适合稻曲病菌生长的培养基的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是涉及一种适于稻曲病菌培养的培养基。

背景技术：

水稻稻曲病菌有性态为Claviceps oryzae-sativae Hashioka，属于子囊菌门麦角菌科真菌，无性态为Ustilaginoidea virens(Cooke)Takahashi，异名：U.oryzae(Pat)Bref，属无性菌类绿核菌属，主要侵染水稻穗部引起的真菌病害。病理学研究发现，U.virens从小穗的外稃和内稃间隙入侵，形成大于谷粒的稻曲球且表面覆盖大量的黄色或墨绿色厚垣孢子，病粒中心为菌丝组织密集构成的白色肉质块，其外围因产生厚垣孢子的菌丝成熟度不同，可分为三层：外层最早成熟，呈墨绿色或橄榄绿色；第二层为橙黄色；第三层为黄色。稻曲病又称假黑穗病、绿黑穗病、青粉病、谷花病等。我国早在明朝李时珍《本草纲目》中便有指稻曲病菌子实体为“粳谷奴”的记载。

该病在亚洲、美洲和非洲的30多个国家及我国各稻区都有不同程度发生。一般穗发病率为4％～6％，严重达50％以上，粒发病率为0.2％～0.4％，高的可达5％以上。它不仅使秕谷率、青米率、碎米率增加，局部田块减产20％～30％，能产生对人和牲畜有剧毒作用的真菌毒素，而且当稻谷中含有0.5％病粒时能引起人，畜中毒。自20世纪70年代以来，由于水稻品种的变化、耕作制度的改变和化学肥料的大量使用，以及杂交水稻的问世等因素，稻曲病的发生及危害呈加重趋势，已成为中国及世界上许多稻区的主要病害之一。

稻曲病菌生长缓慢，在其离体培养研究中效率低下，且培养效果不理想，不能达到理想的培养效果，不利于相关方面研究工作进展。众所周知，真菌培养的效果、经济性和效率起决定性作用的是培养基，培养基的优化是建立高效的真菌培养试验过程的核心环节。因此，根据稻曲病菌在生长、代谢和不同种的试验生长表达过程中的营养需求，设计稻曲病菌培养基中营养物的成分、含量和配比是工作的重要内容。

市场上缺乏专门培养稻曲病菌的培养基，实验室所用的稻曲病菌培养基是培养一般真菌的培养基成品，稻曲病菌在市面上常见的成品培养基上生长缓慢，不能满足试验的高效率要求。真菌培养基的组成成分不外乎碳源、氮源、无机盐和凝固剂；碳源即碳水化合物，氮源即蛋白质，氨基酸，它们是菌体生长和代谢所必需物质的前体物质，可合成真菌自身所需的结构蛋白以及生化反应中必不可少的生物酶，还直接参与次生代谢产物的生物合成，同时也是合成其他生物分子的代谢中间体，还可作为底物提供细胞生理活动所必需的能量，是细胞生长、代谢和产物生产的重要营养物质。无机盐含有磷酸缓冲物，Mg²⁺，NaCl，Fe²⁺等无机盐离子，Ph值为7.0，无机盐类在微生物生命活动中的主要功能有：构成菌体的成分，作为辅酶或酶的组成部分或维持酶的活性，调节细胞渗透压、氢离子浓度、氧化还原电位等，某些是某些酶如蛋白酶的激活剂。凝固剂是固体培养基必须的成分，起到使培养基其他成分凝固，有利于病菌生长，及保水的作用。

据研究调查，做稻曲病菌培养相关的研究所所用的稻曲病菌培养基大多为市场上商品化培养基，马铃薯蔗糖琼脂培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基，胁本哲氏培养基和大米离培养基，培养的具体情况为培养30天时，稻曲病菌菌丝生长情况为，PDA培养基：60.3mm；PSA培养基：69.8mm；胁本哲氏培养基：59.6mm；大米粒培养基：65.9mm，稻曲病菌在这些培养基上生长缓慢，这对稻曲病菌的科学调查及防治研究带来极大的不便，效率低下是研究稻曲病菌的一道门槛。

结冷胶可作为增稠剂、稳定剂。

2011104555227的发明告知了《一种培养分离难培养细菌的培养基》，其配方为：每100mL VL55培养基中加入0.3mL氨基酸溶液、10μL溶液I(微量元素)、0.3mL溶液II(有机酸)、0.3mL溶液III(有机糖类)及1.5wt％结冷胶(gellan gum)。该培养基可以高效地分离大量难培养细菌。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种适合稻曲病菌生长的培养基，即，提供一种专用于稻曲病菌培养的蛋白胨蔗糖结冷胶培养基P.S.G。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种适合稻曲病菌生长的培养基，培养基主体为由以下重量含量(％)的成分组成：

作为本发明的适合稻曲病菌生长的培养基的改进：在1kg培养基主体中加入二磷酸氢钾25±3mg，氯化钠125±10mg，硫酸亚铁5±1mg，钼酸钠5±1mg，硫酸锰5±1mg，碳酸钙100±10mg，得适合稻曲病菌生长的培养基。

作为本发明的适合稻曲病菌生长的培养基的进一步改进：Mg²⁺为硫酸镁或硫酸镁水合物。

作为本发明的适合稻曲病菌生长的培养基的进一步改进：培养基主体中，蔗糖为1％，蛋白胨为2％，结冷胶为0.3％，Mg²⁺为0.02％。

作为本发明的适合稻曲病菌生长的培养基的进一步改进：水为超纯水。

本发明旨在提供稻曲病菌快速生长培养基(即，适于稻曲病菌生长的培养基)，具体涉及培养基配方及结冷胶在真菌培养方面的应用。

发明人在发明过程中，首先根据常用的培养基各组成分的比例，选择不同的成分配方组合成培养基，同时间培养同一批稻曲病菌，根据试验情况记录病菌生长情况，从中筛选出稻曲病菌生长情况最佳的培养基，并将结冷胶作为凝固剂代替琼脂，并通过添加合适含量的Mg²⁺来实现解决结冷胶不易凝固的技术性问题，筛选得到最优稻曲病菌培养基21天即可长到72.5mm，明显提高培养效率。

在本发明中，蔗糖(C₁₂H₂₂O₁₁)作为碳源，主要为稻曲病菌生长和生化代谢表达提供必要的能量供给；蛋白胨不但作为氮源、还可为微生物生长提供所需的生长因子；无机盐为P，Mg，Na等无机盐离子的混合物，以适合微生物生长的结冷胶作为凝固剂。

在本发明中，Mg²⁺的添加量足以使结冷胶凝固。离子浓度，尤其是Mg²⁺的浓度会对稻曲病菌的生长造成一定的影响，不同浓度的离子状态下稻曲病菌的生长情况不同，本发明找到最适于稻曲病菌生长的Mg²⁺浓度，在可以使结冷胶凝固的同时，稻曲病菌也可以以较好的状态生长。与其他培养真菌的培养基相比，本发明的P.S.G能明显提高稻曲病菌的生长速率，提高稻曲病生长的效果。

本发明具有如下技术优势：

(1)本发明的培养基能有效提高稻曲病菌的生长速率，缩短培养稻曲病菌所需的时间；

(2)所培养的稻曲病菌丝健康，不会出现营养不良的状况；

(3)本发明的培养基所含成分、所用原材料易获得、价格低廉，具有很好的使用成本和经济性；

(4)本发明的培养基配制及使用方便，适于大规模生产与使用。

(5)本发明的培养基将结冷胶作为凝固剂替代琼脂，结冷胶其他同类产品相比具有用量少，弹性、硬度和凝固点、熔点可调节，形成的凝胶具有很高的强度和透明度，热稳定性好且耐酸碱等特点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、一种适合稻曲病菌生长的培养基P.S.G，该培养基主体由以下重量含量(％)的成分组成：蔗糖1％，蛋白胨2％，结冷胶0.3％，Mg²⁺0.02％，余量为水(超纯水)；Mg²⁺为硫酸镁。

在上述培养基主体中加入以下含量的无机盐：二磷酸氢钾0.0025％，氯化钠0.0125％，硫酸亚铁0.0005％，钼酸钠0.0005％，硫酸锰0.0005％，碳酸钙0.01％。

即，在1kg培养基主体中加入二磷酸氢钾25mg，氯化钠125mg，硫酸亚铁5mg，钼酸钠5mg，硫酸锰5mg，碳酸钙100mg，得适合稻曲病菌生长的培养基。

培养基P.S.G与常规培养基一样，使用前需要进行常规的高温灭菌(在1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。

实验一、应用稻曲病菌的培养研究：

1、培养基配制

为了证实本培养基发明比其他培养基培养的稻曲病菌生长率高，选择马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)，海洋肉汤琼脂培养基(MBA)，营养肉汤琼脂培养基(NBA)，溶菌肉汤琼脂培养基(LBA)，酵母葡萄糖琼脂培养基(Ye.G.A)，酵母蔗糖琼脂培养基(Ye.S.A)，酵母果糖琼脂培养基(Ye.F.A)，酵母淀粉琼脂培养基(Ye.D.A)，蛋白胨葡萄糖琼脂培养基(P.G.A)，蛋白胨蔗糖琼脂培养基(P.S.A)，蛋白胨果糖琼脂培养基(P.F.A)，蛋白胨淀粉琼脂培养基(P.D.A)，蛋白胨蔗糖琼脂培养基(P.S.A)，蛋白胨果糖琼脂培养基(P.F.A)，亮氨酸淀粉琼脂培养基(L.D.A)，亮氨酸蔗糖琼脂培养基(L.S.A)，亮氨酸果糖琼脂培养基(L.F.A)，亮氨酸淀粉糖琼脂培养基(L.D.A)，谷氨酸淀粉琼脂培养基(G.D.A)，谷氨酸蔗糖琼脂培养基(G.S.A)，谷氨酸果糖琼脂培养基(G.F.A)，谷氨酸淀粉糖琼脂培养基(G.D.A)，酵母果糖结冷胶培养基(Ye.F.G)这24种培养基与本发明的蛋白胨蔗糖结冷胶培养基(P.S.G)，所用配方培养基各组分的浓度均是培养稻曲病菌的最适浓度，将调配好的培养基接种同一皿稻曲病菌，设置两组重复，培养21天观察菌饼生长的直径，计算其生长速率。

培养条件为：25℃恒温，避光，静置培养。

平均生长速率(mm/d)＝平均增长的直径长度(mm)/21(d)

2、试验结果如下表1和表2所示。

表1、市场上已有的商品化培养基培养结果

表2、配方培养基培养结果

不同培养基与本发明的培养基P.S.G培养稻曲病菌的对比试验结果说明，本发明培养基P.S.G培养的稻曲病菌远比用其他培养基培养的稻曲病菌生长速率高，因此，本培养基可以有效提高稻曲病菌的生长速率。

实施二、P.S.G培养不同来源稻曲病菌

1、实验材料来源

稻曲病菌株采自山东(SD)，江苏(JS)，浙江(ZJ01,ZJ02)，将其分离纯化后，用蛋白胨蔗糖结冷胶培养基(P.S.G)和马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养四种来自不同地区的稻曲病，培养基配制同实施例1，每组设置两个重复，培养21天观察菌饼生长的直径，计算其生长速率。

平均生长速率(mm/d)＝平均增长的直径长度(mm)/21(d)

2、试验结果如下表3和表4所述。

表3、蛋白胨蔗糖结冷胶培养基(P.S.G)培养结果

表4、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养结果

从不同培养基培养不同来源的稻曲病菌的试验结果看出，蛋白胨蔗糖结冷胶培养基(P.S.G)对不同来源的稻曲病菌的生长均有提高生长效率的作用，可培养多种地区采集的稻曲病菌。

实验三、不同Mg²⁺对稻曲病菌的影响

1、培养基配制

为了验证培养基中不同Mg²⁺浓度对稻曲病菌生长的，用酵母果糖结冷胶培养基(Ye.F.G)与蛋白胨蔗糖结冷胶培养基(P.S.G)为基础培养基，各加入Mg²⁺0.02％，0.05％，0.1％，即具体如下：

酵母果糖结冷胶培养基(Ye.F.G)：培养基主体为果糖为1％，酵母为2％，结冷胶为0.3％，Mg²⁺分别为0.01％，0.02％，0.05％，0.1％，余量为水；在培养基主体中加入以下含量的无机盐：二磷酸氢钾0.0025％，氯化钠0.0125％，硫酸亚铁0.0005％，钼酸钠0.0005％，硫酸锰0.0005％，碳酸钙0.01％。

蛋白胨蔗糖结冷胶培养基(P.S.G)：培养基主体为蔗糖为1％，蛋白胨为2％，结冷胶为0.3％，Mg²⁺分别为0.01％，0.02％，0.05％，0.1％，余量为水；在培养基主体中加入以下含量的无机盐：二磷酸氢钾0.0025％，氯化钠0.0125％，硫酸亚铁0.0005％，钼酸钠0.0005％，硫酸锰0.0005％，碳酸钙0.01％。

上述Mg²⁺均为硫酸镁。

将调配好的培养基接种同一皿稻曲病菌，培养21天观察菌饼生长的直径，计算其生长速率。

平均生长速率(mm/d)＝平均增长的直径长度(mm)/21(d)

2、试验结果如下表5、表6所述。

表5、蛋白胨蔗糖结冷胶培养基(P.S.G)

表6、酵母果糖结冷胶培养基(Ye.F.G)

不同Mg²⁺浓度对稻曲病菌生长的影响试验结果可以看出，Mg²⁺浓度越高，稻曲病菌生长速率越小，效率越低，所以Mg²⁺会对稻曲病菌生长造成一定的影响，浓度为0.02％的Mg²⁺是既可以使结冷胶凝固，且对稻曲病菌生长影响最小，是培养稻曲病培养基所用的最佳浓度。

从相同Mg²⁺的酵母果糖结冷胶培养基(Ye.F.G)与蛋白胨蔗糖结冷胶培养基(P.S.G)培养结果可知，P.S.G培养基能较高效地培养稻曲病菌。

实验四、将培养基P.S.G的配方改成如下：

1#培养基P.S.G：

培养基主体为：蔗糖5％，蛋白胨5％，结冷胶1％，Mg²⁺0.1％，余量为水；在培养基主体中加入以下含量的无机盐：二磷酸氢钾0.0025％，氯化钠0.0125％，硫酸亚铁0.0005％，钼酸钠0.0005％，硫酸锰0.0005％，碳酸钙0.01％。

2#培养基P.S.G：

培养基主体为：蔗糖0.1％，蛋白胨0.1％，结冷胶0.1％，Mg²⁺0.02％，余量为水；在培养基主体中加入以下含量的无机盐：二磷酸氢钾0.0025％，氯化钠0.0125％，硫酸亚铁0.0005％，钼酸钠0.0005％，硫酸锰0.0005％，碳酸钙0.01％。

3#培养基P.S.G：

培养基主体为：蔗糖1％，蛋白胨2％，结冷胶1％，Mg²⁺0.02％，余量为水；在培养基主体中加入以下含量的无机盐：二磷酸氢钾0.0025％，氯化钠0.0125％，硫酸亚铁0.0005％，钼酸钠0.0005％，硫酸锰0.0005％，碳酸钙0.01％。

4#培养基P.S.G：

培养基主体为：蔗糖1％，蛋白胨2％，结冷胶1％，Mg²⁺0.05％，余量为水；在培养基主体中加入以下含量的无机盐：二磷酸氢钾0.0025％，氯化钠0.0125％，硫酸亚铁0.0005％，钼酸钠0.0005％，硫酸锰0.0005％，碳酸钙0.01％。

5#培养基P.S.G：

培养基主体为：蔗糖1％，蛋白胨2％，结冷胶1％，Mg²⁺0.02％，余量为水。直接以培养基主体作为5#培养基P.S.G，即，无其他无机盐。

上述培养基中结冷胶均可凝固。

采用与实验三相同的稻曲病菌如同实验三进行检测，培养21天观察菌饼生长的直径，计算其生长速率。

结果如下表7：

表7、不同配方的蛋白胨蔗糖结冷胶培养基(P.S.G)

将培养基的配方改动后的培养结果得知，提高蔗糖，蛋白胨，结冷胶的含量，或者不添加无机盐均会影响稻曲病菌的生长速率，由此得知P.S.G培养基中，蔗糖为1％，蛋白胨为2％，结冷胶为0.3％，Mg²⁺为0.01％，0.02％，0.05％，0.1％，无机盐：二磷酸氢钾0.0025％，氯化钠0.0125％，硫酸亚铁0.0005％，钼酸钠0.0005％，硫酸锰0.0005％，碳酸钙0.01％，此配方是稻曲病菌生长的最佳配方。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。