本发明属于植物提取物分离制备技术领域，具体涉及一种从油橄榄果水中分离制备羟基酪醇的方法。
背景技术：
羟基酪醇(hydroxytyrosol，HT)的化学名称为3,4-二羟基苯乙醇，是一种天然多酚类化合物，分子量很小，单体为黄褐色油状液体。羟基酪醇同其他酚类物质一样具有酚羟基，而且在连有苯环的乙醇链上也具有醇羟基，是一种环烯醚萜类羟基芳族化合物，属两性分子，具有脂溶性和水溶性。生理学研究发现，羟基酪醇具有良好的抗氧化活性，可有效地清除自由基和氧化物，被认为是最具清除自由基的天然抗氧化剂之一，并且在抗压、降血压、降血糖、保护心血管系统、抗癌防癌等方面具有积极的促进作用。因此，在全民倡导大健康的新时代，含有羟基酪醇的提取物有望成为食品、保健食品、特殊医学用途食品的新原料。
天然羟基酪醇主要存在于油橄榄叶和果实中，在油橄榄叶中的含量甚微，约0.2％～0.7％，在油橄榄果实中的含量相对较高，除了以游离的形式存在外，多数以结合态生物形式存在。
目前，羟基酪醇的制备主要有人工合成和从植物中提取分离两大类方法。申请号为201510242626.8、201410069820.6、200910017367.3、200880007487.9的中国发明专利分别采用了生物发酵合成法和化学合成法制备羟基酪醇，由于采用的原料成本昂贵，合成过程复杂且有毒副产物伴生等因素，目前依然还处于实验室研究阶段，并未完全工业化。申请号为201510067619.9、201510371820.6、201510384388.4、201610426012.X、201610590631.2、201310518499.0、201410802938.5、201010297375.0、201010573775.X的发明专利中报道了以橄榄苦苷为原料，通过酶解或化学法使其分解成为羟基酪醇，这些方法有的需要强酸或强碱、有的需要酶解或高温、还有的需要大孔树脂富集，上述条件都可能会带来安全性隐患，致使用上述方法制备的羟基酪醇提取物无法成为食品、保健食品和特殊医学用途食品的原料，从而使其应用受到限制。申请号为201010535347.8的专利报道了从高含量油橄榄叶中高效富集羟基酪醇的方法，主要采用超声或微博提取、大孔树脂富集和中压制备色谱分离等技术，制备的产品羟基酪醇含量高达90％以上，此方法由于成本昂贵从而限制了其应用。申请号为201410034710.6的专利报道了一种采用水提印加果叶制备羟基酪醇的方法，拓展了羟基酪醇制备的原料来源，但是由于工艺中包含大孔树脂富集和冷冻干燥，导致生产成本偏高，使生产企业望而却步。申请号为201510162731.0的专利发明了一种以油橄榄叶为原料，超声辅助原位萃取天然羟基酪醇的方法，由于制备过程中多次使用高温，导致羟基酪醇分级、含量降低。申请号为200710057290.3的专利以橄榄提取液为原料制备羟基酪醇的方法，整个工艺中不仅使用大孔树脂富集纯化、而且高温浓缩，致使最终产品的品质和安全性都有所降低。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种从油橄榄果水中分离制备羟基酪醇的方法，本发明制备的羟基酪醇纯度可满足需求，性质稳定。整个制备过程方法简单、低温运行、绿色环保且适用于大规模的工业化生产，从而弥补现有技术的缺陷和不足。
本发明的制备方法，具体包括如下步骤：
1)将油橄榄果水进行固液分离后，获得待分离的果水液体；
2)将步骤1)所得的果水液体加入有机溶剂，得混合液Ⅰ；
3)搅拌下在步骤2)所得的混合液Ⅰ中加入无机盐，直至无机盐在混合溶液Ⅰ中不再溶解，有固体出现时停止搅拌，静置，得混合溶液Ⅱ；
4)分离步骤3)所得的混合溶液Ⅱ的有机相，在温度不超过60℃下浓缩，得浓缩液；
5)将步骤4)所得的浓缩液干燥，灭菌，即得羟基酪醇提取物。
作为实施例中的一种具体操作，步骤1)所述的油橄榄果水为油橄榄果榨油后残留的废水；
上述步骤1)所述的固液分离是通过离心或与膜过滤方式完成的。
上述步骤2)所述的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯、正丁醇等中的一种或几种；
上述步骤2)所述的有机溶剂和果水液体的体积比为1:5～5:1，萃取时间10～30min；
上述步骤3)所述的无机盐为硫酸钠、硫酸钙、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁中的一种或几种；
上述步骤5)所述的干燥方式为真空干燥、微波干燥、鼓风干燥、冷冻干燥中的一种；
上述步骤5)所述的灭菌方式包括Co-60辐射灭菌、紫外照射灭菌、电子束灭菌中的一种或者几种，灭菌时间为10～20min。
本发明具有以下显著优点：
1)本发明在前期实验的基础上，首次应用油橄榄果榨油后所残留的废水作为提取羟基酪醇的原料，使其中含有的大量的羟基酪醇不被浪费，极大地提高了羟基酪醇的提取率，同时变废为宝。
2)本发明全程所有步骤均在低于60℃下进行，并且没有添加任何强酸强碱，避免了羟基酪醇在提取制备过程中不被分解。
3)本发明使用萃取的方法，大大缩短了纯化羟基酪醇的时间，也没有用任何材料进行分离和纯化，确保了羟基酪醇提取物的安全性，使其符合食品、保健食品和特殊医学用途食品的原料要求。
具体实施方式
以下为本发明的实施例，对本发明的上述内容做进一步的详细说明。但不应该就此理解为本发明上述主体的范围仅限于以下的实施例。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的保护范围。
申请人在实际生产中发现，油橄榄果在压榨获取橄榄油的同时，产生大量的果水，此果水中羟基酪醇的含量高达1％，这为分离制备天然羟基酪醇提供了新的思路和途径。
本发明的羟基酪醇含量测定方法如下：
1.标准曲线的绘制
精密称取98％的羟基酪醇对照品置于容量瓶中，去离子水溶解并定容，将该溶液按对半稀释法依次配置。质量浓度由小到大依次进样，每个样品重复3次，记录保留时间和峰面积。纵坐标为峰面积平均值，横坐标为橄榄苦苷质量浓度，绘制HPLC标准曲线，得HPLC线性回归方程。
2.试样的测定
准确吸取待测液，按标准曲线绘制下的方法通过HPLC测定峰面积，根据标准曲线计算羟基酪醇的浓度。
3.测定结果的计算
式中：C0——对照品的浓度，mg/mL；
A0——HPLC测得的对照品的峰面积；
C1——待测液的浓度，mg/mL；
A1——HPLC测得的待测液的峰面积。
4.重复性
每个试样取三个平行样进行测定，以其算术平均值为测定结果，允许相对偏差为5％
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：
1)将油橄榄果榨油时所残留的废水通过管式离心机固液分离，得到离心液体。取100mL油橄榄果水离心液体置于旋转蒸发仪进行浓缩，在温度低于55℃下浓缩至75mL。
2)将上述浓缩液静置，冷却至室温后加入75mL乙酸乙酯，并搅拌，边搅拌边加入2g硫酸钠。
3)持续搅拌20分钟，置于分液漏斗中静置30分钟，可明显观察到上述溶液分为两相。
4)取上相液体在温度低于55℃下浓缩，微波干燥后得羟基酪醇提取物。
上述方法从油橄榄果水中提取得到的羟基酪醇的纯度为17％，转移率93％。
实施例2：
1)将油橄榄果水通过碟片式离心机固液分离，得到离心液体。取1L油橄榄果水离心液体浓缩，在温度低于60℃下浓缩至600mL。
2)将上述浓缩液静置，冷却至室温后，加入500mL乙酸乙酯，边搅拌边加入32g硫酸钠。
3)持续搅拌30分钟，置于分液漏斗中静置30分钟，可明显观察到上述溶液分为两相。
4)取上相液体在温度低于55℃下浓缩，冷冻干燥后得羟基酪醇。
上述方法从油橄榄果水中提取的羟基酪醇提取物的纯度为26％，转移率87％。
实施例3：
1)将1000L油橄榄果水通过管式离心机和陶瓷膜的偶联分离设备，得到的液体在双效浓缩罐中进行浓缩，温度低于55℃下浓缩至750L。
2)将上述浓缩液打入醇沉罐中，冷却至室温后加入750L乙酸乙酯，开启搅拌，边搅拌边分批加入27kg工业硫酸钠。
3)再持续搅拌20分钟，静置30分钟，从可视镜可以明显看出溶液分为上中下三相。
4)将上相液体打入双效浓缩罐中，在温度低于55℃下浓缩至密度为1.2，微波干燥，得羟基酪醇提取物。
上述方法从油橄榄果水中提取羟基酪醇提取物的纯度为32％。