本发明属于医药领域，具体是天然产物的制备及其应用。
背景技术
乳腺癌是威胁全球女性健康的常见恶性肿瘤，其发病率高居女性恶性肿瘤发病率之首(每十万人中约43.3人罹患乳腺癌)。统计显示，每年中国乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的12.2％和9.6％(l.fan,k.strasser-weippl,j.jli,etal.breastcancerinchina.lancetoncol.2014:15(7):e279-289.)。乳腺癌易产生化疗耐受，特别是多药耐受的问题一直是限制乳腺癌综合治疗疗效的瓶颈，严重降低了已发生乳腺癌转移患者的生存率和生存期。据统计，90％以上的转移性乳腺癌存在着不同程度的化疗耐受，一线化疗药物的首次有效率约为30-70％，且有效作用期仅持续6-10个月，但化疗药物依然是临床治疗乳腺癌的主力军(s.braga.clinicalandmolecularmethodsindrugdevelopment:neoadjuvantsystemictherapyinbreastcancerasamodel.methodsmolbiol,2016,1395:251-280.c.twelves,m.jove,a.gombos,etal.cytotoxicchemotherapy:stillthemainstayofclinicalpracticeforallsubtypesmetastaticbreastcancer.critrevoncolhematol.2016,100:74-87.h.jbowles,k.lclarke.)。近年来，临床用于转移性乳腺癌的靶向药物不断推陈出新，如2015年美国fda批准的细胞周期蛋白依赖激酶(cdk)抑制剂palbociclib成功上市，用于治疗hr+/her2-(luminala型)绝经后晚期乳腺癌，但存在中性粒细胞缺乏、白血球减少、疲劳以及肺栓塞等副作用，并且价格昂贵。对于转移能力很强的hr-/pr-/her2-(basal-like型)乳腺癌，2016年美国临床肿瘤学会年会报道：多种药物已处于iii期临床研究阶段，至今仍未有药物上市。
化疗药物的耐受性以及靶向药物的局限性使得研究者们更加重视从天然活性产物中发现抗肿瘤前药，研发疗效强、毒副作用低的药物，以应对具有较强转移能力的恶性肿瘤。如以长春新碱、紫杉醇、鬼臼毒素、丹参内酯、姜黄素、桦木酸等天然活性成分为前药开发的抗肿瘤药物已广泛用于白血病、乳腺癌、前列腺癌和肺癌的临床治疗，为癌症患者带来治愈或者延长生存期的希望(hitokawa,s.lmorris-natschke,t.akiyama,etal.plant-derivednaturalproductresearchaimedatnewdrugdiscovery.jnat.med.2008,62(3):263-280.)。
本发明所涉及的两种天然成分柴胡皂苷元a和d来源于植物药柴胡。柴胡始载于《神农本草经》，为伞形科柴胡属北柴胡(bupleurumchinensedc.)和狭叶柴胡(bupleurumscozonerifoliumwilld.)的干燥根，属于中药辅助治疗乳腺癌方剂中疏肝健脾类常用药物，而针对柴胡中抗乳腺癌有效成分的研究和报道非常有限。2003年台湾学者发现柴胡皂苷a对人乳腺癌细胞系mda-mb-231(basal-like型)和mcf-7(luminala型)的生存与增殖有抑制作用；2015年shin等发现柴胡皂苷a和d能够抑制骨转移乳腺癌细胞的活性和迁移能力(j.cchen,n.wchang,j.gchung,etal.saikosaponin-ainducesapoptoticmechanisminhumanbreastmda-mb-231andmcf-7cancercells.amjchinmed.2003,31(3):363-377.j.eshin,h.jkim,k.rkim,etal.typeisaikosaponinsaanddinhibitosteoclastogenesisinbonemarrow-derivedmacrophagesandosteolyticactivityofmetastaticbreastcancercells.evidbasedcomplementalternatmed.2015,2015:582437.)。然而，柴胡皂苷a和d的溶血毒性以及肝脏毒性不可忽视。柴胡皂苷元a、d分别为柴胡皂苷a、d的胃肠道代谢产物，此两种苷元是否具有更强的乳腺癌细胞毒性和较低的溶血毒性及肝脏毒性值得深入研究。
柴胡皂苷元a和d在柴胡植物中含量较低，已有从北柴胡中提取柴胡皂苷元a、d的报道，但提取步骤繁琐、化合物产量较低，仅适用于柴胡皂苷元a、d的鉴定试验(d.qli,l.zhou,d.wang,etal.neuroprotectiveoleananetriterpenesfromtherootsofbupleurumchinense.bioorg.med.chem.let.2016,26(6):1594–1598.)；而通过盐酸水解柴胡皂苷a的方法制备柴胡皂苷元a，造价相对较高，不适宜大量制备(r.tundis,m.bonesi,b.deguin,etal.cytotoxicactivityandinhibitoryeffectonnitricoxideproductionoftriterpenesaponinsfromtherootsofphysospermumverticillatum(waldst&kit)(apiaceae).bioorg.med.chem.2009,17(13):4542-4547)。因此需要开发一种新的低成本、便捷的制备方法，适合柴胡皂苷a和d的大量制备。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种酶水解制备柴胡皂苷元a和d的新方法。
柴胡皂苷元a(saikogenina，sga)、柴胡皂苷元d(saikogenind，sgd)的结构式分别如式i、ii所示：
本发明技术方案为，柴胡皂苷元a和d的制备方法，步骤包括：
(1)柴胡总皂苷溶液中加入复合植物水解酶，在ph＝4.5～6的条件下，40～60℃反应15～30小时；所述的复合植物水解酶为viscozymel；
(2)步骤(1)的柴胡皂苷酶解液用有机溶剂萃取，合并萃取液并浓缩干燥，取固体；
(3)步骤(2)的固体溶解于醇，制备液相色谱法分离，制备液相色谱分离条件为：采用c18柱，用乙腈-水作为流动相进行梯度洗脱，得到柴胡皂苷元a和柴胡皂苷元d。
步骤(1)中，以柴胡的原药重量计，与复合植物水解酶的用量比为1kg：0.1～1g，优选为1kg：0.3～0.6g。或者，柴胡总皂苷与复合植物水解酶的用量比为1kg：2～15g；优选为1kg：5～12g。
在本发明的一个优选例中，以柴胡的原药重量计，与复合植物水解酶的用量比为1kg：0.4～0.6g；柴胡总皂苷与复合植物水解酶的用量比为1kg：7～10g。
步骤(1)中，柴胡总皂苷溶液的制备方法包括：柴胡粉碎后加入65％～85％乙醇，调节ph＝7.5～8.5，70～85℃回流提取2～4次，每次乙醇与柴胡的用量比为8～15l:1kg；合并提取液，并去除乙醇。优选的，柴胡为伞形科柴胡属北柴胡(bupleurumchinensedc.)的干燥根。
优选的，以柴胡的原药重量计，与复合植物水解酶的用量比为1kg：0.1～1g。
viscozymel是诺维信复合植物水解酶，包含阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、半纤维素酶和木聚糖酶等多种糖酶。
步骤(3)的梯度洗脱条件为：a.第一阶段时间18～25min，乙腈体积含量由30％～35％匀速变为62％～68％；b.第二阶段时间8～12min，乙腈体积含量由62％～68％匀速变为30％～35％，分段收集洗脱段。
本方法的一个优选的梯度洗脱条件为：第0～20min，乙腈体积含量由35％匀速变为66％；第20～30min，乙腈体积含量由66％匀速变为35％。收集第15～18min洗脱段得到柴胡皂苷元d；收集第22～25min洗脱段得到柴胡皂苷元a。
优选的，步骤(2)所述的有机溶剂为氯仿；步骤(3)所述的醇为甲醇。
本发明选用的中药柴胡来源于伞形科柴胡属北柴胡(bupleurumchinensedc.)的干燥根。文献报道柴胡皂苷元a、d在北柴胡的干燥根中含量非常低，不适宜大量生产；此外，柴胡皂苷元a和d互为差向异构体，结构中含有多个手性碳，目前大规模的合成生产较为困难。
本发明通过酶水解柴胡药材中柴胡总皂苷的方法获得柴胡皂苷元a和d的粗品，经过液液萃取、制备hplc等方法分离、纯化，得到柴胡皂苷元a和d纯品。产物并经lc-tof/ms、核磁共振技术鉴定，根据化合物结构确定为柴胡皂苷元a和d。
本发明通过酶水解法，从柴胡原药或柴胡总皂苷中提取柴胡皂苷元a和d，以柴胡原药重量计，两种皂苷元的总收率约为0.1％，远高于其实际含量。该方法工艺稳定，酶水解转化率高，产物纯度可达98％以上。
柴胡总皂苷提取方法简单，因此本发明的方法原料易得，易重复，酶水解方法转化率高、适宜柴胡皂苷元的大量制备，为进一步开展柴胡皂苷元a、d的抗乳腺癌活性及机制研究提供了可靠、廉价的化合物制备方法。
所获得的柴胡皂苷元a和d具有抗乳腺癌的活性。本发明用体外细胞毒性实验证实两种柴胡皂苷元的抗乳腺癌活性。具体为，采用细胞增殖抑制活性测试方法(mtt法)考察柴胡皂苷元a和d对四种亚型人乳腺癌细胞株[sum149(basal-like型)，mcf-7(luminala型)，zr-75-1(luminalb型)，bt474(her2阳性型)]的抗肿瘤活性。结果证实，柴胡皂苷元a和d对这四种肿瘤细胞的增殖均有一定抑制作用；为五环三萜类齐墩果烷型化合物的抗乳腺癌药物的开发提供了线索。
附图说明
图1为柴胡皂苷元a的13c-nmr谱图(dmso，100mhz)
图2为柴胡皂苷元a的1h-nmr谱图(dmso，400mhz)
图3为柴胡皂苷元d的13c-nmr谱图(dmso，100mhz)
图4为柴胡皂苷元d的1h-nmr谱图(dmso，400mhz)
图5为柴胡皂苷元a的tof/ms谱图(扫描范围m/z200～800)
图6为柴胡皂苷元d的tof/ms谱图(扫描范围m/z200～800)
具体实施方式
以下将结合实施例详细描述本发明，但不应解释为本发明的限制。本部分所涉及的仪器及主要药品来源如下：burkeravance-600型核磁共振光谱仪(德国bruker公司)，agilent6230型lc-tof/ms联用系统及agilent1200preparativehplc(美国安捷伦公司)，n-1100d-w旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，bio-tekelx808酶标仪(美国bio-tek宝特公司)，柴胡药材(产自甘肃省陇西县，陕西宝鸡市辰光生物科技有限公司)，诺维信复合植物水解酶viscozymel(山东青岛吉宝生物科技有限公司)，人乳腺癌细胞株sum149、mcf-7、zr-75-1和bt474(江苏南京科佰生物科技有限公司)，基础培养基、胎牛血清、胰岛素(上海普飞生物科技有限公司)。
实施例1柴胡皂苷元a和d的制备
(1)柴胡总皂苷的提取：取北柴胡干燥根药材20kg，粉碎后加200l80v/v％乙醇，调节ph＝8.0，80℃回流提取3次，每次1h，得乙醇提取液。合并3次提取液，减压浓缩至无醇味，浓缩后的柴胡总皂苷提取液为10l，其中柴胡总皂苷的含量为0.11kg/l。根据药材批次的差异，一般柴胡总皂苷的收率在5％～6％。
(2)柴胡皂苷元a和d的酶解制备：取步骤(1)获取的柴胡总皂苷提取物1000ml，加3wt％复合植物水解酶viscozymel30ml，调节ph＝5.0，50℃反应20h。
(3)柴胡皂苷元a和d的分离纯化：柴胡总皂苷酶解液加入1倍量氯仿萃取，共萃取3次，合并萃取液，浓缩干燥，得干燥粉末50g。
(4)制备液相色谱纯化：所得50g干燥粉末用250ml甲醇溶解，prep-hplc分离纯化柴胡皂苷元a和d。
具体操作条件为：cartridgeprep-c18柱(21.2mm×250mm,10μm)；流动相为乙腈-水，梯度洗脱(第0-20min，乙腈体积比由35％匀速变为66％；第20-30min，乙腈体积比由66％匀速变为35％)；流速30ml/min；检测波长254nm。最终分离tr(15min-18min)的组分柴胡皂苷元d以及tr‘(22min-25min)组分柴胡皂苷元a，分别获得柴胡皂苷元a的量为1.1g，纯度为98.5％；柴胡皂苷元d的量为0.8g，纯度为98.1％。
所得单体通过ms、nmr鉴定，参考相关文献(h.ishii,m.nakamura,s.seo,etal.isolation,characterizationandnuclearmagneticresonancespectraofnewsaponinsfromtherootsofbupleurum.falcatuml.chem.pharm.bull.1980,28(8):2367–2383.)并解析其结构，结果见表1～2以及图1～6。结果显示，所得到的单体分别为柴胡皂苷元a和柴胡皂苷元d。
表1柴胡皂苷元a、d的13c-nmr和1h-nmr主要信号归属
表2柴胡皂苷元a、d的tof-ms信息确认
实施例2柴胡皂苷元a和d的抗乳腺癌活性
培养四种人乳腺癌细胞(三阴性sum149，luminala型mcf-7，luminalb型zr-75-1，her2阳性型bt474)，调整细胞密度为5×104个/ml，接种至96孔培养板，置于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。所使用的四种培养液配方如表3所示：
表3
培养四种乳腺癌细胞(basal-like型sum149，luminala型mcf-7，luminalb型zr-75-1，her2阳性型bt474)，调整细胞密度为5×104个/ml，接种至96孔培养板，置于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。设置①试剂空白对照组②肿瘤细胞对照组③紫杉醇阳性对照组④药物组(终浓度分别为80、40、20、15、10、5、2.5、1.25μmol/l)，每组及药物各个剂量组均设6个平行孔。分别置于37℃、5％co2培养箱中培养72小时后，每孔加入mtt液(5g/l)20μl。继续培养4小时，吸去上清液，每孔加入100μldmso溶解结晶。
mtt法测定柴胡皂苷元a.和d的半数抑制率ic50。具体操作为：设置不同浓度给药组，分别置于37℃、5％co2培养箱中培养72小时后，加入mtt液(5g/l)20μl，继续培养4小时，吸去上清液，加入100μldmso溶解结晶，酶标仪波长492nm测定吸光度(od)值，计算不同浓度的化合物对乳腺癌细胞的抑制率ic50。
设置酶标仪波长492nm，测定吸光度(od)值，计算不同浓度的化合物对乳腺癌细胞的抑制率[细胞抑制率％＝1－(加药组od值－调零孔od值)/(对照组od值－调零孔od值)×100]，prism5.0计算药物半数抑制率浓度ic50，结果见表4。
表4mtt法测定柴胡皂苷元a、d及阳性药紫杉醇对各乳腺癌细胞生长的影响(72h半数抑制浓度)
以上实施例显示和描述了本发明的主要特征和优点，仅作为解释本发明的目的。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明范围的前提下，相应的技术和应用范围还会有改进和变化。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。