一种海南龙血树查尔酮异构酶DcCHIL1及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1及其编码基因和应用。

背景技术：

类黄酮化合物是一类小分子次生代谢物，广泛参与在植物花色形成、紫外线保护、植物育性、生长素运输、抵抗渗透胁迫、细胞周期调控等生物学过程。此外，类黄酮化合物还是一种生物活性很强的抗氧化剂，具有调节机体免疫力、抗氧化、抗衰老以及抵抗病毒等医疗价值。查尔酮异构酶(chalconeisomerase,chi)是类黄酮生物合成途径中的关键限速酶,催化查尔酮异构化为黄烷酮，黄烷酮继而转化为各种类型的类黄酮。chi超家族包含四种类型蛋白：ⅰ型普遍存在于维管植物中，负责类黄酮的合成；ⅱ型主要存在豆科植物中，参与异黄酮合成；ⅲ型是广泛存在于陆生植物中的脂肪酸结合蛋白；已发现的ⅳ型蛋白不具有查尔酮异构酶活性，但可作为增强子，促进类黄酮合成。

血竭是一种的传统名贵中药，是一种红色树脂，有“活血之圣药”的美誉。现代药理学研究表明，血竭具有促进血液循环、止血功效、降血糖、血脂、增强免疫力、抗菌、促进皮肤修复、抗痉挛、抗炎、镇痛、抗糖尿病、抗肿瘤等多种药理作用。海南龙血树是国产血竭的主要基源植物，其血竭主要化学成分为类黄酮化合物。目前对血竭的研究集中在化学成分和药理活性，对血竭的生物合成途径及诱导产生机制了解不多。

目前已经从多种植物中克隆到chi基因，如拟南芥、大豆、苹果、葡萄等。利用基因工程技术将chi基因导入植物中，能够促进类黄酮的生物合成，具有开发应用前景。如将矮牵牛chi基因导入番茄中，转基因番茄果皮中黄酮类含量提高78倍，果肉中黄酮醇增加了21倍；将水母雪莲chi基因导入新疆雪莲后，转基因雪莲发根中总黄酮量可提高4倍。但对于海南龙血树chi基因的克隆、表达模式、蛋白表达及在类黄酮生物合成中的作用尚不清楚。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1基因以及海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1，用以解决现有技术无法提高海南龙血树中类黄酮含量的不足。

为实现上述目的，本发明方法以通过以下技术方案予以实现：

本发明首先提供一种海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1，该基因的核苷酸序列包括：

(a)seqidno:1所示的核苷酸序列；或

(b)seqidno:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

(c)与(a)或(b)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供一种海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1，其氨基酸序列如seqidno:2所示；或为seqidno:2经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成具有同等功能的氨基酸序列。

海南龙血树是国产血竭的主要基源植物，其血竭主要化学成分是类黄酮。本发明针对海南龙血树类黄酮合成和调控基础研究的薄弱现状，首次克隆得到海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1基因以及查尔酮异构酶dcchil1，利用生物技术将该基因转入海南龙血树中可以提高海南龙血树类黄酮积累和血竭的产量，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。

所述的海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1的克隆方法，包含如下步骤：

(1)设计特异引物p1正向引物和p2反向引物；

(2)以海南龙血树茎干第一链cdna为模板对dcchil1基因的cds序列进行pcr扩增；

(3)将扩增获得的pcr产物连接pmd18-t载体，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆并测序。

优选地，步骤(1)中所述的p1正向引物的序列如seqidno:3所示，所述p2反向引物的序列如seqidno:4所示。

优选地，步骤(2)中所述的pcr扩展条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，70℃延伸1min，共35个循环；70℃延伸8min。

本发明还提供一种重组表达载体或表达盒，所述重组表达载体或表达盒含有权利要求1所述的海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1。

本发明还提供一种转基因细胞系或重组菌，所述转基因细胞系或重组菌含有权利要求1所述的海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1。

本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求1所述的海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1。

本发明还提供上述海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1的应用，将该基因应用于真核或原核表达。

本发明还提供海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1的应用，将该基因通过转基因技术用于提高海南龙血树类黄酮积累和血竭的产量。

本发明方法具有如下优点：本发明提供了一种全新的基因：海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1，该基因序列能够编码海南龙血树类黄酮生物合成途径中关键酶查尔酮异构酶dcchil1；将该基因转入大肠杆菌进行诱导表达，获得dcchil1蛋白具有查尔酮异构酶活性，能将查尔酮转变为黄烷酮。所述的海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1可以调控海南龙血树类黄酮生物合成，利用生物技术将该基因转入海南龙血树中可以提高海南龙血树类黄酮积累和血竭的产量，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。

附图说明

图1为海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1的系统进化分析图。

图2为海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1的原核表达和活性分析图。

其中，a为海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1的原核表达和蛋白纯化；泳道1-4：iptg诱导0h、1h、3h、5h后海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1蛋白表达；泳道5为纯化的海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1；b为海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1的活性分析；a,2',4,4',6'-四羟基查耳酮(nc)标准品；b,4',5,7-三羟基黄酮(na)标准品；c：海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1与柚皮素查尔酮反应的hplc结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1的克隆

通过对前期海南龙血树茎干转录组测序结果进行分析，设计特异引物p1正向引物5′-atgggctctgagatagtgatggtg-3′(seqidno:3)和p2反向引物5′-gcagcagataacatagtcccaag-3′(seqidno:4)，以海南龙血树茎干第一链cdna为模板对dcchil1基因的cds序列进行pcr扩增，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，70℃延伸1min，共35个循环；70℃延伸8min。将扩增获得的pcr产物连接pmd18-t载体，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆并测序，获得海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1的全长编码序列642bp。

将上述含有海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1的重组载体命名为pmd18-dcchil1。

实施例2海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1的序列分析

海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1的全长开放阅读框为642bp，详细序列见seqidno:1。根据开放阅读框序列推导出dcchil1的氨基酸序列，共213个氨基酸残基(详细序列见seqidno:2)，分子量为23.8kda，理论等电点为4.97。

分别从拟南芥、玉米等不同植物中，挑取31个不同类别的chi序列(植物物种和chi蛋白序列号详见图1)作为模板，来分析dcchil1的系统进化地位。利用mega7软件对这32个chi序列进行多重序列比对，并构建系统发育树(如图1)。从图上可以清楚地看出，这些chi可以分为4个分支，dcchil1与植物ⅳ型chi成员聚在一起，属于ⅳ型chi。

实施例3pet28a-dcchil1重组表达载体的构建

利用premier5软件分析海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1编码区的限制性内切酶酶切位点，确定用于构建载体用的两个限制性内切酶为ecori和sali。设计海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1编码区引物pe1：5′-gcgaattcatgggctctgagatagtgatggtg-3′(正向引物，划线为ecori酶切位点)和pe2：5′-gcgtcgacagcagcagataacatagtccc-3′(反向引物，划线为sali酶切位点)，以pmd18-dcchil1(实施例1制备得到)为模板进行pcr扩增，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，70℃延伸1min，共35个循环；70℃延伸8min。将扩增获得的pcr产物连接pmd18-t载体，获得pmd18-edcchil1重组质粒，经测序确定目的序列的正确性。37℃水浴中ecori和sali双切pmd18-edcchil1重组质粒，回收650bp左右的目的片段。将该片段插入pet28a质粒的ecori和sali酶切位点之间，获得重组载体，经酶切和测序鉴定，确认插入的序列是正确的。把构建含有海南龙血树查尔酮异构酶基因dcchil1编码区序列的表达载体命名为pet28a-dcchil1。

实施例4dcchil1的诱导表达和蛋白纯化

将表达载体质粒pet28a-dcchil1(实施例3制备得到)转化到大肠杆菌bl21(de3)中，筛选并鉴定重组子。将重组子接种到含卡那霉素(终浓度50μg/ml)的lb培养基中，37℃震荡培养过夜后，按1：100(v/v)比例转入新的培养基中，培养至od600＝0.6-0.8时，加入iptg至终浓度为1mm，培养1h、3h和5h后离心收集菌体，以未加iptg培养基为对照，提取细胞总蛋白进行12％sds-paged电泳检测。结果表明dcchil1在大肠杆菌中得到高效异源表达，且表达蛋白(海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1)的表观分子量与理论分子量相近，约28kda。融合蛋白以包涵体的形式出现，蛋白的分离参照merck公司的proteinrefoldingkit说明书进行，蛋白产物(海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1)经镍柱纯化后(具体方法参照mn公司的protinoni-ntacolumns产品说明书)为一清晰单一条带，与预期大小相符，可用于体外酶活分析。

实施例5重组蛋白的活性分析

利用hplc法测定重组蛋白(即实施例4制备得到的蛋白产物海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1)的活性。酶活反应体系为200μl，包含重组蛋白10μl，底物2',4,4',6'-四羟基查耳酮(5mm)2μl,tris-hcl(100mm,ph7.5)补足200μl。反应条件：30℃水浴5min，加入200μl的乙酸乙酯来终止反应。加入乙酸乙酯后混匀，10000rmp离心10min，溶液呈分层状态，取上部乙酸乙酯部分，重复萃取两次，用真空泵挥干乙酸乙酯，并加入100μl的色谱甲醇，混匀。利用hplc(highperformanceliquidchromatography)进行体外酶活测定。吸取上述反应物上样，上样量系统默认20μl。柱温40℃，流速0.8ml/min，检测波长270nm。结果显示重组蛋白(海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1)表现出能将所有的底物2',4,4',6'-四羟基查耳酮完全转化成产物4',5,7-三羟基黄酮的能力(如图2所示)，这说明重组蛋白(海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1)具有查尔酮异构酶的活性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

sequencelisting

<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120>一种海南龙血树查尔酮异构酶dcchil1及其编码基因和应用

<130>

<160>4

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