一种用于扩增MERS‑CoV的LAMP引物组及试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于扩增中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)的LAMP引物组及试剂盒。

背景技术：

中东呼吸综合征是由一种新型冠状病毒(MERS-CoV)引起的病毒性呼吸道疾病，2012年在沙特阿拉伯首次被发现，可引起从普通感冒到严重急性呼吸综合征等多种疾病。典型的MERS症状包括发烧，咳嗽和气短。同时，肺炎亦较为常见，包括腹泻在内的胃肠道症状也有报道，但不是所有病例都会出现。MERS报告病例的病死率约为36％。2016年5月，中国惠州确认首例输入新中东呼吸综合征病例，引起一定程度的社会关注。

因目前尚无疫苗和特效治疗药物，对于该疾病的防控则显得极为重要。而对于该病毒的快速、特异、高灵敏的诊断则为防控中的重要一环。世界卫生组织(WHO)推荐MERS-CoV病毒检测方法为基于RT-PCR的针对2段及以上基因组特异性核酸序列的信号扩增检测。厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心和香港大学合作成功研制出一种可有效检测中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的免疫诊断试剂。但应用RT-PCR方法，需要在标准生化分析实验室中使用精密的实时荧光PCR仪，并需要试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区，不适合用于现场快速筛查。而免疫检测技术所制成的试纸条具有简便快捷的优势，但该方法误检率较高、灵敏度较低，难于检测处于潜伏期的MERS-CoV携带者，可能造成疫情的扩散。因此，面向现场的快速、灵敏、高特异性核酸标志物检测技术研发将为MERS-CoV防控提供强有力的保障。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年日本荣研化学株式会社开发的替代PCR核酸扩增方法。该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，LAMP反应在恒温水浴箱便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单许多，不需要专业人员也可准确完成，适合基层医疗机构的应用。并且，LAMP还可以大大缩短操作时间，减少了样品污染机会，适合应用于MERS-CoV的快速诊断。

目前，关于MERS-CoV的多保守位点的LAMP检测技术还未见报道。

技术实现要素：

本发明主要解决的技术问题在于提供一种用于扩增MERS-CoV五段保守序列的LAMP引物组及试剂盒与应用，本发明提供的引物灵敏度和特异性皆很高，将其制备成为试剂盒可实现对MERS-CoV快速准确的检测。

本发明的用于扩增MERS-CoV的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包括以下五组引物组中的一种或几种：针对MERS-CoV的orf1a区片段(例如，GenBank:KX108946.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示)扩增的引物组、针对MERS-CoV的orf1b区片段(例如，GenBank:KU308549.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示)扩增的引物组、针对MERS-CoV的N2区片段(例如，GenBank:KU242424.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示)扩增的引物组、针对MERS-CoV的N3区片段(例如，GenBank:KJ156873.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示)扩增的引物组和针对MERS-CoV的upE区片段(例如，GenBank:KX108944.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示)扩增的引物组；

其中，所述针对MERS-CoV的orf1a区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：Orf1a-F3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Orf1a-B3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；以及，Orf1a-FIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Orf1a-BIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述针对MERS-CoV的orf1b区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：Orf1b-F3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，Orf1b-B3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；以及，Orf1b-FIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，Orf1b-BIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述针对MERS-CoV的N2区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：N2-F3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，N2-B3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；以及，N2-FIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，N2-BIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

所述针对MERS-CoV的N3区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：N3-F3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，N3-B3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；以及，N3-FIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，N3-BIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

所述针对MERS-CoV的upE区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：upE-F3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，upE-B3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；以及，upE-FIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，upE-BIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

进一步优选地，本发明的用于扩增MERS-CoV的LAMP引物组包括，针对MERS-CoV的orf1a区片段扩增的引物组、针对MERS-CoV的orf1b区片段扩增的引物组、针对MERS-CoV的N2区片段扩增的引物组和针对MERS-CoV的N3区片段扩增的引物组。

本发明提供的LAMP引物组针对MERS-CoV的特异保守区域(靶基因)，由上述的各自所针对的4条引物组成，包括序列内引物(FIP/BIP)一组、外引物(F3/B3)一组。其中，FIP/BIP分别为上下游内部引物，由F2区和F1c区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1c区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。F3/B3分别为上下游外部引物，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。具体核苷酸序列如下表1所示：

表1引物序列

本发明的用于检测MERS-CoV的试剂盒，包括上述的LAMP引物组。优选可以将LAMP引物组放入超纯水中制成工作液。所述引物组的工作液可以为含1～20μM的F3、B3引物及5～80μM的FIP、BIP引物的混合液。

根据本发明所述的试剂盒，其中，还包括LAMP反应液和LAMP显色液。进一步地，所述LAMP反应液包括：Bst聚合酶、AMV反转录酶、LAMP反应缓冲液和超纯水。其中，LAMP反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)₂SO₄、MgSO₄和Triton X-100。

具体地，所述LAMP反应液体系中各组分如下：

LAMP反应液(25μL体系)

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH4)₂SO₄

2～20mM MgSO₄

0.1～0.5％Triton X-100

0.2～1M甜菜碱

1～1.6mM dNTP

5～10U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

5～10U AMV反转录酶(NEW ENGLAND Biolabs)

LAMP显色液可优选Sybr green I，Eva green，羟基萘酚蓝(HNB)和铬黑T(EBT)等中的一种。

在进行检测时，例如可以使用10～15μL的引物组工作液与LAMP反应液组成25μL的检测混合液。LAMP显色液加入量可以是100～150μmol/L检测混合液。

本发明还提供了非疾病诊断目的MERS-CoV病毒检测方法，包括以下步骤：

1)取核酸样本、所述LAMP引物组的工作液与LAMP反应液、超纯水、LAMP密封液混合，制得扩增反应液；

2)取制得的扩增反应液，60～65℃反应20～80min，优选63℃反应60min，根据显色结果判断样品是否含有MERS-CoV病毒。

根据本发明所述的检测方法，其中，所述LAMP引物组的工作液中，引物Orf1a-F3与Orf1a-B3的浓度均为0.2～0.4μM，引物Orf1a-FIP与Orf1a-BIP的浓度均为1～2μM；

所述引物Orf1b-F3与Orf1b-B3的浓度均为5～10μM，引物Orf1b-FIP与Orf1b-BIP的浓度均为1～2μM；

所述引物N2-F3与N2-B3的浓度均为0.2～0.4μM，引物N2-FIP与N2-BIP的浓度均为1～2μM；

所述引物N3-F3与N3-B3的浓度均为0.2～0.4μM，引物N3-FIP与N3-BIP的浓度均为1～2μM；

所述引物upE-F3与upE-B3的浓度均为0.2～0.4μM，引物upE-FIP与upE-BIP的浓度均为1～2μM。

本发明还提供了上述LAMP引物组以及试剂盒在非疾病诊断目的的MERS-CoV病毒检测中的应用。

本发明基于LAMP技术，针对MERS-CoV的5个特异保守区域分别设计4条引物。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中含有的MERS-CoV。并且，由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，在LAMP扩增所需时间短，进一步缩短了检测的时间，简化了操作。由于本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对MERS-CoV的快速准确检测，因此，适用于MERS-CoV爆发时，专业程度不高的机场、海关、口岸、社区等地的现场快速检测。本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，将其制备成为试剂盒可实现对MERS-CoV快速准确的检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图2为本发明实施例2中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图3为本发明实施例3中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图4为本发明实施例4中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图5为本发明实施例5中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图6为本发明实施例6中的凝胶电泳图。

图7为本发明实施例7中的单独基因检测结果示意图。

图8为本发明实施例7中的混合基因检测结果示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1应用Eva Green验证对MERS-CoV orf1a的扩增反应

Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，Eva Green发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，Eva Green的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。

反应溶液组合(25μL)

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

14mM MgSO₄

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

1X Eva Green(Biotum)

引物：

200nM Orf1a-F3/SEQ ID NO.l

200nM Orf1a-B3/SEQ ID NO.2

1600nM Orf1a-FIP/SEQ ID NO.3

1600nM Orf1a-BIP/SEQ ID NO.4

靶:MERS-orf1a dsDNA/SEQ ID NO.21

同时设置无靶的对照组。

设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例2应用Eva Green验证对MERS-CoV orf1b的扩增反应

Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，EvaGreen的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。

反应溶液组合(25μL)

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

14mM MgSO₄

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

1X Eva Green(Biotum)

引物：

200nM Orf1b-F3/SEQ ID NO.5

200nM Orf1b-B3/SEQ ID NO.6

1600nM Orf1b-FIP/SEQ ID NO.7

1600nM Orf1b-BIP/SEQ ID NO.8

靶:MERS-orf1b dsDNANA/SEQ ID NO.22

同时设置无靶的对照组。

设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图2所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例3应用Eva Green验证对MERS-CoV N2的扩增反应

EvaGreen同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，EvaGreen的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。

反应溶液组合(25μL)

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

14mM MgSO₄

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

1X Eva Green(Biotum)

引物：

200nM N2-F3/SEQ ID NO.9

200nM N2-B3/SEQ ID NO.10

1600nM N2-FIP/SEQ ID NO.11

1600nM N2-BIP/SEQ ID NO.12

靶:MERS-N2dsDNA/SEQ ID NO.23

同时设置无靶的对照组。

设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图3所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例4应用Eva Green验证对MERS-CoV N2的扩增反应

EvaGreen同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，EvaGreen的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。

通过这些引物合成本发明核酸的方法的反应溶液的组合在下面所示。

反应溶液组合(25μL)

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

14mM MgSO₄

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

1X Eva Green(Biotum)

引物：

200nM N3-F3/SEQ ID NO.13

200nM N3-B3/SEQ ID NO.14

1600nM N3-FIP/SEQ ID NO.15

1600nM N3-BIP/SEQ ID NO.16

靶:MERS-N3dsDNA/SEQ ID NO.24

同时设置无靶的对照组。

设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图4所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例5应用Eva Green验证对MERS-CoV UpE的扩增反应

EvaGreen同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，EvaGreen的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。

反应溶液组合(25μL)

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

14mM MgSO₄

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

1X Eva Green(Biotum)

引物：

200nM upE-F3/SEQ ID NO.17

200nM upE-B3/SEQ ID NO.18

1600nM upE-FIP/SEQ ID NO.19

1600nM upE-BIP/SEQ ID NO.20

靶:MERS-upE dsDNA/SEQ ID NO.25

同时设置无靶的对照组。

设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图5所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例6MERS-CoV基因目标片段扩增产物的凝胶电泳检测

将实施例1～5中获得的扩增产物经过回收之后进行凝胶电游检测进一步确定。样品于90mV在GelRed预染的(Biotum)1％琼脂糖凝胶(TAE溶解)电泳1小时。结果在图6中显示，各泳道的标记数字分别对应样品如下：

1：MERS-CoV orf1a的LAMP扩增产物。

2：MERS-CoV orf1b的LAMP扩增产物。

3：MERS-CoV N2的LAMP扩增产物。

4：MERS-CoV N3的LAMP扩增产物。

5：MERS-CoV upE的LAMP扩增产物。

实施例7MERS-CoV基因目标片段人造RNA片段的可视化检测

在LAMP反应体系中加入逆转录酶即可以实现对于RNA的检测。因MERS-CoV为烈性RNA病毒，具有极强危害性，对于该病毒的研究必须在生物安全四级实验室中进行，故对于该病毒检测技术及产品的研发一般采用无害的人造RNA片段进行模拟。故本专利亦使用人造RNA片段，利用Promega公司提供的RiboMax^TM Large Scale RNA Production Systems进行体外转录以获得。而后应用所可视化试剂进行RNA检测研究。

羟基萘酚蓝(HNB)是应用于LAMP技术中可视化检测的指示剂。其原理为：当发生核酸体外扩增反应时会产生大量不溶副产物焦磷酸镁，从而导致镁离子减少，而HNB为镁离子指示剂故可监测有无扩增反应发生。当LAMP未发生扩增反应时，体系中镁离子浓度高，反应液呈紫色；当LAMP发生扩增反应时，体系中镁离子浓度低，反应液呈蓝色。

通过这些引物和可视化试剂进行MERS-CoV病毒RNA检测的反应溶液的组合在下面所示。

反应溶液组合(25μL)

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

14mM MgSO₄

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

5U AMV反转录酶(NEW ENGLAND Biolabs)

120μM HNB

以上为可视化检测的所共用的试剂，下述为针对各RNA片段所使用的引物及靶序列：

1)MERS-CoV orf1a RNA检测引物：

200nM Orf1a-F3/SEQ ID NO.l

200nM Orf1a-B3/SEQ ID NO.2

1600nM Orf1a-FIP/SEQ ID NO.3

1600nM Orf1a-BIP/SEQ ID NO.4

靶:MERS-orf1a RNA/SEQ ID NO.26

同时设置无靶的对照组。

2)MERS-CoV orf1b RNA检测引物：

200nM Orf1b-F3/SEQ ID NO.5

200nM Orf1b-B3/SEQ ID NO.6

1600nM Orf1b-FIP/SEQ ID NO.7

1600nM Orf1b-BIP/SEQ ID NO.8

靶:MERS-orf1b RNA/SEQ ID NO.27

同时设置无靶的对照组。

3)MERS-CoV N2 RNA检测引物：

200nM N2-F3/SEQ ID NO.9

200nM N2-B3/SEQ ID NO.10

1600nM N2-FIP/SEQ ID NO.11

1600nM N2-BIP/SEQ ID NO.12

靶:MERS-N2 RNA/SEQ ID NO.28

同时设置无靶的对照组。

4)MERS-CoV N3 RNA检测引物：

200nM N3-F3/SEQ ID NO.13

200nM N3-B3/SEQ ID NO.14

1600nM N3-FIP/SEQ ID NO.15

1600nM N3-BIP/SEQ ID NO.16

靶:MERS-N3 RNA/SEQ ID NO.29

同时设置无靶的对照组。

5)MERS-CoV UpE RNA检测引物：

200nM upE-F3/SEQ ID NO.17

200nM upE-B3/SEQ ID NO.18

1600nM upE-FIP/SEQ ID NO.19

1600nM upE-BIP/SEQ ID NO.20

靶:MERS-upE RNA/SEQ ID NO.30

同时设置无靶的对照组。

结果判断：蓝色为阳性，紫色为阴性。结果在图7中显示，各反应管的标记数字分别对应样品如下：

1：MERS-CoV orf1a RNA检测的阳性结果

2：MERS-CoV orf1a RNA检测的阴性结果。

3：MERS-CoV orf1b RNA检测的阳性结果。

4：MERS-CoV orf1b RNA检测的阴性结果。

5：MERS-CoV N2 RNA检测的阳性结果。

6：MERS-CoV N2 RNA检测的阴性结果。

7：MERS-CoV N3 RNA检测的阳性结果。

8：MERS-CoV N3 RNA检测的阴性结果。

9：MERS-CoV upE RNA检测的阳性结果。

10：MERS-CoV upE RNA检测的阴性结果。

额外的，若将其中的几组同时应用于MERS真实样本的检测则可增加检测的准确度。如将MERS-CoV orf1a RNA、MERS-CoV orf1b RNA、MERS-CoV N3 RNA和MERS-CoV upE RNA的样本混合后代替全部原有核酸样本进行模拟检测，则会出现MERS-CoV orf1a RNA、MERS-CoV orf1b RNA、MERS-CoV N3 RNA和MERS-CoV upE RNA的检测为阳性(显蓝色)，而MERS-CoV N2 RNA的检测结果为阴性(显紫色)。具体检测结果如图8所示。

当然，本发明还可以有多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明的公开做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。

<110> 中国科学院过程工程研究所

<120> 一种用于扩增MERS-CoV的LAMP引物组及试剂盒

<160> 30

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

ttgagactat tcccacacag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

gtgtagtgcg catataagca 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

gccacaggca acaagaaaag tgtgactatg gccttcgtta t 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

atgcaaacat agtctacgag cccaagccaa tttgcaactg c 41

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

cgatgcaaca gttcctggat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

tgttacccca ctcagtgtct 20

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

agcatgagca ccctcaacat cgtcgtgaag aggctgtaag gc 42

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

aatgcatgtg gcaccaatgt gcacaacacc aactggctga ac 42

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

gcttttggtc ttcgcggac 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

tccactgtac cgaaggaagt 20

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

cagcaatttg gggccaacgt ggctccaggg aaactttggt ga 42

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

cttgctccta cagccagtgc ttcagggttg ccatgatcat ca 42

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

acccctgcgc aaaatgc 17

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

ttgttagggt tccgcgtcc 19

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

agaagtacca cctgggagcc aggtattggc ggagacagga ca 42

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

gaactggacc cgaagcagca gtggcgccat cttcatgga 39

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

agtgcactta tattagccgt 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

tccatatgtc caaagagaga c 21

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

caggcacgaa aacagtggaa actagcctag tttctgtaac tgac 44

<210> 20

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

ccgagctcgc ttatcgttta agtaatggat tagcctctac acg 43

<210> 21

<211> 550

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-orf1a dsDNA

<400> 21

tatgtgataa tcttacaagc cactaaattt actttgtgga actacttgtt tgagactatt 60

cccacacagt tgttcccact cttatttgtg actatggcct tcgttatgtt gttggttaaa 120

cacaaacaca cctttttgac acttttcttg ttgcctgtgg ctatttgttt gacttatgca 180

aacatagtct acgagcccac tactcccatt tcgtcagcgc tgattgcagt tgcaaattgg 240

cttgccccca ctaatgctta tatgcgcact acacatactg atattggtgt ctacattagt 300

atgtcacttg tattagtcat tgtagtgaag agattgtaca acccatcact ttctaacttt 360

gcgttagcat tgtgcagtgg tgtaatgtgg ttgtacactt atagcattgg agaagcctca 420

agccccattg cctatctggt ttttgtcact acactcacta gtgattatac gattacagtc 480

tttgttactg tcaaccttgc aaaagtttgc acttatgcca tctttgctta ctcaccacag 540

cttacacttg 550

<210> 22

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-orf1b dsDNA

<400> 22

gaaacttctg gcctctcacc tgcttatgca ccaacatatg ttagtgttga tgacaagtat 60

aagacgagtg atgagctttg cgtgaatctt aatttacccg caaatgtccc atactctcgt 120

gttatttcca ggatgggctt taaactcgat gcaacagttc ctggatatcc taagcttttc 180

attactcgtg aagaggctgt aaggcaagtt cgaagctgga taggcttcga tgttgagggt 240

gctcatgctt cccgtaatgc atgtggcacc aatgtgcctc tacaattagg attttcaact 300

ggtgtgaact ttgttgttca gccagttggt gttgtagaca ctgagtgggg taacatgtta 360

acgggcattg ctgcacgtcc tccaccaggt gaacagttta agcacctcgt gcctcttatg 420

cataaggggg ctgcgtggcc tattgttaga cgacgtatag tgcaaatgtt gtcagacact 480

ttagacaaat tgtctgatta ctgtacgttt gtttgttggg ctcatggctt tgaattaacg 540

tctgcatca 549

<210> 23

<211> 550

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-N2 dsDNA

<400> 23

ctttaccttg atcttctgaa cagactacaa gcccttgagt ctggcaaagt aaagcaatcg 60

cagccaaaag taatcactaa gaaagatgct gctgctgcta aaaataagat gcgccacaag 120

cgcacttcca ccaaaagttt caacatggtg caagcttttg gtcttcgcgg accaggagac 180

ctccagggaa actttggtga tcttcaattg aataaactcg gcactgagga cccacgttgg 240

ccccaaattg ctgagcttgc tcctacagcc agtgctttta tgggtatgtc gcaatttaaa 300

cttacccatc agaacaatga tgatcatggc aaccctgtgt acttccttcg gtacagtgga 360

gccattaaac ttgacccaaa gaatcccaac tacaataagt ggttggagct tcttgagcaa 420

aatattgatg cctacaaaac cttccctaag aaggaaaaga aacaaaaggc accaaaagaa 480

gaatcaacag accaaatgtc tgaacctcca aaggagcagc gtgtgcaagg tagcatcact 540

cagcgcactc 550

<210> 24

<211> 550

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-N3 dsDNA

<400> 24

acttgcattg cttcgagctt aggctcttta gtaagagtat cttaattgat tttaacgaat 60

ctcaatttca ttgttatggc atcccctgct gcacctcgtg ctgtttcctt tgccgataac 120

aatgatataa caaatacaaa cctatctcga ggtagaggac gtaatccaaa accacgagct 180

gcaccaaata acactgtctc ttggtacact gggcttaccc aacacgggaa agtccctctt 240

acctttccac ctgggcaggg tgtacctctt aatgccaatt ctacccctgc gcaaaatgct 300

gggtattggc ggagacagga cagaaaaatt aataccggga atggaattaa gcaactggct 360

cccaggtggt acttctacta cactggaact ggacccgaag cagcactccc attccgggct 420

gttaaggatg gcatcgtttg ggtccatgaa gatggcgcca ctgatgctcc ttcaactttt 480

gggacgcgga accctaacaa tgattcagct attgttacac aattcgcgcc cggtactaag 540

cttcctaaaa 550

<210> 25

<211> 550

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-upE dsDNA

<400> 25

cacaccaaac cattatttat tagaaacttc gatcagcgtt gcagctgttc tcgttgtttt 60

tatttgcact cttccactta tatagagtgc acttatatta gccgttttag taagattagc 120

ctagtttctg taactgactt ctccttaaac ggcaatgttt ccactgtttt cgtgcctgca 180

acgcgcgatt cagttcctct tcacataatc gccccgagct cgcttatcgt ttaagcagct 240

ctgcgctact atgggtcccg tgtagaggct aatccattag tctctctttg gacatatgga 300

aaacgaacta tgttaccctt tgtccaagaa cgaatagggt tgttcatagt aaactttttc 360

atttttaccg tagtatgtgc tataacactc ttggtgtgta tggctttcct tacggctact 420

agattatgtg tgcaatgtat gacaggcttc aataccctgt tagttcagcc cgcattatac 480

ttgtataata ctggacgttc agtctatgta aaattccagg atagtaaacc ccctctacca 540

cctgacgagt 550

<210> 26

<211> 550

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-orf1a RNA

<400> 26

uaugugauaa ucuuacaagc cacuaaauuu acuuugugga acuacuuguu ugagacuauu 60

cccacacagu uguucccacu cuuauuugug acuauggccu ucguuauguu guugguuaaa 120

cacaaacaca ccuuuuugac acuuuucuug uugccugugg cuauuuguuu gacuuaugca 180

aacauagucu acgagcccac uacucccauu ucgucagcgc ugauugcagu ugcaaauugg 240

cuugccccca cuaaugcuua uaugcgcacu acacauacug auauuggugu cuacauuagu 300

augucacuug uauuagucau uguagugaag agauuguaca acccaucacu uucuaacuuu 360

gcguuagcau ugugcagugg uguaaugugg uuguacacuu auagcauugg agaagccuca 420

agccccauug ccuaucuggu uuuugucacu acacucacua gugauuauac gauuacaguc 480

uuuguuacug ucaaccuugc aaaaguuugc acuuaugcca ucuuugcuua cucaccacag 540

cuuacacuug 550

<210> 27

<211> 549

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-orf1b RNA

<400> 27

gaaacuucug gccucucacc ugcuuaugca ccaacauaug uuaguguuga ugacaaguau 60

aagacgagug augagcuuug cgugaaucuu aauuuacccg caaauguccc auacucucgu 120

guuauuucca ggaugggcuu uaaacucgau gcaacaguuc cuggauaucc uaagcuuuuc 180

auuacucgug aagaggcugu aaggcaaguu cgaagcugga uaggcuucga uguugagggu 240

gcucaugcuu cccguaaugc auguggcacc aaugugccuc uacaauuagg auuuucaacu 300

ggugugaacu uuguuguuca gccaguuggu guuguagaca cugagugggg uaacauguua 360

acgggcauug cugcacgucc uccaccaggu gaacaguuua agcaccucgu gccucuuaug 420

cauaaggggg cugcguggcc uauuguuaga cgacguauag ugcaaauguu gucagacacu 480

uuagacaaau ugucugauua cuguacguuu guuuguuggg cucauggcuu ugaauuaacg 540

ucugcauca 549

<210> 28

<211> 550

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-N2 RNA

<400> 28

cuuuaccuug aucuucugaa cagacuacaa gcccuugagu cuggcaaagu aaagcaaucg 60

cagccaaaag uaaucacuaa gaaagaugcu gcugcugcua aaaauaagau gcgccacaag 120

cgcacuucca ccaaaaguuu caacauggug caagcuuuug gucuucgcgg accaggagac 180

cuccagggaa acuuugguga ucuucaauug aauaaacucg gcacugagga cccacguugg 240

ccccaaauug cugagcuugc uccuacagcc agugcuuuua uggguauguc gcaauuuaaa 300

cuuacccauc agaacaauga ugaucauggc aacccugugu acuuccuucg guacagugga 360

gccauuaaac uugacccaaa gaaucccaac uacaauaagu gguuggagcu ucuugagcaa 420

aauauugaug ccuacaaaac cuucccuaag aaggaaaaga aacaaaaggc accaaaagaa 480

gaaucaacag accaaauguc ugaaccucca aaggagcagc gugugcaagg uagcaucacu 540

cagcgcacuc 550

<210> 29

<211> 550

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-N3 RNA

<400> 29

acuugcauug cuucgagcuu aggcucuuua guaagaguau cuuaauugau uuuaacgaau 60

cucaauuuca uuguuauggc auccccugcu gcaccucgug cuguuuccuu ugccgauaac 120

aaugauauaa caaauacaaa ccuaucucga gguagaggac guaauccaaa accacgagcu 180

gcaccaaaua acacugucuc uugguacacu gggcuuaccc aacacgggaa agucccucuu 240

accuuuccac cugggcaggg uguaccucuu aaugccaauu cuaccccugc gcaaaaugcu 300

ggguauuggc ggagacagga cagaaaaauu aauaccggga auggaauuaa gcaacuggcu 360

cccagguggu acuucuacua cacuggaacu ggacccgaag cagcacuccc auuccgggcu 420

guuaaggaug gcaucguuug gguccaugaa gauggcgcca cugaugcucc uucaacuuuu 480

gggacgcgga acccuaacaa ugauucagcu auuguuacac aauucgcgcc cgguacuaag 540

cuuccuaaaa 550

<210> 30

<211> 550

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-upE RNA

<400> 30

cacaccaaac cauuauuuau uagaaacuuc gaucagcguu gcagcuguuc ucguuguuuu 60

uauuugcacu cuuccacuua uauagagugc acuuauauua gccguuuuag uaagauuagc 120

cuaguuucug uaacugacuu cuccuuaaac ggcaauguuu ccacuguuuu cgugccugca 180

acgcgcgauu caguuccucu ucacauaauc gccccgagcu cgcuuaucgu uuaagcagcu 240

cugcgcuacu augggucccg uguagaggcu aauccauuag ucucucuuug gacauaugga 300

aaacgaacua uguuacccuu uguccaagaa cgaauagggu uguucauagu aaacuuuuuc 360

auuuuuaccg uaguaugugc uauaacacuc uuggugugua uggcuuuccu uacggcuacu 420

agauuaugug ugcaauguau gacaggcuuc aauacccugu uaguucagcc cgcauuauac 480

uuguauaaua cuggacguuc agucuaugua aaauuccagg auaguaaacc cccucuacca 540

ccugacgagu 550