一种运用连接酶检测甲型流感病毒系列的方法及试剂盒与流程

本发明涉及一种流感病毒系列检测的方法及试剂盒，特别涉及一种运用连接酶检测甲型流感病毒系列的方法及试剂盒。
背景技术：
：流行性感冒病毒（influenzavirus），是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒（流感）的病原体。流感病毒会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性流行。其中，甲型流感病毒较容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现而引起的。通过病毒表面的HA和NA蛋白的亚型可鉴定甲型流感病毒，甲型流感病毒有17种HA亚型和10种NA亚型，所有这些亚型均以多种不同组合存在于病毒表面。甲型流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。一般在人类中发现的甲型流感病毒亚型为H1、H2和H3亚型（其中，H2亚型无传染性），目前已知可感染人的亚型还包括H5、H7和H9亚型，其中H1、H5、H7亚型为高致病性。在动物和人类中传播的流感病毒亚型包括H7N7和H3N8病毒，它们可在马中导致疾病，还有H1N1、H1N2和H3N2病毒则通常在人类中传播。实现对流感病毒的快速分型检测有利于疫情监测以及制定有效的预防控制措施。在流行期结合临床症状诊断流感并不困难，但要确诊或流行监测流感病毒，则必须进行实验室检查，主要包括病毒分离培养、血清学诊断、快速诊断方法和PCR方法。其中，病毒分离培养为临床的金标准检测方法，但需要较为严格的实验条件，且检测耗时长，无法及时给临床诊断提供参考；血清学诊断和快速诊断方法的诊断较为快速且特异度高，但检测灵敏度低，无法进行早期诊断。而PCR检测技术克服了免疫检测技术反应原性低时或窗口期检测的弱点，能够更快更早期检测某些病毒的感染，而现有的运用多重荧光PCR技术检测原理在于在同一PCR反应体系加上针对多个特异的靶序列的多对引物和探针进行PCR反应，在PCR扩增DNA反应期间用荧光信号实时检测扩增产物。其技术缺点主要在于：①前期一般都需要经过步骤繁琐的核酸提取及逆转录过程；②核酸提取完成后运用普通Taqman探针的方法进行多重PCR扩增，意味着一个反应管含有多条引物，引物间的相互干扰导致扩增灵敏度低且耗时长（一次PCR反应耗时约2小时）；③一般都是FAM和HEX两个荧光通道检测，通量低，无法实现一次扩增即能达到对流感病毒基因快速分型检测的目的，难以满足实际使用的需要。开发出可以快速、高效检测甲型流感病毒基因分型的方法及试剂盒，具有非常实际的意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种运用连接酶检测甲型流感病毒系列的方法及试剂盒，本试剂盒可以快速检测感染人且危害较大的4种常见甲型流感病毒亚型：H1、H3、H5和H7亚型，无需步骤繁琐的核酸提取及逆转录过程，一管一次扩增即可以实现4种常见甲型流感病毒的H1、H3、H5和H7亚型分型，解决了普通多重荧光PCR法检测灵敏度低、耗时长且低通量的问题。本发明所采取的技术方案是：运用连接酶检测甲型流感病毒系列的技术包括如下步骤：1）针对需要检测的每个甲型流感病毒亚型序列的保守区，设计其相应的上下游连接引物、特异性荧光探针及一对荧光PCR通用引物，上游连接引物为普通引物，下游连接引物为5’磷酸化标记引物；2）上下游连接引物与样本提取后的RNA靶片段互补配对，在连接酶的作用下，上下游连接引物连接成与靶片段完全互补配对的cDNA序列；3）将连接后的cDNA序列作为荧光PCR反应的模板，仅一对通用引物即可扩增所有亚型序列连接后的cDNA序列，检测反应体系的荧光变化，达到对样本甲型流感病毒H1、H3、H5和H7亚型检测的目的。运用连接酶检测甲型流感病毒系列的试剂盒，包括连接反应管、荧光PCR反应管、阴性对照和阳性对照，其中，连接反应管含连接体系（含连接酶系统和上下游连接引物），荧光PCR反应管含荧光PCR体系（含热启动Taq酶系统、通用引物及各亚型对应的荧光探针），荧光PCR体系中的荧光探针为甲型流感病毒H1、H3、H5和H7亚型的特异性MGB探针。连接引物的序列如下：通用引物的序列如下：优选的，通用引物序列的特征表现为：一条与上游连接引物的5’端部分序列完全一致，另一条与下游连接引物的3’端部分序列互补配对，通用引物的长度在20～30bp。甲型流感病毒H1、H3、H5和H7亚型的特异性MGB探针序列如下：上述探针的3’端连接有MGB，5’端连接有荧光基团，其中，探针1～4分别用于检测甲型流感病毒中的H1、H3、H5、H7亚型。优选的，上述连接酶检测甲型流感病毒系列的试剂盒中所使用的探针1～4连接的荧光基团均不相同。优选的，上述连接酶系统中的连接酶仅能以RNA为模板进行连接反应，且每人份连接体系中连接酶用量为0.5U～3U。优选的，上述连接酶检测甲型流感病毒系列的试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统中添加有UDG酶，能有效防污染，使得本发明试剂盒的特异性及灵敏度更高。优选的，上述连接酶检测甲型流感病毒系列的试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统含有经过化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为4U～7U，dNTPs为0.1mmol/L～0.3mmol/L，UDG酶为0.1U～0.5U。优选的，上述连接酶检测甲型流感病毒系列的试剂盒还设有RNA提取液，RNA提取液的组成成分为EDTA的浓度为0.001mol/L、Tris的浓度为0.01mol/L。本发明的有益效果是：1）本发明的试剂盒适用于定性分型检测咽拭子、鼻咽分泌物等呼吸道样本中甲型流感病毒H1、H3、H5、H7亚型。2）应用本发明的试剂盒中的RNA提取液即可快速对样本进行处理，无需其他常见的样本提取方法的繁琐步骤。3）本发明应用单重荧光PCR技术实现了在同一管扩增体系中分型检测4种甲型流感病毒亚型。4）本发明中的荧光检测系统只有一对通用引物，即可扩增在连接酶系统中成功连接的4种甲型流感病毒亚型的靶片段，有效解决了引物过多导致的扩增效率低下问题。5）本发明的检测试剂盒检测快速，检测通量高，能及时指导临床诊断，大大提高诊断效率。附图说明图1～3为本发明技术的反应原理图，图4～6为本试剂盒检测范围内的甲型流感病毒亚型检测结果示意图：图1为连接引物与通用引物示意图，如图所示：上游通用引物序列与上游连接引物的5’端部分序列完全一致，而下游通用引物序列则与下游连接引物的3’端部分序列完全反向互补配对；图2为连接反应示意图，如图所示：上游连接引物的部分序列（非与上游通用引物序列一致的部分）与靶片段mRNA（targetmRNA）互补配对，下游连接引物的部分序列（非与下游通用引物序列反向互补配对的部分）与靶片段mRNA互补配对，上下游连接引物在连接酶作用下连接成与靶片段mRNA完全互补配对的cDNA序列，即连接产物（ligatedproduct）；图3为通用引物PCR反应示意图，如图所示：首先，下游通用引物与连接产物3’端反向互补配对结合，在Taq酶作用下，下游通用引物PCR扩增产生双链DNA片段；之后，双链DNA片段变性为两条单链DNA，上下游通用引物分别与两条单链DNA片段反向互补配对结合，即开始常规的单重对称PCR过程，产生大量双链DNA片段；图4为甲型流感病毒H1亚型型别感染样本检测结果图；图5为甲型流感病毒H3亚型型别感染样本检测结果图；图6为甲型流感病毒H5亚型型别感染样本检测结果图。具体实施方式下面结合实施例，进一步说明本发明。以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。实施例1：本发明试剂盒的组成及主要原材料的厂商和规格1.运用连接酶检测甲型流感病毒系列的试剂盒组成如下：组成成分规格数量主要成分RNA提取液1300ul/管1管Tris、EDTA连接反应管10ul/管24管甲型流感病毒H1、H3、H5、H7亚型各型别的上下游连接引物、连接酶荧光PCR反应管30ul/管24管热启动Taq酶、UDG酶、通用引物、甲型流感病毒(H1、H3、H5、H7)亚型各型别的特异性荧光探针阴性质控品100ul/管1管灭菌纯化水阳性质控品100ul/管1管灭活的甲型流感病毒H1亚型样本其中，连接引物包括上述SEQIDNO：1～8序列，通用引物包括上述SEQIDNO：9～10序列，荧光探针包括上述SEQIDNO：11～14序列。上述探针1～4的3’端连接有MGB，5’端连接有荧光基团，其中，探针1连接的荧光基团为FAM，探针2连接的荧光基团为HEX，探针3连接的荧光基团为TEXASRED，探针4连接的荧光基团为CY5。上述运用连接酶检测甲型流感病毒系列试剂盒中所使用的连接酶系统中，每人份体系含连接酶1U。上述运用连接酶检测甲型流感病毒系列试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统含有经过化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为6U，dNTPs为20mmol/L，UDG酶为0.1U。上述运用连接酶检测甲型流感病毒系列试剂盒还设有RNA提取液，RNA提取液的组成成分为EDTA的浓度为0.001mol/L，Tris的浓度为0.01mol/L。2.本发明试剂盒主要原材料的厂商和规格实施例2：本发明试剂盒的使用方法1.样本处理与RNA提取1）震荡咽拭子保存管10-30秒（使细胞充分落入液体），取脱落细胞样本0.5ml-1.0ml（如果细胞数量少可以加大体积到2.0ml）2）编好号的样品10,000rpm离心3分钟，弃上清；3）样品沉淀中加入1ml灭菌生理盐水，洗涤沉淀，10,000rpm离心3分钟，弃上清；4）样品沉淀中加入50µlRNA提取液，震荡60秒，充分悬浮细胞沉淀，备用；RNA的提取也可以使用其他公知的方法进行。5）质控品处理取装有阳性质控品和阴性质控品的离心管，10,000rpm离心30秒，然后按（2）～（4）的提取步骤操作。2.连接试剂准备（试剂准备区，冰上操作）1）从试剂盒中取出连接反应管，瞬时离心备用；2）往上述反应管中分别加入提取后的待测样本核酸10µl（如样本不足10µl，请用灭菌纯化水补足10µl后加样）、提取后的阴性质控品10µl及提取后的阳性质控品10µl。盖紧管盖，5000rpm离心30秒后转移至扩增检测区。3.连接条件（PCR仪上操作）PCR仪设置参数为：37℃，5min；65℃，20min。反应条件结束后，取出连接酶反应管（连接产物）置于2-8℃保存（连接产物如需长期保存，可置于-20±5℃）。4.核酸扩增试剂准备（试剂准备区，冰上操作）1）从试剂盒中取出荧光PCR反应管，瞬时离心备用；2）往上述反应管中加入连接产物10µl（包括连接后的阴性质控品和阳性质控品）。盖紧管盖，5000rpm离心30秒后转移至扩增检测区。5.PCR扩增PCR仪设置参数为：50℃，3min；95℃，5min；95℃，5s，56℃，31s，循环45次。在56℃时测定荧光值。根据荧光值变化曲线，确定检测结果。质量控制样品名称FAM通道HEX通道TEXASRED通道CY5通道结果阴性质控品无明显对数扩增曲线无明显对数扩增曲线无明显对数扩增曲线无明显对数扩增曲线阴性阳性质控品有明显对数扩增曲线，Ct≤37无明显对数扩增曲线无明显对数扩增曲线无明显对数扩增曲线甲型流感病毒H1亚型阳性实施例3：本发明试剂盒的参考值设定依据及临床样本检测情况使用本试剂盒和对照试剂盒对临床样本进行检测，两者不符的使用复核试剂盒进行检测，并根据对照与复核检测结果将样本分为阳性组和阴性组，对比本试剂盒检测的Ct值，从而确定本试剂盒参考值，当本试剂盒Ct值大于37时，均属于阴性组，当本试剂盒Ct值小于等于37时，均属于阳性组。因此，将Ct值大于37作为本试剂盒的参考值（CUTOFF值）。使用本发明检测试剂盒的检测结果示意图如图4～6所示。从图中可以清楚地看出，本发明的检测试剂盒可以有效地检测出甲型流感病毒中的H1、H3、H5、H7亚型，检测结果准确可靠。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效技术或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。SEQUENCELISTING<110>广州和实生物技术有限公司<120>一种运用连接酶检测甲型流感病毒系列的试剂盒<130>2016<160>10<170>PatentInversion3.5<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>1cgcaaggtttccacatcatcgtgtggttgggccatgagct40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>2ttctttggggaatatttcgacctgtgtggcattgttatcg40<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>3cgcaaggtttccacatcatcgtcattgggaatgcttccat40<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>4ttggagtgatgcattcagaacctgtgtggcattgttatcg40<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>5cgcaaggtttccacatcatccaatgatcgagttgacctta40<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>6ttggtgactccatctactgccctgtgtggcattgttatcg40<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>7cgcaaggtttccacatcatccatgatgccccgaagctaa39<210>8<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>8accaaagtatcacatctttgtcctgtgtggcattgttatcg41<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9cgcaaggtttccacatcatc20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10cgataacaatgccacacagg20当前第1页1 2 3