL1”中加入700μL，向“CTL2”加入300μL。

三.转袋

1.血液处理第十天左右，镜下观察两瓶细胞均铺满瓶底并有部分细胞悬浮时，可进行转袋操作。(见图9-10)

2.用移液管吹下“CTL2”瓶内贴壁细胞，倒入5支50mL离心管中，离心，400xg，15min。

3.离心后弃去上清，用20mL细胞培养基混为一管，加入60ngEBV抗原肽，于室温孵育1小时。

4.孵育后，离心，400xg，10min；离心后弃去上清，加20mL无血清细胞培养基ALyS505N混匀，离心，400xg，15min。

5.离心后弃去上清，用50mL无血清细胞培养基ALyS505N混匀待用。

6.用移液管吹下“CTL1”瓶内的贴壁细胞，向其中加入200万IL-2，10-12mL上述血液处理过程中分离的第一层血浆。

7.取出细胞培养袋，标注好姓名、日期。取下细胞培养袋管帽、50ml注射器针头和内栓。将培养袋进液口与注射器头相连。移入“CTL1”瓶内细胞液，用适量新鲜无血清细胞培养基ALyS505N润洗培养瓶两次，润洗液也移入培养袋。

8.向培养袋内移入步骤5中的细胞液，并向培养袋内移入剩余的全部无血清细胞培养基ALyS505N。

9.夹紧进液口，除去注射器，盖好管帽。

四.检菌

1.转袋后第一天，取出培养物。将袋内细胞液混匀后倒出10mL于一支50mL离心管中，用20mL注射器吸取5mL细胞液注入两个双相血培养瓶中，一瓶送与第三方进行无菌检测，一瓶用于自检。检菌温度37℃。

2.双相血培养瓶上要注明姓名和日期。

五.细胞收集

1.血液处理第十七天左右，观察细胞生长情况，确定回输时间。

2.将袋内细胞液倒满1支250mL离心管中，离心，400×g，5min，4℃。剩余细胞继续培养。

3.离心后弃去上清，加100mL生理盐水混匀，离心，400×g，5min，4℃。重复此步骤2次。

4.取两支50mL离心管，用5mL注射器分别向其中注入20％的人血清白蛋白2mL。

5.将无菌筛网放到离心管上。

6.用移液管吸取混匀后的细胞悬液，用无菌筛网过滤。

7.取一个细胞收集袋，剪开管口，连接50mL注射器，倒入50mL离心管内的细胞，加生理盐水至150-200mL。

8.用止血钳夹住管口，热合机封口。粘贴已填写好的自体CTL标签。

在操作过程中应该注意以下几点：

1.将血液注入细胞分选液上时，应轻柔缓慢，切勿打破界面。

2.培养瓶放入培养箱内培养时，瓶盖要拧松；将培养瓶拿出培养箱时，瓶盖药拧紧。

3.每天观察细胞生长状况，发现培养袋中的细胞出现细胞集落时，轻揉培养袋打散集落。

4.操作过程要求在万级洁净实验室内的百级超净工作台内完成，以保证整个过程无菌。

5.培养瓶与培养袋应尽可能的水平放置。避免培养袋与培养箱内的不锈钢架发生摩擦，造成破损。

图1-10是该培养试剂盒培养过程中不同时期细胞培养的状态图片；取回输前的细胞悬液进行细胞计数，结果表明，50mL的外周血经本方法处理后，可收获细胞数约1×10^-9个。经本发明方法处理收获的细胞进行流式细胞仪检测，结果如图11-13所示。细胞群中CD8⁺的细胞约占全部回输细胞的56.1％(见图11-13)，其中特异性EBV-CTL约占全部回输细胞的39.0％(见图11-13)，由此可以看出，本发明方法培养CTL细胞，杀伤性CTL细胞和特异性EBV-CTL细胞回输总数均可达到3×10^-8个以上，具有较高的有效细胞收率。