黄瓜CsERF004基因及其编码蛋白和应用的制作方法

本发明涉及CsERF004基因及其编码蛋白和应用。
背景技术：
：黄瓜是一种以嫩果为食用的大宗蔬菜。在生产中，黄瓜易受多种病原菌的侵染，使其产量和品质受到严重影响。黄瓜霜霉病和棒孢叶斑病是黄瓜生产上的重要病害。病害传播流行速度快，对黄瓜生产威胁极大。长期使用化学药剂进行病害防治，已经导致霜霉病菌和棒孢叶斑病菌产生抗药性。同时大量的农药残留会造成环境污染和危害人类健康等问题。绿色、经济有效的防治方法仍为选育及利用抗病品种。培育单一抗病品种已无法解决病害给黄瓜生产带来的严重影响，多抗品种又极为缺少。国内外对黄瓜棒孢叶斑病的研究基础比较薄弱，研究处于起步阶段，多集中在病原菌生理分化、抗药性及遗传多样性方面，缺少系统的抗病机理方面的研究。黄瓜霜霉病的研究起步虽早，但抗性遗传规律仍存在争议，分子调控机理尚不明了。随着黄瓜基因组测序完成，黄瓜基因组中ERF转录因子也被进行了系统分析。通过与拟南芥和水稻中ERF转录因子的比较分析，黄瓜中共鉴定出103个ERF转录因子，并将其分为由I到X的10个组群。但黄瓜ERF家族基因的功能报道较少，根据研究人员的报道黄瓜ERF基因与调控苦味基因、耐涝性和果实贮藏有关。ERF在黄瓜抗病性方面的研究未见报道。技术实现要素：本发明提供一种黄瓜抗病相关基因CsERF004及其编码蛋白和应用。本发明黄瓜CsERF004基因cDNA的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。本发明黄瓜CsERF004基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本发明黄瓜CsERF004基因在提高黄瓜对霜霉病及棒孢叶斑病的抗性上的应用。本发明黄瓜CsERF004基因依赖水杨酸和乙烯信号途径提高黄瓜抗病性。本发明的有益效果：本发明发现对于黄瓜中CsERF004基因编码的蛋白属于ERF亚组中B-6类蛋白，其与拟南芥中的ESE3相比，具有相似的序列，都含有一个AP2/ERF结构域，能够对植物寄主基因进行转录调控，产生防御反应，同时表现出对霜霉病和棒孢叶斑病病原菌的双抗性。黄瓜CsERF004基因提高黄瓜水杨酸和乙烯的含量并赋予黄瓜对霜霉病和棒孢叶斑病引起的病害产生抗性。从而鉴定该基因在抗病反应中所起的作用，为利用该基因培育黄瓜双抗性能奠定基础。附图说明图1为CsERF004基因PCR扩增产物；图2为PCXSN-CsERF004过量表达载体的PCR检测结果；图3为菌液PCR检测结果；图4为转CsERF004基因的D0401抗性植株的PCR检测结果；图5为黄瓜感病品种D0401过表达CsERF004的T0代株系接种症状照片；图6为过表达CsERF004的T1代植株中乙烯含量分析；图7为过表达CsERF004的T1代植株中水杨酸含量分析；图8为黄瓜抗病品种D9320中不同激素诱导下CsERF004的相对表达水平；图9为黄瓜35S-CsERF004-eGFP表达载体菌液PCR检测鉴定；图10为黄瓜35S-CsERF004-eGFP表达载体双酶切鉴定；图11为CsERF004-eGFP融合蛋白在拟南芥原生质体中定位分析。具体实施方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式黄瓜CsERF004基因cDNA的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。具体实施方式二：本实施方式黄瓜CsERF004基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。ERF为SAR信号途径中重要的转录调控因子，在诱导的植物抗病性中起着十分重要的作用。本发明首次在黄瓜中报道与拟南芥ERF相关基因CsERF004，并通过PCR技术克隆出黄瓜CsERF004cDNA全长。将CsERF004导入黄瓜中，使其过表达，得到转基因后代黄瓜。首次功能验证CsERF004基因过表达明显提高了黄瓜体内自由态水杨酸的含量，在苗期对霜霉病和棒孢叶斑病有着明显的抗性。为减少黄瓜病虫害，提高黄瓜霜霉病和棒孢叶斑病抗病性，提供一种新的解决途径。以下实施例中如无特别说明均为常规方法。实施例1、Trizol法提取黄瓜感病品种‘D0401’的RNA采用Trizol法提取黄瓜叶片总RNA。(1)取100mg新鲜黄瓜叶片组织，加入液氮充分研磨，将粉末转入1.5mL无菌离心管中；(2)加入1mLTrizol，充分震荡，15～30℃静置5min；(3)加入300μL氯仿，剧烈摇荡15s，12000rpm4℃离心15min；(4)取上清移入新的无菌离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，-20℃放置20min，12000rpm4℃下离心15min；(5)弃上清，加入1mL75％DEPC-乙醇，涡旋洗涤10s，7500rpm4℃离心5min(重复操作2次)；(6)弃乙醇，将离心管导致于干净滤纸上晾干；(7)用30μL1‰DEPC水溶解，-80℃保存备用。(8)取1μLRNA，使用SMA3000紫外分光光度计检测提取的RNA质量与浓度，RNA样品检测合格(RNA量≥6μg，浓度≥300ng/μl，2.1≥OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.8)。表明黄瓜‘D0401’RNA提取成功。实施例2、两步法反转录(Toyobo反转录试剂盒)(1)反转录体系如表1：表1试剂使用量总RNA1μL5×RTBuffer2μLRTEnzymeMix0.5μLPrimerMix0.5μLNuclease-freeWater6μLTotal10μL(2)小心混匀，37℃温浴15min，然后98℃加热5min，冰上放置5min终止反应，即获得相应的反转录产物cDNA。实施例3、热启动PCR扩增CsERF004基因根据CsERF004基因中内含子的分布情况，利用引物设计软件Primerpremier5.0设计克隆全长的特异性引物(CsERF004-F，CsERF004-R)。引物序列如下：表2名称引物序列(5’-3’)CsERF004-FATGGCTCGTCCACAACAACGCsERF004-RTTATGTAATAATTTCGAATGATCCGAG(1)PCR克隆反应体系如表3：表3试剂使用量10×PCRBuffer(含20mmol·L-1Mg2+)2μLdNTPs(10mmol·L-1)2μL上游引物(20μmol·L-1)0.5μL下游引物(20μmol·L-1)0.5μLTaq酶(2U)0.3μLcDNA2μLddH2O12.7μL总体系20μL(2)最佳PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，循环数为30个；最后72℃延伸10min，4℃保存。扩增后的产物在含有0.5mg/L溴化乙锭(EthidiumBromide)的1％琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果如图1所示，图1中M：DNAmarker；1：PCR产物。经测序，核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，将该基因命名为CsERF004，全长为591bp。其编码具有序列表中SEQIDNO：2的氨基酸序列的蛋白质。实施例4、PCR扩增产物的回收使用1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下快速切下目的条带，回收CsERF004基因的目的片段，具体方法参照北京全式金胶回收试剂盒说明书进行；(1)切取凝胶：用刀片切取琼脂糖凝胶中的目的基因条带，放入已知重量的离心管中，再次称重，二者之差为切取的凝胶重量；(2)溶解凝胶：加入3倍体积GSB，55℃水浴10min，2-3min震荡1次，至凝胶全部溶解；(3)降至室温后，转移到离心柱内，静置1min后，10000g离心1min，弃掉流出液；(4)清洗DNA：加入650μLWB，12000g离心1min，弃掉流出液；再离心2min；(5)洗脱DNA：将离心柱置于一个干净离心管中，开盖静置1min，加入40μL预先预热(65℃)的EB，静止1min后10000g离心1min，将洗脱的DNA于-20℃保存备用。实施例5、PCR扩增片段的纯化(使用DNA纯化试剂盒)(1)进行琼脂糖凝胶电泳，分离要纯化的片段；(2)用干净的无菌手术刀切下目的DNA条带放入预称重的1.5mLeppendorf管；(3)每0.1g琼脂糖凝胶需加入200μLS1溶液；(4)于50℃温育，直至琼脂糖完全融解；(5)每5μL(不足5μL，以5μL计)DNA需加入5μLDNA结合液(玻璃粉悬液)，轻轻颠倒混匀，冰上放置10min；(6)室温6000rpm离心20s；(7)弃上清，加700μL乙醇洗液，轻轻抽吸，使玻璃粉悬浮，冰上放置5min；(8)重复(6)、(7)步，6000rpm，离心20s；弃上清，小心去除全部残液；(9)加30-50μLTE，轻轻吹打悬浮玻璃粉，50℃温育10min；(10)室温6000rpm离心20s，吸上清至新的eppendorf管，于4℃或-20℃保存备用。实施例6、连接pEASY-T3载体与阳性克隆筛选将CsERF004基因回收产物与pEASY-T3克隆载体进行连接。反应程序16℃16h。(1)连接反应体系如表4：表4将5μL连接产物全部加入至刚刚解冻的50μLTransl-T1感受态细胞中，冰浴30min；42℃热激30s，立即置于冰上2min；加1mL液体LB后，200rpm、37℃培养60min；200μL菌液均匀涂板，37℃过夜培养。(2)酶切反应体系如表5：表5Buffer1μLEcorI1μL质粒3μLddH2O5μL总体系10μL用枪头挑取白色单个菌落至液体LB(含有Amp)的离心管中，200rpm/min、37℃震荡培养6h，进行PCR检验及EcoRI酶切验证。PCR反应体系同CsERF004基因克隆反应体系，将模板更换为菌液。质粒提取方法参照质粒小量提取试剂盒(EM101)说明书(北京全式金生物技术有限公司)进行。将鉴定获得的CsERF004基因的阳性菌液，送至苏州金唯智有限公司进行测序。实施例7、植物过量表达载体的构建将上述纯化的CsERF004基因全长序列，分别PCR扩增pEASY-T3-CsERF004质粒，用XcmI单酶切PCXSN-1250载体。T4连接酶连接目的片段与载体，连接产物转入Transl-T1感受态细胞。通过菌液PCR及测序鉴定出构建成功的PCXSN-CsERF004过量表达载体。PCXSN-CsERF004过量表达载体的PCR检测结果如图2所示，图2中M：DNAmarker；1-8：PCR产物。实施例8、植物表达载体转化根癌农杆菌LBA4404采用冻融法将PCXSN-CsERF004质粒转入到根癌农杆菌LBA4404中。(1)感受态细胞的制备1)将根癌农杆菌LBA4404在YEB培养基(含利福平)上划线，28℃培养48h；2)挑取单菌落于YEB液体培养基(含利福平)中，28℃，200r/mim震荡过夜培养，直至菌液的OD600＝0.5；3)将菌液分装，冰浴10min；4)12000rpm离心30s，弃上清，20mM预冷CaCl2悬浮，冰浴20min；5)12000rpm离心30s，弃上清，100μL20mM预冷CaCl2重悬，-80℃保存。(2)表达载体转化农杆菌EH1051)将10μL重组质粒加入到100μL农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀后，冰上静置10min；2)液氮速冻5min，37℃水浴锅中热激2.5min；3)加入1mL液体YEB培养基，在28℃，200rpm振荡培养3.5h；4)6000rpm离心1min，弃上清；5)重悬菌液，涂在含有50mg/mLKan和50mg/mLRif的YEB固体培养基上，28℃恒温培养箱中培养36-48h。(3)阳性克隆的鉴定挑取单菌落并以菌液为模板进行PCR鉴定。将转化成功的菌液置于-80℃冰箱保存，用于黄瓜遗传转化。菌液PCR检测结果如图3所示，图3中M：DNAmarker；1-5：PCR产物。实施例9、农杆菌介导的黄瓜遗传转化方法将过量表达载体PCXSN-CsERF004转入感病品种D0401。(1)种子发芽将黄瓜种子置于55-65℃水中浸泡1h，去种皮，70％酒精消毒1min，灭菌水清洗1遍，3％的次氯酸钠消毒10min，灭菌水清洗5遍，平铺到发芽培养基上，28℃黑暗培养1-2d；(2)农杆菌的活化将农杆菌按1∶100的比例加入50mLYEB(含Rif和Kan)液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养36-48h。6000rpm离心10min，弃上清，1/2MS缓冲液重悬，菌液OD600＝0.2-0.3；(3)侵染子叶节在无菌操作台中，用小刀将黄瓜种子子叶分开，去除全部下胚轴及生长点，置于重悬的菌液中，28℃，200rpm侵染12-15min左右；(4)子叶节共培养与分化培养将侵染后的子叶节置于共培养培养基中，28℃黑暗培养1-2d。长出白色斑点时转入分化培养基中，25℃，光照16h，黑暗8h条件下培养28d左右。(5)植株生根培养与驯化在无菌操作台中，用小刀切下分化芽，移入生根培养基中。5-7d左右进行移栽，注意保湿。置于28/18℃，光照16/8h的光照培养箱中培养。完成驯化后，移栽到温室中定值。实施例10、转基因植株的鉴定采用CTAB法和Trizol法分别提取黄瓜叶片DNA和RNA，进行PCR和qRT-PCR鉴定。转CsERF004基因的D0401抗性植株的PCR检测结果如图4所示，图4中M为DNAmarker，K为空载体，+为阳性对照，-为水对照，C为阴性对照。实施例11、转基因黄瓜的接种鉴定(1)采用离体接种法对转基因黄瓜T0和T1代进行接种鉴定单一接种霜霉病菌：利用移液枪将配制好的浓度为5000个孢子囊/mL的霜霉病菌菌悬液滴在黄瓜第一片真叶上，每片真叶30滴，每滴10μl。其中霜霉病菌已经在文献《黄瓜霜霉病菌保存方法》(张艳菊，植物病理学报，2007)中公开。单一接种棒孢叶斑病菌：利用移液枪将配制好的浓度为1×105个孢子/mL的棒孢叶斑病菌菌悬液滴在黄瓜第一片真叶上，每片真叶30滴，每滴10μl。其中棒孢叶斑病菌已经在文献《黄瓜棒孢叶斑病菌基因组ISSR分子指纹分析》(李淑菊，王惠哲，分子植物育种2015)中公开。同时接种棒孢叶斑病菌和霜霉病菌：利用移液枪将配置好的棒孢叶斑病菌和霜霉病菌菌悬液交叉滴在黄瓜第一片真叶上，每种病原菌各15滴，每滴10μl。培养条件均为接种后保湿24h，26/18℃昼夜温度，16/8h光周期。设无菌水为对照。接种7d进行病害调查，叶片病害症状使用NikonD5500相机拍摄。(2)病原菌悬浮液的配制采集黄瓜霜霉病和黄瓜棒孢叶斑病病叶。用毛刷将霜霉病菌分别刷置装有无菌水的烧杯中，利用血球计数板计数配制接种悬浮液。将黄瓜棒孢叶斑病菌培养于PDA培养基，28℃恒温黑暗培养7d。用无菌水将分生孢子冲下，无菌纱布过滤菌丝，利用血球计数板计数配制孢子悬浮液。实施例12、霜霉病和棒孢叶斑病病情分析利用PCR及qPCR技术，对转基因株系进行鉴定，获得13株CsERF004过表达株系，其中E4、E7和E9表达量最高，对T0代E4、E7及E9分别接种霜霉病菌及棒孢叶斑病菌7d后，叶片发病症状明显轻于野生型植株叶片(图5为黄瓜感病品种D0401过表达CsERF004的T0代株系接种症状照片，图5中C.cassiicola：单一接种棒孢叶斑病菌；P.cubensis：单一接种霜霉病菌，E4、E7、E9：T0代过表达CsERF004株系中表达量最高的3株)。针对过表达CsERF004的T1代植株进行抗病性鉴定。与野生型植株相比较，过表达植株接种霜霉病菌后病情指数由90.7分别降到了58.7、62.7和60.0；接种棒孢叶斑病菌后病情指数由85.3分别降到了49.3、52.0和56.0(表6)。结果表明过表达CsERF004能提高黄瓜对霜霉病及棒孢叶斑病的抗性。表6T1代过表达CsERF004植株抗病性鉴定实施例13、激素诱导下CsERF004表达模式的分析黄瓜品种D9320在两叶一心时进行激素诱导处理。(1)MeJA(茉莉酸)处理：喷施浓度为100μMMeJA(溶解介质0.01％乙醇)，喷施后6h、12h、24h取材，设无菌水为对照；(2)SA(水杨酸)处理：喷施浓度为1mMSA(溶解介质无菌水)，喷施后6h、12h、24h取材，设无菌水为对照；(3)ET(乙烯)处理：喷施浓度为1MmET(将2ml40％乙烯利和1gNaHCO3溶解在200ml无菌水)，喷施后6h、12h、24h取材，设无菌水为对照。植物抗病反应中涉及激素信号转导途径，ERF转录因子响应多种激素诱导。本发明对抗病品种D9320进行了SA、MeJA及ET的诱导处理。结果显示，在SA的诱导下，CsERF004显著上调表达，在12h达到高峰，表达倍数比对照增加了5.57倍；在ET的诱导下，CsERF004也能显著性上调表达，在12h达到高峰，表达倍数比对照增加了6.24倍；在MeJA的诱导下，CsERF004的表达没有显著性变化(如图8所示，图8中□表示空白对照组，■表示药物处理组)。结果表明，CsERF004能够被SA和ET诱导上调表达，推测其可能参与SA和ET的信号途径，也可能是SA与ET信号途径交叉中的连接因子。实施例14、转基因黄瓜激素含量的测定(1)转基因黄瓜水杨酸含量的测定将转基因黄瓜新鲜叶片经液氮处理，置于干冰中运送至中国上海酶联生物科技有限公司。由该公司利用植物水杨酸酶联免疫试剂盒进行水杨酸含量测定。(2)转基因黄瓜乙烯含量的测定采用气相色谱法进行乙烯(ETH)含量测定。1)试验前准备多个6mL密封管，编码顺序，分别称重；2)取回黄瓜茎尖后，放入已经准备好的小管中，再次称重；3)将小管放在避光处，25℃恒温放置14h；4)14h后，用标准针管抽取25nL气体；5)将气体注入气相色谱仪测定乙稀含量。色谱柱为RTX-1(毛细管柱)30.0m×250μrn×0.25μm，进样口(SPL)100℃；柱温60℃；氢离子火焰(FID)为130℃；氮气流速30mL/min；氢气流速为30mL/min；空气流速为400mL/min；压力为113.5kPa；保留时间为2.5min。气样进样流速为1.00mL/min，每个温度重复测定3次。利用气相色谱法与酶联免疫法对过表达CsERF004的T2代植株进行了乙烯及水杨酸含量的测定。过表达CsERF004的T1代植株中乙烯含量如图6所示，过表达CsERF004的T1代植株中水杨酸含量如图7所示。采用studemt检验进行两个样本之间比较，柱形上方的“*”代表对应柱值与相邻对照柱值差异显著，“**”代表对应柱值与相邻对照柱值差异极显著。由图6和图7可知，过表达CsERF004植株与野生型植株相比，乙烯含量与水杨酸含量均显著性升高。过表达CsERF004植株的乙烯含量超出了野生型植株的1倍，水杨酸的含量超出了野生型植株约0.5倍。过表达CsERF004植株中SA和ET含量显著升高，表明CsERF004可能依赖水杨酸和乙烯信号途径提高黄瓜抗病性。实施例15、CsERF004亚细胞定位的分析(1)黄瓜CsERF004基因瞬时表达载体构建以黄瓜品种D9320叶片的cDNA为模板，使用带有酶切位点BamHI和SmalI的特异性引物进行PCR扩增，(引物：GFP-CsERF004-F：5′-GGATCCATGGCTCGTCCACAACAACG-3′；GFP-CsERF004-R：5′-GGACCCGGGTTGTAATAATTTCGAATGATCC-3′)，得到去掉终止密码子的CsERF004开放读码框，将去掉终止密码子的CsERF004基因开放读码框回收产物与pEASY-T3克隆载体进行连接，得到pEASY-T3-CsERF004。将pEASY-T3-CsERF004及瞬时表达载体质粒pGII-eGFP快速内切酶BamHI和SmalI双酶切，胶回收得到纯化产物，将基因目的片段与载体片段用T4连接酶连接，得到融合表达载体35S-CsERF004-eGFP，将得到的瞬时表达载体进行菌液PCR和双酶切鉴定，如图9和图10所示，图9中M为DNAmarker，1为菌液PCR检测，图10中M为DNAmarker，2为质粒双酶切鉴定。表明35S-CsERF004-eGFP载体构建成功。转化感受态细胞Transl-T1并鉴定测序。其中质粒pGII-eGFP已经在以下文章中公开。MengJingjing，QinZhiwei*，ZhouXiuyan，XinMing.AnATP-bindingcassettetransportergenefromCucumissativusL.，CsABC19，isinvolvedinpropamocarbstressinArabidopsisthaliana.Plantmolecularbiologyreport.2016.DOI：10.1007/s11105-016-0976-0。(2)提取拟南芥的原生质体细胞(3)35S-CsERF004-eGFP质粒转化拟南芥原生质体将CsERF004-GFP融合表达载体和hGFP空载体分别导入拟南芥原生质体中，在激光共聚焦显微镜下观察CsERF004-GFP融合蛋白的亚细胞定位情况。CsERF004-GFP融合蛋白只在原生质体核中表达(如图11所示)。说明CsERF004属于核蛋白，是一个在细胞核中行使主效功能的转录因子。序列表<110>东北农业大学<120>黄瓜CsERF004基因及其编码蛋白和应用<160>6<210>1<211>591<212>DNA<213>黄瓜属（Cucumis）<220><223>黄瓜CsERF004基因<400>1atggctcgtccacaacaacgctatcgtggcgttcgccaacgacattggggctcttgggtc60tccgaaattcgccaccctctattgaagacgagaatatggttaggaacgtttgagacggca120gaggatgcagctcgagcttatgacgaggcagcacggttgatgtgcggtccaaaagcacga180accaactttccatacaatccgaacgaccaacagtcgtcgtcgtcattctcctcctcctcc240aagcttctctctgccgcattgatagagaaattacataaatgtcacttagcttcactccaa300attgcaaaacaacacgtccacaaacaacatgctggattcgagccgagctacctcgcatac360agtggatcacctccaccgatcattaccggagccaccactagtcaatgggcatcagatgaa420acgtgggtctattccaacaaaggtgatcaaatggagatgaataacaataacaataattat480aataacaacattcatcatcaacaatgccaacttgaacctcttgaagatgatcatatcgaa540caaatgatacaagagctgctagacctcggatcattcgaaattattacataa591<210>2<211>196<212>PRT<213>黄瓜属（Cucumis）<220><223>黄瓜CsERF004基因编码蛋白<400>2MetAlaArgProGlnGlnArgTyrArgGlyValArgGlnArgHis51015TrpGlySerTrpValSerGluIleArgHisProLeuLeuLysThr202530ArgIleTrpLeuGlyThrPheGluThrAlaGluAspAlaAlaArg354045AlaTyrAspGluAlaAlaArgLeuMetCysGlyProLysAlaArg505560ThrAsnPheProTyrAsnProAsnAspGlnGlnSerSerSerSer657075PheSerSerSerSerLysLeuLeuSerAlaAlaLeuIleGluLys808590LeuHisLysCysHisLeuAlaSerLeuGlnIleAlaLysGlnHis95100105ValHisLysGlnHisAlaGlyPheGluProSerTyrLeuAlaTyr110115120SerGlySerProProProIleIleThrGlyAlaThrThrSerGln125130135TrpAlaSerAspGluThrTrpValTyrSerAsnLysGlyAspGln140145150MetGluMetAsnAsnAsnAsnAsnAsnTyrAsnAsnAsnIleHis155160165HisGlnGlnCysGlnLeuGluProLeuGluAspAspHisIleGlu170175180GlnMetIleGlnGluLeuLeuAspLeuGlySerPheGluIleIle185190195Thr196<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物CsERF004-F<400>3atggctcgtccacaacaacg20<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物CsERF004-R<400>4ttatgtaataatttcgaatgatccgag27<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物GFP-CsERF004-F<400>5ggatccatggctcgtccacaacaacg26<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物GFP-CsERF004-R<400>6ggacccgggttgtaataatttcgaatgatcc31当前第1页1 2 3