本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及一种cas9核酸酶q920p及用途。
背景技术：
：：自从人类基因组计划(humangenomeproject)和dna元件百科全书(encyclopediaofdnaelements)项目的完成，科学家们分析和鉴定了大量的基因组中的基因和dna调控元件[1,2]。在基因表达调控中起重要作用的dna调控元件包括启动子、增强子、沉默子和绝缘子等。然而，多数调控元件的功能并没有得到实验的验证和阐明[2-8]。探索基因和dna调控元件的功能，可以通过遗传学dna片段编辑来进行研究。早期的基因编辑和基因功能修饰是通过基因转座和转基因实现的[9-14]。伴随测序技术的发展反向遗传学被应用于对基因组进行特定的突变[15,16]。特别是依赖于同源重组的基因打靶小鼠迅速地被应用到科学研究中[15,17,18]。此外，在小鼠和斑马鱼中dna片段的反转和重复被应用于去研究特定的基因组结构变化[19-24]。近几年，源于细菌和古菌的ⅱ型成簇规律间隔短回文重复系统[clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(crispr)/crispr-associatednuclease9(cas9)，crispr/cas9]是新兴基因组编辑技术[25-27]，由于它设计简单和操作方便，迅速地被应用到真核基因组编辑。我们利用crispr/cas9系统在人细胞系和小鼠中实现了dna片段遗传编辑(删除、反转和重复)[28]。通过cas9和两个sgrnas在基因组中进行两个位点靶向断裂后在ctip等蛋白参与的修复系统作用下可以实现dna片段的删除、反转(倒位)、重复、易位和插入(如果提供供体)等[29-32]。通过对dna片段编辑的遗传操作，能够用来研究原钙粘蛋白和珠蛋白的基因表达调控和三维基因组结构[28,31-33]。目前可以通过crispr/cas9系统实现dna片段的编辑，但是对于深入研究特定dna区段的精准功能，有效地实现dna片段的精准遗传编辑的cas9核酸酶还有待发现。技术实现要素：为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种cas9核酸酶及用途。为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种cas9核酸酶(cas9-q920p)，具有cas9核酸酶活性，适用于crispr/cas9系统，所述cas9核酸酶(cas9-q920p)是将野生型cas9核酸酶第920位谷氨酰胺突变成脯氨酸获得。优选地，与野生型cas9核酸酶相比，所述cas9核酸酶(cas9-q920p)对目的基因组dna片段进行切割时产生的突出断裂末端与钝断裂末端的比例不同。优选地，所述野生型cas9核酸酶为spcas9。进一步地，所述野生型cas9核酸酶的氨基酸序列如seqidno.7所示。优选地，所述cas9核酸酶(cas9-q920p)含有如seqidno.9所示的氨基酸序列。优选地，所述cas9核酸酶(cas9-q920p)的氨基酸序列如seqidno.9所示。本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，其编码所述cas9核酸酶(cas9-q920p)。本发明的第三方面，提供一种表达载体，其含有前述多核苷酸。本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其被前述表达载体所转化。本发明的第五方面，提供一种制备所述cas9核酸酶(cas9-q920p)的方法，包括步骤：构建含有cas9核酸酶(cas9-q920p)编码多核苷酸的表达载体，然后将所述表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的cas9核酸酶(cas9-q920p)。本发明的第六方面，提供前述cas9核酸酶(cas9-q920p)或其编码多核苷酸或含有所述编码多核苷酸的表达载体用于基因组dna片段编辑或用于制备基因组dna片段编辑工具的用途。优选地，所述编辑包括单位点编辑和多位点编辑。所述多位点编辑的编辑位点数为两个及以上。优选地，所述编辑的方式包括突变、删除、反转或倒位、重复、易位或插入。本发明的第七方面，提供一种基因组dna片段编辑工具，所述基因组dna片段编辑工具为crispr/cas9系统，所述crispr/cas9系统包括前述cas9核酸酶(cas9-q920p)或其编码多核苷酸或含有所述编码多核苷酸的表达载体。优选地，所述crispr/cas9系统包括前述cas9-q920p和针对目的dna片段的一个或多个sgrna。所述多个是指两个及以上。本发明的第八方面，提供一种基因组dna片段编辑方法，采用前述cas9核酸酶(cas9-q920p)以及与之配合的一个或多个sgrna，利用crispr/cas9系统对待编辑的基因组dna片段进行编辑。优选地，所述编辑包括单位点编辑和多位点编辑。所述多位点编辑的编辑位点数为两个及以上。优选地，所述编辑的方式包括突变、删除、反转或倒位、重复、易位或插入。优选地，将含有前述cas9核酸酶(cas9-q920p)编码多核苷酸的表达载体以及与之配合的一个或多个sgrna一同转入细胞中，对待编辑的基因组dna片段进行编辑。本发明的第九方面，提供一种基因组dna片段单位点编辑方法，利用crispr/cas9系统，采用如权利要求1所述的cas9核酸酶(cas9-q920p)对dna双链进行切割产生突出断裂末端，通过细胞自身修复系统，以补平连接的方式加入与突出断裂末端互补的碱基。所述基因组dna片段单位点编辑方法可以改变单位点编辑时碱基突变的特征。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的cas9核酸酶(cas9-q920p)，适用于crispr/cas9系统，所述cas9核酸酶(cas9-q920p)含有如seqidno.9所示的氨基酸序列，所述cas9核酸酶(cas9-q920p)与野生型cas9核酸酶相比，对目的基因组dna片段进行切割时产生的突出断裂末端及钝断裂末端的比例相对于野生型cas9核酸酶不同。采用所述cas9核酸酶(cas9-q920p)对dna双链进行切割可产生突出断裂末端，通过细胞自身修复系统，以补平连接的方式可加入与突出断裂末端互补的碱基，能够实现对基因组dna片段的特定位置加入特定碱基的精准编辑。附图说明图1a：cas9在两个sgrnas介导下对dna双链进行切割产生四个断裂末端，这些断裂末端在细胞修复系统的作用下产生dna片段删除、反转和重复。图1b：针对hs51位点的dna片段删除、反转和重复情况。图1c：dna片段删除接头处存在“g”的加入。图1d：dna片段重复接头处存在“t”的加入。图1e：dna片段下游反转接头处存在“a”、“g”和“ag”的加入。图1f：针对这两个特定序列的sgrnas，cas9切割方式比例特征。图2a：cas9核酸酶结构示意图。图2b：β-globinre2位点进行dna片段编辑的两个sgrnas的示意图。图2c：通过检测dna片段重复接头连接情况统计出各cas9核酸酶在sgrna1的介导下对基因组dna片段进行切割时所产生的各种切割末端的占比。图2d：针对上游sgrna1，cas9以及cas9突变体对目的dna片段的切割情况。图2e：通过检测dna片段删除接头连接情况统计出各cas9核酸酶在sgrna2的介导下对基因组dna片段进行切割时所产生的各种切割末端的占比。图2f：针对下游sgrna2，cas9以及cas9突变体对目的dna片段的切割情况。图2g：cas9以及cas9突变体在dna片段反转一侧接头处碱基加入的实际和预测比例。图3a：在stm位点，针对上游sgrna1，cas9以及cas9突变体对目的dna片段的切割情况。图3b：在stm位点，针对下游sgrna2，cas9以及cas9突变体对目的dna片段的切割情况。具体实施方式一、cas9核酸酶本发明的cas9核酸酶(cas9-q920p)，具有cas9核酸酶活性，适用于crispr/cas9系统，所述cas9核酸酶(cas9-q920p)是将野生型cas9核酸酶第920位谷氨酰胺突变成脯氨酸获得。所述cas9核酸酶(cas9-q920p)与野生型cas9核酸酶相比，对目的基因组dna片段进行切割时产生的突出断裂末端与钝断裂末端的比例不同。进一步地，所述野生型cas9核酸酶为spcas9。进一步地，所述野生型cas9核酸酶的氨基酸序列如seqidno.7所示。进一步地，所述cas9核酸酶(cas9-q920p)含有如seqidno.9所示的氨基酸序列，本发明的一些实施方式中，例举了所述cas9-q920p的氨基酸序列如seqidno.9所示。二、编码cas9核酸酶的多核苷酸编码所述cas9核酸酶(cas9-q920p)的多核苷酸，可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。编码所述cas9核酸酶(cas9-q920p)的多核苷酸，可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(j.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。包括但不限于重组dna技术、化学合成等方法。本发明的一些实施方式中，例举了编码所述cas9核酸酶(cas9-q920p)的多核苷酸如seqidno.10所示。三、表达载体所述表达载体含有编码所述cas9核酸酶(cas9-q920p)的多核苷酸。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述表达载体。这些方法包括重组dna技术、dna合成技术等。可将所述cas9核酸酶(cas9-q920p)的dna有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mrna合成进而表达蛋白。四、宿主细胞所述宿主细胞被表达所述cas9核酸酶(cas9-q920p)的表达载体所转化。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门菌、李斯特细菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos.293细胞、或bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。五、制备cas9核酸酶(cas9-q920p)的方法制备前述cas9核酸酶(cas9-q920p)的方法，包括步骤：构建含有cas9核酸酶(cas9-q920p)编码多核苷酸序列的表达载体，然后将所述表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的cas9核酸酶(cas9-q920p)。本领域技术人员可根据cas9核酸酶(cas9-q920p)的性质来选择合适的表达载体和宿主细胞。六、cas9核酸酶(cas9-q920p)或其编码多核苷酸或含有所述编码多核苷酸的表达载体的用途本发明的cas9核酸酶(cas9-q920p)或其编码多核苷酸或含有所述编码多核苷酸的表达载体可用于基因组dna片段编辑或用于制备基因组dna片段编辑工具。进一步地，所述编辑包括单位点编辑和多位点编辑。所述多位点编辑的编辑位点数为两个及以上。所述编辑的方式包括突变、删除、反转或倒位、重复、易位或插入。七、基因组dna片段编辑工具本发明的基因组dna片段编辑工具可以是crispr/cas9系统，所述crispr/cas9系统包括前述cas9核酸酶(cas9-q920p)或其编码多核苷酸或含有所述编码多核苷酸的表达载体。进一步地，所述crispr/cas9系统还包括针对目的dna片段的一个或多个sgrna。所述sgrna为针对目的dna片段所设计，在sgrna(single-guiderna)的介导下，cas9-q920p能够在pam(protospaceradjacentmotif)位点上游对dna双链进行切割，形成dna双链断裂，通过细胞自身修复系统，完成dna片段的精准编辑。针对目的基因的sgrna可以是一个或两个及以上。当sgrna是一个的时候，可以实现对目的dna片段的单位点编辑，当sgrna是两个及以上的时候，可以实现对目的dna片段的多位点编辑。八、基因组dna片段编辑方法本发明的基因组dna片段编辑方法，采用前述cas9核酸酶(cas9-q920p)以及与之配合的一个或多个sgrna，利用crispr/cas9系统对待编辑的基因组dna片段进行编辑。所述编辑包括单位点编辑和多位点编辑。所述多位点编辑的编辑位点数为两个及以上。当sgrna是一个的时候，可以实现对目的dna片段的单位点编辑，当sgrna是两个及以上的时候，可以实现对目的dna片段的多位点编辑。进一步地，可将前述cas9核酸酶(cas9-q920p)编码多核苷酸的表达载体以及与之配合的一个或多个sgrna一同转入细胞中，对待编辑的基因组dna片段进行编辑。九、基因组dna片段单位点编辑方法利用crispr/cas9系统，采用本发明的cas9核酸酶(cas9-q920p)对dna双链进行切割产生突出断裂末端，以补平连接的方式加入与突出断裂末端互补的碱基，可实现对基因组dna片段的单位点编辑。所述基因组dna片段单位点编辑方法可以改变单位点编辑时碱基突变的特征。所述补平连接是指：所述突出断裂末端会先通过碱基互补配对加入与突出的末端互补的碱基补平为钝末端之后再连接。如本发明的一些实施方式中所例举的，cas9核酸酶q920p在sgrna1的介导下，对基因组dna片段(β-globinre2位点)进行切割时，所产生的突出断裂末端u4，在细胞修复系统的作用下，所述突出断裂末端u4会先通过碱基互补配对加入与突出的末端c互补的碱基g补平为钝末端后再与连接接头连接。cas9核酸酶q920p在sgrna2的介导下，对基因组dna片段(β-globinre2位点)进行切割时，所产生的突出断裂末端d4，在细胞修复系统的作用下，所述突出断裂末端d4会先通过碱基互补配对加入与突出的末端a互补的碱基t补平为钝末端后再与连接接头连接。说明：在本发明中，cas9可作为cas9核酸酶的简称使用，意思与cas9核酸酶相同。在本发明中，cas9-q920p、q920p、q920p突变体之间可替换使用，意思均为名称为q920p的cas9核酸酶。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
：技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
：的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
：常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning-：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。实施例1研究dna片段编辑接头的连接情况发现cas9切割新机制针对hs51位点，构建针对hs51位点的sgrnas质粒：(1)购买引物从上海桑尼生物科技有限公司购买分别针对hs51位点和的sgrnas靶向序列的有5’悬挂端“accg”和“aaac”可以互补配对的正反向脱氧寡核苷酸；针对上述hs51位点的sgrnas靶向序列：hs51re1sgrna1：gccacacatccaaggctgac(seqidno.1)hs51re1sgrna2：gagatttggggcgtcaggaag(seqidno.2)(2)获得互补配对的带有悬挂端的双链dna1)用ddh2o将脱氧寡核苷酸溶解至100μm，并稀释至20μm；2)将正反脱氧寡核苷酸加入如下反应体系：反应条件：95℃水浴，5min，然后打开水浴锅盖子温度降至60℃左右，盖上盖子冷却至室温。(3)酶切pgl3-u6-sgrna-pgk-purovector1)用bsai限制性内切酶酶切载体质粒，反应体系如下：反应条件：37℃，1.5小时；2)胶回收纯化dna酶切片段，按照胶回收试剂盒(axygen)说明纯化。(4)连接酶切后的载体与带有悬挂端的双链dna连接体系如下：反应条件：室温反应1.5小时；(5)转化连接产物用stbl3感受态转化连接产物，在含氨苄抗生素(amp，100mg/l)lb平板培养过夜，37℃。(6)挑取单克隆测序1)从氨苄抗生素lb平板上挑取单菌落，lb(amp，100mg/l)液体培养过夜；2)质粒提取，按照质粒小抽试剂盒(axygen)说明提取；3)提取后的质粒送上海桑尼生物科技有限公司测序。(7)测序成功质粒进行中抽1)测序成功的质粒用stbl3感受态重新转化，在含amp(100mg/l)的lb平板培养过夜；2)上午挑取单菌落在2mllb(amp，100mg/l)液体培养基中培养8小时，然后转接到200mllb(amp，100mg/l)液体培养基中培养过夜；3)收集细菌，按照质粒中抽试剂盒(qiagen)说明提取质粒。2.人源化cas9质粒制备1)人源化cas9质粒从北京大学席建中实验室获得；2)用stbl3感受态重新转化，在lb平板(amp，100mg/l)培养过夜；3)上午挑取单菌落在2mllb(amp，100mg/l)液体培养基中培养8小时，然后转接到200mllb(amp，100mg/l)液体培养基中培养过夜，进行质粒中抽。3.用lipofectamine2000进行细胞转染1)hek293t细胞培养在培养瓶中，在37℃，含有5％co2细胞培养箱中培养，待其长至培养瓶80～90％。2)将长好的细胞在12孔板中用dmem完全无抗培养基(加入10％胎牛血清，无青链霉素双抗)进行铺板，过夜培养。3)待12孔板中的细胞长至80～90％时，将制备好的人源化cas9质粒(800ng)和针对hs51位点的sgrnas质粒(各600ng)通过lipofectamine2000进行细胞转染，每个样品各两个重复。4)转染后两天，收集细胞，用基因组提取试剂盒(genomicdnapurificationkit,promega)提取基因组。4.制备高通量测序文库在dna片段预期删除、反转和重复接头的精准连接位点上游大约30bp处设计引物，然后将引物5’端加上带有barcode的illumina的测序接头，下游引物可以设计在远离拼接位点一些的位置并加上illumina的测序接头，进行pcr扩增，然后使用罗氏pcr纯化试剂盒(productno.:11732676001)进行纯化，dna产物溶解在10mmtris-hclbuffer(ph＝8.5)，等量混合后形成库，进行高通量测序。高通量引物：hiseq-hhs51-af:atgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctgcaaggagatccgtgtcgtc(seqidno.3)hiseq-hs51-ara：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctaaggatgttgtggaaggcgagcag(seqidno.4)hiseq-hs51-bfa:caagcagaagacggcatacgagatggacgggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctttacatgacagcttccggtag(seqidno.5)hiseq-hhs51-br:caagcagaagacggcatacgagatttgactgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttttttggctaacaacatagtgcttc(seqidno.6)。5.高通量测序数据处理高通量测序完成后，使用linux程序将样品的测序结果从文库中通过barcode分出来，保存在各自的文件夹，然后进行bwa-mem比对，比对后的序列通过varscan2程序(v2.3.9)分析dna片段的插入和删除突变，varscan2程序参数如下：本发明通过研究dna片段编辑的末端连接情况发现cas9切割新机制。如图1a所示，采用两个sgrnas形成的sgrna组合及cas9核酸酶对基因组dna片段进行编辑时，cas9核酸酶在两个sgrnas介导下对基因组dna双链进行切割产生四个断裂末端(dsb)，这些断裂末端(dsb)在细胞修复系统(例如，mrn/ctip)的作用下产生dna片段删除、反转和重复等dna片段编辑。如图1b所示，针对基因组dna片段hs51re1(hs51位点)，我们采用sgrna1和sgrna2形成的sgrna组合及cas9核酸酶对其进行编辑。而后，我们检测到了dna片段删除、反转和重复，再利用高通量测序技术检测dna片段删除、反转和重复连接接头的情况，除了与预期相符的精准连接(joinedprecisely)外，dna片段删除连接接头、反转下游连接接头和重复连接接头处都存在一定比例的碱基加入(insertion)。如图1c所示，利用高通量测序技术检测dna片段删除连接接头的情况，与预期相符的精准连接(joinedprecisely)比例占79.23％，删除接头处还存在“g”碱基的加入(insertion，与预期的精准连接相比)，其比例占11.13％。与预期的精准连接相比，推测dna片段删除连接接头处加入的“g”碱基是来源于模版dna(hs51re1，hs51位点)的pam上游3bp附近(具体为pam上游4bp处)的碱基。因此，推测cas9核酸酶对与sgrna互补的dna链进行切割时，是在pam上游3bp处进行切割；而cas9核酸酶对与sgrna非互补的dna链进行切割时，可在pam上游3bp处更远的4bp处进行切割。根据dna片段删除连接接头处存在“g”碱基的加入(与预期的精准连接相比)，推测cas9核酸酶在sgrna2介导下对基因组dna片段进行切割时，有钝末端切割和突出末端切割，进而产生不同断裂末端。当cas9核酸酶在sgrna2介导下对基因组dna片段进行了钝末端切割时，也就是cas9核酸酶对与sgrna互补的dna链及非互补的dna链进行切割时均是在pam上游3bp处进行切割，产生了钝断裂末端“e3”。钝断裂末端“e3”在细胞修复系统的作用下产生dna片段删除时，不会导致dna片段删除连接接头处“g”碱基的加入，而是产生与预期相符的精准连接(joinedprecisely)。当cas9核酸酶在sgrna2介导下对基因组dna片段进行了突出末端切割时，也就是cas9核酸酶对与sgrna互补的dna链进行切割时是在pam上游3bp处进行切割，而对与sgrna非互补的dna链进行切割时是在pam上游4bp处进行切割，从而产生了5’突出断裂末端“e4”。5’突出断裂末端“e4”在细胞修复系统的作用下产生dna片段删除时，会导致dna片段删除连接接头处“g”碱基的加入。因此，我们认为：在cas9核酸酶的切割下，产生的断裂末端中，钝断裂末端e3的比例＝预期相符的精准连接(joinedprecisely)的比例＝79.23％。突出断裂末端e4的比例＝“g”碱基的加入比例＝11.13％。但是，我们观察到，除了与预期相符的精准连接(joinedprecisely)以及dna片段删除连接接头处存在“g”碱基的加入这两大类情况以外，还有一类随机的碱基删除(smalldeletion)。我们认为这类随机的碱基删除(smalldeletion)是各断裂末端(钝断裂末端e3和突出断裂末端e4)在细胞修复系统的作用下随机产生的，各断裂末端以均等的概率来产生碱基删除(smalldeletion)，各断裂末端在细胞修复系统的作用下所产生的碱基删除(smalldeletion)的数量与各断裂末端的数量成正比。基于随机碱基删除现象的存在，我们认为，经过测序获得的各断裂末端的实测比例与其真实比例存在差距，需要进行修正还原，即以各种断裂末端的实测比例之和为基准，计算各断裂末端的比例，以此作为该断裂末端的占比。即对cas9核酸酶的切割所产生的各断裂末端的比例进行标准化计算，钝断裂末端e3的比例为87.7％【计算方法为：79.23％÷(79.23％+11.13％)】。突出断裂末端e4的比例为12.3％【计算方法为：11.13％÷(79.23％+11.13％)】。亦即，cas9核酸酶在sgrna2的介导下对基因组dna片段进行的切割方式中，钝末端切割的比例为87.7％，突出末端切割的比例为12.3％。如图1d所示，利用高通量测序技术检测dna片段重复连接接头的情况，与预期相符的精准连接(joinedprecisely)的比例占8.96％，连接接头处存在“t”碱基的加入(insertion，与预期的精准连接相比)的比例占82.92％。与预期的精准连接相比，推测dna片段重复连接接头处加入的“t”碱基是来源于模版dna(hs51re1，hs51位点)上的pam上游3bp附近(具体为pam上游4bp处)的碱基。因此，推测cas9核酸酶对与sgrna互补的dna链进行切割时，是在pam上游3bp处进行切割；而cas9核酸酶对与sgrna非互补的dna链进行切割时，可在pam上游3bp处更远的4bp处进行切割。根据dna片段重复连接接头处检测到存在“t”碱基的加入(与预期的精准连接相比)，推测cas9核酸酶在sgrna1介导下对基因组dna片段进行切割时，有钝末端切割和突出末端切割，进而产生不同断裂末端。当cas9核酸酶在sgrna1介导下对基因组dna片段进行了钝末端切割时，也就是cas9核酸酶对与sgrna互补的dna链及非互补的dna链进行切割时均是在pam上游3bp处进行切割，产生了钝断裂末端“c3”。钝断裂末端“c3”在细胞修复系统的作用下产生dna片段重复时，不会导致dna片段重复连接接头处“t”碱基的加入，而是产生与预期相符的精准连接(joinedprecisely)。当cas9核酸酶在sgrna1介导下对基因组dna片段进行了突出末端切割时，也就是cas9核酸酶对与sgrna互补的dna链进行切割时是在pam上游3bp处进行切割，而对与sgrna非互补的dna链进行切割时是在pam上游4bp处进行切割，从而产生了5’突出断裂末端“c4”。5’突出断裂末端“c4”在细胞修复系统的作用下产生dna片段重复时，会导致dna片段重复连接接头处“t”碱基的加入。因此，我们认为：在cas9核酸酶的切割下，产生的断裂末端中，钝断裂末端c3的比例＝预期相符的精准连接(joinedprecisely)的比例＝8.96％。突出断裂末端c4的比例＝“t”碱基的加入比例＝82.92％。但是，我们观察到，除了与预期相符的精准连接(joinedprecisely)以及dna片段重复连接接头处存在“t”碱基的加入这两大类情况以外，还有一类随机的碱基删除(smalldeletion)。我们认为这类随机的碱基删除(smalldeletion)是各断裂末端(钝断裂末端c3和突出断裂末端c4)在细胞修复系统的作用下随机产生的，各断裂末端以均等的概率来产生碱基删除(smalldeletion)，各断裂末端在细胞修复系统的作用下所产生的碱基删除(smalldeletion)的数量与各断裂末端的数量成正比。基于随机碱基删除现象的存在，我们认为，经过测序获得的各断裂末端的实测比例与其真实比例存在差距，需要进行修正还原，即以各种断裂末端的实测比例之和为基准，计算各断裂末端的比例，以此作为该断裂末端的占比。即对cas9核酸酶的切割所产生的各断裂末端的比例进行标准化计算，钝断裂末端c3的比例为9.75％【计算方法为：8.96％÷(8.96％+82.92％)】。突出断裂末端c4的比例为90.25％【计算方法为：82.92％÷(8.96％+82.92％)】。亦即，cas9核酸酶在sgrna1的介导下对基因组dna片段进行的切割方式中，钝末端切割的比例为9.75％，突出末端切割的比例为90.25％。如图1e所示，根据cas9核酸酶在sgrna1和sgrna2的介导下分别对基因组dna片段进行切割的方式比例，预测产生的断裂末端的序列，进而推算出dna片段反转下游连接接头处的碱基加入情况及比例。当cas9核酸酶在sgrna1的介导下对基因组dna片段进行突出末端切割，产生突出断裂末端“c4”，cas9核酸酶在sgrna2的介导下对基因组dna片段进行钝末端切割，产生钝断裂末端“e3”，则在细胞修复系统的作用下，dna片段反转下游接头处会出现“a”碱基的加入，且发生的比例为79.14％【计算方法为：“c4”突出断裂末端占比(90.25％)x“e3”钝断裂末端占比(87.7％)＝79.14％】，与实验检测到的dna片段反转下游接头处“a”碱基加入比例71.94％相近。当cas9核酸酶在sgrna1的介导下对基因组dna片段进行钝末端切割，产生钝断裂末端“c3”，cas9核酸酶在sgrna2的介导下对基因组dna片段进行突出末端切割，产生突出断裂末端“e4”，则在细胞修复系统的作用下，dna片段反转下游接头处会出现“g”碱基的加入，且发生的比例为1.19％【计算方法为：“c3”钝断裂末端占比(9.75％)x“e4”突出断裂末端占比(12.3％)＝1.19％】，与实验检测到的dna片段反转下游接头处“g”碱基加入比例8.54％相近。当cas9核酸酶在sgrna1的介导下对基因组dna片段进行突出末端切割，产生突出断裂末端“c4”，cas9核酸酶在sgrna2的介导下对基因组dna片段进行突出末端切割，产生突出断裂末端“e4”，则在细胞修复系统的作用下，dna片段反转下游接头处会出现“ag”碱基的加入，且发生的比例为11％【计算方法为：“c4”突出断裂末端占比(90.25％)x“e4”突出断裂末端占比(12.3％)＝11％】，与实验检测到的dna片段反转下游接头处“ag”碱基加入比例3.66％相近。当cas9核酸酶在sgrna1的介导下对基因组dna片段进行钝末端切割，产生钝断裂末端“c3”，cas9核酸酶在sgrna2的介导下对基因组dna片段进行钝末端切割，产生钝断裂末端“e3”，则在细胞修复系统的作用下，dna片段反转下游接头精准连接，且发生的比例为8.55％【计算方法为：“c3”钝断裂末端占比(9.75％)x“e3”钝断裂末端占比(87.7％)＝8.55％】，与实验检测到的dna片段反转下游接头精准连接比例6.67％相近。综上所述，图1e的实验结果进一步证实了：cas9核酸酶对与sgrna非互补的dna链进行切割时，可在pam上游3bp处到更远碱基处进行切割。cas9核酸酶在sgrna介导下对基因组dna片段进行切割时，有钝末端切割和突出末端切割，进而产生不同断裂末端。这些断裂末端在细胞修复系统的作用下，产生与预期相符的精准dna片段编辑(特定碱基的精准编辑)或者与预期不符的基因编辑(随机的碱基删除)。如图1f所示，sgrna组合中，sgrna的设计不同(靶序列不同)，cas9核酸酶在sgrna的介导下对基因组dna片段进行切割方式比例不同，产生的断裂末端比例不同。具体地，cas9核酸酶在sgrna1的介导下对基因组dna片段进行切割时，钝末端切割方式的占比高于突出末端切割方式占比，产生的钝断裂末端占比高于5’突出断裂末端占比。然而cas9核酸酶在sgrna2的介导下对基因组dna片段进行切割时，突出末端切割方式的占比高于钝末端切割方式占比，产生的5’突出断裂末端占比也高于钝断裂末端占比。由于发现cas9核酸酶在sgrna介导下对基因组dna片段进行切割的方式有钝末端切割和突出末端切割，当cas9核酸酶在sgrna介导下对基因组dna片段进行突出末端切割，产生突出断裂末端时，按照补平连接的方式可加入与突出断裂末端互补的碱基，从而实现对基因组dna片段特定位置的碱基加入。实施例2突变spcas9获得切割方式改变的特定cas9实现精准的dna片段编辑1.构建cas9突变体1)使用neb突变试剂盒(q5site-directedmutagenesiskit,#e0554s)构建cas9突变体，首先进行pcr扩增，反应如下：2)kld(kinase,ligase&dpni)处理，反应如下：反应条件：室温10分钟3)将2)中的反应产物全部用于感受态细菌stbl3(50μl)的转化，在含氨苄抗生素(amp，100mg/l)lb平板培养过夜，37℃。挑取单克隆，质粒提取后送测序。spcas9(cas9wt)的氨基酸序列如seqidno.7所示，具体为：spcas9(cas9wt)的编码核苷酸序列如seqidno.8所示，具体为：如图2a所示，cas9核酸酶，含有ruvc和hnh功能域，ruvc功能域负责切割与sgrna非互补的dna链，hnh功能域负责切割与sgrna互补的dna链。本发明要求保护的cas9核酸酶突变体命名为cas9-q920p(将spcas9核酸酶第920位谷氨酰胺突变成脯氨酸)，cas9-q920p的氨基酸序列seqidno.9所示，具体为：cas9-q920p的编码核苷酸序列如seqidno.10所示，具体为：此外，以对spcas9进行随机突变获得的突变体k775a、r778a、e779a、k918p作为对照，这些对照突变体与本发明的cas9-q920p的序列均不同。2.cas9核酸酶突变体进行dna片段编辑(1)针对β-globinre2(rrm21位点)，构建rrm21位点(β-globinre2)的sgrnas。所述sgrnas靶向序列：β-globinre2sgrna1：acccaatgacctcaggctgt(seqidno.11)；β-globinre2sgrna2：tcacttgttagcggcatctg(seqidno.12)；从上海桑尼生物科技有限公司购买针对β-globinre2(rrm21位点)的sgrnas靶向序列的有5’悬挂端“accg”和“aaac”可以互补配对的正反向脱氧寡核苷酸。(2)获得互补配对的带有悬挂端的双链dna1)用ddh2o将脱氧寡核苷酸溶解至100μm，并稀释至20μm；2)将正反脱氧寡核苷酸加入如下反应体系：反应条件：95℃水浴，5min，然后打开水浴锅盖子温度降至60℃左右，盖上盖子冷却至室温。(3)酶切pgl3-u6-sgrna-pgk-purovector1)用bsai限制性内切酶酶切载体质粒，反应体系如下：反应条件：37℃，1.5小时；2)胶回收纯化dna酶切片段，按照胶回收试剂盒(axygen)说明纯化。(4)连接酶切后的载体与带有悬挂端的双链dna连接体系如下：反应条件：室温反应1.5小时；(5)转化连接产物用stbl3感受态转化连接产物，在含氨苄抗生素(amp，100mg/l)lb平板培养过夜，37℃。(6)挑取单克隆测序1)从氨苄抗生素lb平板上挑取单菌落，lb(amp，100mg/l)液体培养过夜；2)质粒提取，按照质粒小抽试剂盒(axygen)说明提取；3)提取后的质粒送上海桑尼生物科技有限公司测序。(7)测序成功质粒进行中抽1)测序成功的质粒用stbl3感受态重新转化，在含amp(100mg/l)的lb平板培养过夜；2)上午挑取单菌落在2mllb(amp，100mg/l)液体培养基中培养8小时，然后转接到200mllb(amp，100mg/l)液体培养基中培养过夜；3)收集细菌，按照质粒中抽试剂盒(qiagen)说明提取质粒。(8)用lipofectamine2000进行细胞转染1)hek293t细胞培养在培养瓶中，在37℃，含有5％co2细胞培养箱中培养，待其长至培养瓶80～90％，将长好的细胞在12孔板中用dmem完全无抗培养基进行铺板，过夜培养；2)待12孔板中的细胞长至80～90％时，将制备好的cas9和cas9突变体质粒(800ng)与针对rrm21位点的sgrnas质粒(各600ng)通过lipofectamine2000进行细胞转染，每个样品各两个重复。3)转染后两天，收集细胞，用基因组提取试剂盒(genomicdnapurificationkit,promega)提取基因组。(9)制备高通量测序文库在dna片段预期删除、反转和重复接头的精准连接位点上游大约30bp处设计引物，然后将引物5’端加上带有barcode的illumina的测序接头，下游引物可以设计在远离拼接位点一些的位置并加上illumina的测序接头，进行pcr扩增，然后使用罗氏pcr纯化试剂盒(productno.:11732676001)进行纯化，dna产物溶解在10mmtris-hclbuffer(ph＝8.5)，等量混合后形成库，进行高通量测序。cas9突变引物：cas9-q920p-f：catcaaaaggccccttgttgagacac(seqidno.13)；cas9-q920p-r：aagcctgctttatccaac(seqidno.14)；(10)高通量测序数据处理高通量测序完成后，使用linux程序将样品的测序结果从文库中通过barcode分出来，保存在各自的文件夹，然后进行bwa-mem比对，比对后的序列通过varscan2程序(v2.3.9)分析dna片段的插入和删除突变，varscan2程序参数如下：针对β-globinre2位点，利用高通量测序引物进行pcr扩增dna片段删除、反转和重复，建库进行高通量测序。高通量引物：hiseq-rrm-1f3：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctatatggcatcctagccttaagaaactag(seqidno.15)hiseq-rrm-1r2：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatcttacgacgcaggagccgtatcatg(seqidno.16)hiseq-rrm-3f2：caagcagaagacggcatacgagataagctagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctatagcaatgaaatcttgaaggagtg(seqidno.17)hiseq-rrm-3r2：caagcagaagacggcatacgagattcaagtgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgcacagccctgctctattacg(seqidno.18)。参照上述实施例1的方法，采用两个sgrnas形成的sgrna组合及cas9核酸酶对基因组dna片段进行编辑后，可利用高通量测序技术检测dna片段删除和重复的连接接头碱基加入情况，进而计算出cas9核酸酶在各sgrna介导下对基因组dna片段进行切割时，钝末端切割方式和突出末端切割方式的占比。具体地，野生型spcas9核酸酶(简称cas9wt，wt)(图2a)和q920p在sgrna组合中各sgrna介导下对基因组dna片段β-globinre2位点进行编辑的两个sgrnas的示意图如图2b。如图2c所示，利用高通量测序技术检测dna片段重复连接接头的情况，除了与预期相符的精准连接(joinedprecisely)以外，还存在与预期的精准连接相比，连接接头处加入了“c”碱基和“gc”碱基的情况。选用不同的cas9核酸酶时，检测到的与预期相符的精准连接(joinedprecisely)、“+c”碱基、“+gc”碱基的占比不同。以选用q920p这个cas9核酸酶为例，检测到与预期相符的精准连接(joinedprecisely)的占比为23.47％，“+c”碱基的占比为31.17％，“+gc”碱基的占比为0.43％。鉴于dna片段重复连接接头处检测到存在“c”碱基的加入(与预期的精准连接相比)，我们推测dna片段重复连接接头处加入的“c”碱基是来源于模版dna(β-globinre2位点)上的pam(agg)上游4bp处的碱基。并且，进一步推测q920p这个cas9核酸酶在sgrna1的介导下对基因组dna片段(β-globinre2位点)进行切割时，对与sgrna互补的dna链进行切割时，是在pam上游3bp处进行切割，而对与sgrna非互补dna链进行切割时，则是在pam(agg)上游4bp处进行突出末端切割，从而产生了突出断裂末端u4。突出断裂末端u4在细胞修复系统的作用下产生dna片段重复时，导致了dna片段重复连接接头处“c”碱基的加入。同理，鉴于dna片段重复连接接头处检测到存在“gc”碱基的加入(与预期的精准连接相比)，我们推测dna片段重复连接接头处加入的“gc”碱基是来源于模版dna(β-globinre2位点)上的pam(agg)上游4bp处和5bp的碱基。进一步推测q920p这个cas9核酸酶在sgrna1的介导下对基因组dna片段(β-globinre2位点)进行切割时，对与sgrna互补的dna链进行切割时，是在pam上游3bp处进行切割，而对与sgrna非互补dna链进行切割时，是在pam(agg)上游5bp处进行突出末端切割，从而产生了突出断裂末端u5。突出断裂末端u5在细胞修复系统的作用下产生dna片段重复时，导致了dna片段重复连接接头处“gc”碱基的加入。而当q920p这个cas9核酸酶在sgrna1的介导下对基因组dna片段(β-globinre2位点)进行切割时，对与sgrna互补的dna链进行切割时，是在pam上游3bp处进行切割，对与sgrna非互补dna链进行切割时，是在pam(agg)上游3bp处进行钝末端切割，从而产生了钝断裂末端u3。钝断裂末端u3在细胞修复系统的作用下产生dna片段重复时，不会导致dna片段重复连接接头处碱基的加入，而是产生与预期相符的精准连接(joinedprecisely)。因此，我们认为：在cas9核酸酶q920p的切割下，产生的断裂末端中，钝断裂末端u3的占比＝预期相符的精准连接(joinedprecisely)的比例＝23.47％。突出断裂末端u4的比例＝“c”碱基的加入比例＝31.17％。突出断裂末端u5的比例＝“gc”碱基的加入比例＝0.43％。但是，我们观察到，除了与预期相符的精准连接(joinedprecisely)、“c”碱基的加入、以及“gc”碱基的加入这三大类情况以外，还有一类随机的碱基删除(smalldeletion)。我们认为这类随机的碱基删除(smalldeletion)是各断裂末端(钝断裂末端u3/突出断裂末端u4/突出断裂末端u5)在细胞修复系统的作用下随机产生的，各断裂末端以均等的概率来产生碱基删除(smalldeletion)，各断裂末端在细胞修复系统的作用下所产生的碱基删除(smalldeletion)的数量与各断裂末端的数量成正比。基于随机碱基删除现象的存在，我们认为，经过测序获得的各断裂末端的实测比例与其真实比例存在差距，需要进行修正还原，即以各种断裂末端的实测比例之和为基准，计算各断裂末端的比例，以此作为该断裂末端的占比。即对cas9核酸酶q920p的切割所产生的各断裂末端的占比进行标准化计算，钝断裂末端u3的占比为42.61％【计算方法为：23.47％÷(23.47％+31.17％+0.43％)】。突出断裂末端u4的比例为56.60％【计算方法为：31.17％÷(23.47％+31.17％+0.43％)】。突出断裂末端u5的比例为0.79％【计算方法为：0.43％÷(23.47％+31.17％+0.43％)】。亦即，cas9核酸酶q920p在sgrna1的介导下对基因组dna片段进行的切割方式中，u3钝末端切割的比例为42.61％，u4突出末端切割的比例为56.60％，u5突出末端切割的比例为0.79％。参照上述方法，再计算野生型cas9核酸酶(简称cas9wt，wt)在sgrna1的介导下对基因组dna片段进行的切割方式中，u3钝末端切割的占比x1、u4突出末端切割x2、u5突出末端切割的占比x3。结果，如图2d和下表2-1所示：表2-1可见，在sgrna1的介导下，相比于spcas9核酸酶(cas9wt)，q920p这个cas9核酸酶突变体对与sgrna1非互补的dna链进行切割时，在pam上游4bp处进行切割的比例明显提高(u4)，在pam上游3bp处进行切割的比例减少(u3)。如图2e所示，利用高通量测序技术检测dna片段删除连接接头的情况，除了与预期相符的精准连接(joinedprecisely)以外，还存在与预期的精准连接相比，删除连接接头处加入了“t”碱基、“at”碱基、“cat”碱基的情况。选用不同的cas9核酸酶时，检测到的与预期相符的精准连接(joinedprecisely)、“+t”碱基、“+at”碱基、“+cat”碱基的占比不同。以选用q920p这个cas9核酸酶为例，检测到与预期相符的精准连接(joinedprecisely)的占比为5.73％，“+t”碱基的占比为7.92％，“+at”碱基的占比为13.48％，“+cat”碱基的占比为0.37％。鉴于dna片段删除连接接头处检测到存在“t”碱基的加入(与预期的精准连接相比)，我们推测dna片段删除连接接头处加入的“t”碱基是来源于模版dna(β-globinre2位点)上的pam(tgg)上游4bp处的碱基。并且，进一步推测q920p这个cas9核酸酶在sgrna2的介导下对基因组dna片段(β-globinre2位点)进行切割时，对与sgrna互补的dna链进行切割时，是在pam上游3bp处进行切割，而对与sgrna非互补dna链进行切割时，则是在pam(tgg)上游4bp处进行突出末端切割，从而产生了突出断裂末端d4。突出断裂末端d4在细胞修复系统的作用下产生dna片段删除时，导致了dna片段删除连接接头处“t”碱基的加入。同理，鉴于dna片段删除连接接头处检测到存在“at”碱基的加入(与预期的精准连接相比)，我们推测dna片段删除连接接头处加入的“at”碱基是来源于模版dna(β-globinre2位点)上的pam(tgg)上游4bp和5bp处的碱基。进一步推测q920p这个cas9核酸酶在sgrna2的介导下对基因组dna片段(β-globinre2位点)进行切割时，对与sgrna互补的dna链进行切割时，是在pam上游3bp处进行切割，而对与sgrna非互补dna链进行切割时，是在pam(tgg)上游5bp处进行突出末端切割，从而产生了突出断裂末端d5。突出断裂末端d5在细胞修复系统的作用下产生dna片段删除时，导致了dna片段删除连接接头处“at”碱基的加入。同理，鉴于dna片段删除连接接头处检测到存在“cat”碱基的加入(与预期的精准连接相比)，我们推测dna片段删除连接接头处加入的“cat”碱基是来源于模版dna(β-globinre2位点)上的pam(tgg)上游4bp、5bp、6bp处的碱基。进一步推测q920p这个cas9核酸酶在sgrna2的介导下对基因组dna片段(β-globinre2位点)进行切割时，对与sgrna互补的dna链进行切割时，是在pam上游3bp处进行切割，而对与sgrna非互补dna链进行切割时，是在pam(tgg)上游6bp处进行突出末端切割，从而产生了突出断裂末端d6。突出断裂末端d5在细胞修复系统的作用下产生dna片段删除时，导致了dna片段删除连接接头处“cat”碱基的加入。而当q920p这个cas9核酸酶在sgrna2的介导下对基因组dna片段(β-globinre2位点)进行切割时，对与sgrna互补的dna链进行切割时，是在pam上游3bp处进行切割，对与sgrna非互补dna链进行切割时，是在pam(tgg)上游3bp处进行钝末端切割，从而产生了钝断裂末端d3。钝断裂末端d3在细胞修复系统的作用下产生dna片段删除时，不会导致dna片段删除连接接头处碱基的加入，而是产生与预期相符的精准连接(joinedprecisely)。因此，我们认为：在cas9核酸酶q920p的切割下，产生的断裂末端中，钝断裂末端d3的占比＝预期相符的精准连接(joinedprecisely)的占比＝5.73％。突出断裂末端d4的占比＝“t”碱基的加入占比＝7.92％。突出断裂末端d5的占比＝“at”碱基的加入占比＝13.48％。突出断裂末端d6的占比＝“cat”碱基的加入占比＝0.37％。但是，我们观察到，除了与预期相符的精准连接(joinedprecisely)、dna片段删除连接接头处加入了“t”碱基、“+at”碱基、“+cat”碱基这四大类情况以外，还有一类随机的碱基删除(smalldeletion)。我们认为这类随机的碱基删除(smalldeletion)是各断裂末端(钝断裂末端d3/突出断裂末端d4/突出断裂末端d5/突出断裂末端d6)在细胞修复系统的作用下随机产生的，各断裂末端以均等的概率来产生碱基删除(smalldeletion)，各断裂末端在细胞修复系统的作用下所产生的碱基删除(smalldeletion)的数量与各断裂末端的数量成正比。基于随机碱基删除现象的存在，我们认为，经过测序获得的各断裂末端的实测比例与其真实比例存在差距，需要进行修正还原，即以各种断裂末端的实测比例之和为基准，计算各断裂末端的比例，以此作为该断裂末端的占比。即对cas9核酸酶q920p的切割所产生的各断裂末端的占比进行标准化计算，钝断裂末端d3的占比为20.82％【计算方法为：5.73％÷(5.73％+7.92％+13.48％+0.37％)】。突出断裂末端d4的比例为28.80％【计算方法为：7.92％÷(5.73％+7.92％+13.48％+0.37％)】。突出断裂末端d5的比例为49.02％【计算方法为：13.48％÷(5.73％+7.92％+13.48％+0.37％)】。突出断裂末端d6的比例为1.36％【计算方法为：0.37％÷(5.73％+7.92％+13.48％+0.37％)】。亦即，cas9核酸酶q920p在sgrna2的介导下对基因组dna片段进行的切割方式中，d3钝末端切割的占比为20.82％，d4突出末端切割的占比为28.80％，d5突出末端切割的占比为49.02％，d6突出末端切割的占比为1.36％。参照上述方法，计算出野生型cas9核酸酶在sgrna2的介导下对基因组dna片段进行的切割方式中，d3钝末端切割的占比y1、d4突出末端切割的占比y2、d5突出末端切割的占比y3、d6突出末端切割的占比y4。结果如图2f和表2-2所示：表2-2可见，在sgrna2的介导下，相比于spcas9核酸酶(cas9wt)，q920p突变体对基因组dna片段中与sgrna2非互补的dna链进行切割时，在pam上游4bp处进行切割的比例明显提高(d4)，在pam上游5bp处进行切割的比例明显提高(d5)。参照实施例1的方法，根据cas9核酸酶在sgrna1和sgrna2的介导下分别对基因组dna片段进行切割的方式比例，预测产生的断裂末端的序列，进而推算出dna片段反转下游连接接头处的碱基加入情况及比例。结果如图2g所示，推算结果与实验检测到的碱基加入比例相近。更进一步证实了cas9核酸酶在sgrna组合的介导下，可以在pam上游3bp处到更远碱基处切割非互补dna链。此外，还将本发明的cas9核酸酶突变体cas9-q920p及对照突变体k775a、r778a、e779a、k918p与针对stm位点(β-globinre1)的两个sgrnas一起转染人胚肾hek293t细胞，转染48小时后收集基因组dna，利用高通量测序引物进行pcr扩增dna片段删除、反转和重复，建库进行高通量测序。根据dna片段删除和重复的连接接头碱基加入情况，计算这些突变体在两个sgrnas介导下的切割方式比例。针对stm位点(β-globinre1)的sgrnas靶向序列：β-globinre1sgrna1：gattgttgttgccttggagtg(seqidno.19)；β-globinre1sgrna2：gctggtcccctggtaacctgg(seqidno.20)；正反向脱氧寡核苷酸：β-globinre1sgrna1f：accgattgttgttgccttggagtg(seqidno.21)；β-globinre1sgrna1r：aaaccactccaaggcaacaacaat(seqidno.22)；β-globinre1sgrna2f：accgctggtcccctggtaacctgg(seqidno.23)；β-globinre1sgrna2r：aaacccaggttaccaggggaccag(seqidno.24)；高通量引物：hiseq-hstm-af1:aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatcttgcttagagccaggactaattgc(seqidno.25)；hiseq-hstm-ar2:aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatcttgggtgtagaaatgagcaaataagt(seqidno.26)；hiseq-hstm-2f:caagcagaagacggcatacgagatgatcgtgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctagattgagttctgtttgtttcatctac(seqidno.27)；hiseq-hstm-2r:caagcagaagacggcatacgagatagtcaagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcagctctgcctgaaaggagtc(seqidno.28)。如图3a和3b所示，与野生型spcas9核酸酶(简称cas9wt)相比，对照突变体k775a、r778a、e779a和k918p在sgrna1和sgrna2的介导下对基因组dna片段进行切割的方式没有明显的改变；而cas9核酸酶突变体cas9-q920p与野生型spcas9核酸酶(简称cas9wt)相比，在sgrna1和sgrna2的介导下对基因组dna片段进行切割的方式发生了明显的改变。综上所述，本发明的cas9核酸酶(cas9-q920p)与野生型cas9核酸酶相比，对目的基因组dna片段进行切割时产生的突出断裂末端与钝断裂末端的比例不同。采用本发明的cas9核酸酶(cas9-q920p)可以实现对对目的基因组dna片段特定位置的切割并产生突出断裂末端，以补平连接的方式可加入与突出断裂末端互补的碱基，进而可实现特定位置的精准dna片段编辑。本申请的参考文献如下：1.stamatoyannopoulos,ja.(2012).whatdoesourgenomeencode？genomeres,22:1602-1611.2.theencodeprojectconsortium.(2012).anintegratedencyclopediaofdnaelementsinthehumangenome.nature,489:57-74.3.banerji,j,lolson,andwschaffner.(1983).alymphocyte-specificcellularenhancerislocateddownstreamofthejoiningregioninimmunoglobulinheavychaingenes.cell,33:729-740.4.zhang,t,phaws,andqwu.(2004).multiplevariablefirstexons:amechanismforcell-andtissue-specificgeneregulation.genomeres,14:79-89.5.neph,s,etal.(2012).anexpansivehumanregulatorylexiconencodedintranscriptionfactorfootprints.nature,489:83-90.6.shen,y,etal.(2012).amapofthecis-regulatorysequencesinthemousegenome.nature,488:116-120.7.thurman,re,etal.(2012).theaccessiblechromatinlandscapeofthehumangenome.nature,489:75-82.8.delaat,wanddduboule.(2013).topologyofmammaliandevelopmentalenhancersandtheirregulatorylandscapes.nature,502:499-506.9.mcclintock,b.(1950).theoriginandbehaviorofmutablelociinmaize.procnatlacadsciusa,36:344-355.10.mcclintock,b.(1984).thesignificanceofresponsesofthegenometochallenge.science,226:792-801.11.brinster,rl,etal.(1981).somaticexpressionofherpesthymidinekinaseinmicefollowinginjectionofafusiongeneintoeggs.cell,27:223-231.12.harbers,k,djahner,andrjaenisch.(1981).microinjectionofclonedretroviralgenomesintomousezygotes:integrationandexpressionintheanimal.nature,293:540-542.13.gordon,jw,etal.(1980).genetictransformationofmouseembryosbymicroinjectionofpurifieddna.procnatlacadsciusa,77:7380-7384.14.palmiter,rd,etal.(1982).dramaticgrowthofmicethatdevelopfromeggsmicroinjectedwithmetallothionein-growthhormonefusiongenes.nature,300:611-615.15.capecchi,mr.(2005).genetargetinginmice:functionalanalysisofthemammaliangenomeforthetwenty-firstcentury.natrevgenet,6:507-512.16.carroll,d.(2014).genomeengineeringwithtargetablenucleases.annurevbiochem,83:409-439.17.smithies,o,etal.(1985).insertionofdnasequencesintothehumanchromosomalbeta-globinlocusbyhomologousrecombination.nature,317:230-234.18.thomas,krandmrcapecchi.(1986).introductionofhomologousdnasequencesintomammaliancellsinducesmutationsinthecognategene.nature,324:34-38.19.zheng,b,etal.(2000).engineeringmousechromosomeswithcre-loxp:range,efficiency,andsomaticapplications.molcellbiol,20:648-655.20.wu,s,etal.(2007).towardsimplerandfastergenome-widemutagenesisinmice.natgenet,39:922-930.21.gupta,a,etal.(2013).targetedchromosomaldeletionsandinversionsinzebrafish.genomeres,23:1008-1017.22.xiao,a,etal.(2013).chromosomaldeletionsandinversionsmediatedbytalensandcrispr/casinzebrafish.nucleicacidsres,41:e141.23.kraft,k,etal.(2015).deletions,inversions,duplications:engineeringofstructuralvariantsusingcrispr/casinmice.cellrep,10:833-839.24.wu,s,etal.(2008).aprotocolforconstructinggenetargetingvectors:generatingknockoutmiceforthecadherinfamilyandbeyond.natureprotocol,3:1056-1076.25.jinek,m,etal.(2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技术领域：
：的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。sequencelisting<110>上海交通大学<120>一种cas9核酸酶q920p及其用途<130>171289<160>28<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>hs51re1sgrna1<400>1gccacacatccaaggctgac20<210>2<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>hs51re1sgrna2<400>2gagatttggggcgtcaggaag21<210>3<211>77<212>dna<213>artificial<220><223>hiseq-hhs51-af<400>3atgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctgca60aggagatccgtgtcgtc77<210>4<211>82<212>dna<213>artificial<220><223>hiseq-hs51-ara<400>4aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctaa60ggatgttgtggaaggcgagcag82<210>5<211>87<212>dna<213>artificial<220><223>hiseq-hs51-bfa<400>5caagcagaagacggcatacgagatggacgggtgactggagttcagacgtgtgctcttccg60atctctttacatgacagcttccggtag87<210>6<211>89<212>dna<213>artificial<220><223>hiseq-hhs51-br<400>6caagcagaagacggcatacgagatttgactgtgactggagttcagacgtgtgctcttccg60atcttttttggctaacaacatagtgcttc89<210>7<211>1401<212>prt<213>artificial<220><223>spcas9<400>7metalaprolyslyslysarglysvalglyilehisglyvalproala151015alametasplyslystyrserileglyleuaspileglythrasnser202530valglytrpalavalilethraspglutyrlysvalproserlyslys354045phelysvalleuglyasnthrasparghisserilelyslysasnleu505560ileglyalaleuleupheaspserglygluthralaglualathrarg65707580leulysargthralaargargargtyrthrargarglysasnargile859095cystyrleuglngluilepheserasnglumetalalysvalaspasp100105110serphephehisargleuglugluserpheleuvalglugluasplys115120125lyshisgluarghisproilepheglyasnilevalaspgluvalala130135140tyrhisglulystyrprothriletyrhisleuarglyslysleuval145150155160aspserthrasplysalaaspleuargleuiletyrleualaleuala165170175hismetilelyspheargglyhispheleuilegluglyaspleuasn180185190proaspasnseraspvalasplysleupheileglnleuvalglnthr195200205tyrasnglnleupheglugluasnproileasnalaserglyvalasp210215220alalysalaileleuseralaargleuserlysserargargleuglu225230235240asnleuilealaglnleuproglyglulyslysasnglyleuphegly245250255asnleuilealaleuserleuglyleuthrproasnphelysserasn260265270pheaspleualagluaspalalysleuglnleuserlysaspthrtyr275280285aspaspaspleuaspasnleuleualaglnileglyaspglntyrala290295300aspleupheleualaalalysasnleuseraspalaileleuleuser305310315320aspileleuargvalasnthrgluilethrlysalaproleuserala325330335sermetilelysargtyraspgluhishisglnaspleuthrleuleu340345350lysalaleuvalargglnglnleuproglulystyrlysgluilephe355360365pheaspglnserlysasnglytyralaglytyrileaspglyglyala370375380serglnglugluphetyrlyspheilelysproileleuglulysmet385390395400aspglythrglugluleuleuvallysleuasnarggluaspleuleu405410415arglysglnargthrpheaspasnglyserileprohisglnilehis420425430leuglygluleuhisalaileleuargargglngluaspphetyrpro435440445pheleulysaspasnargglulysileglulysileleuthrphearg450455460ileprotyrtyrvalglyproleualaargglyasnserargpheala465470475480trpmetthrarglysserglugluthrilethrprotrpasnpheglu485490495gluvalvalasplysglyalaseralaglnserpheilegluargmet500505510thrasnpheasplysasnleuproasnglulysvalleuprolyshis515520525serleuleutyrglutyrphethrvaltyrasngluleuthrlysval530535540lystyrvalthrgluglymetarglysproalapheleuserglyglu545550555560glnlyslysalailevalaspleuleuphelysthrasnarglysval565570575thrvallysglnleulysgluasptyrphelyslysileglucysphe580585590aspservalgluileserglyvalgluaspargpheasnalaserleu595600605glythrtyrhisaspleuleulysileilelysasplysasppheleu610615620aspasnglugluasngluaspileleugluaspilevalleuthrleu625630635640thrleuphegluaspargglumetileglugluargleulysthrtyr645650655alahisleupheaspasplysvalmetlysglnleulysargargarg660665670tyrthrglytrpglyargleuserarglysleuileasnglyilearg675680685asplysglnserglylysthrileleuasppheleulysseraspgly690695700phealaasnargasnphemetglnleuilehisaspaspserleuthr705710715720phelysgluaspileglnlysalaglnvalserglyglnglyaspser725730735leuhisgluhisilealaasnleualaglyserproalailelyslys740745750glyileleuglnthrvallysvalvalaspgluleuvallysvalmet755760765glyarghislysprogluasnilevalileglumetalaarggluasn770775780glnthrthrglnlysglyglnlysasnserarggluargmetlysarg785790795800ileglugluglyilelysgluleuglyserglnileleulysgluhis805810815provalgluasnthrglnleuglnasnglulysleutyrleutyrtyr820825830leuglnasnglyargaspmettyrvalaspglngluleuaspileasn835840845argleuserasptyraspvalasphisilevalproglnserpheleu850855860lysaspaspserileaspasnlysvalleuthrargserasplysasn865870875880argglylysseraspasnvalproserglugluvalvallyslysmet885890895lysasntyrtrpargglnleuleuasnalalysleuilethrglnarg900905910lyspheaspasnleuthrlysalagluargglyglyleusergluleu915920925asplysalaglypheilelysargglnleuvalgluthrargglnile930935940thrlyshisvalalaglnileleuaspserargmetasnthrlystyr945950955960aspgluasnasplysleuilearggluvallysvalilethrleulys965970975serlysleuvalseraspphearglysasppheglnphetyrlysval980985990arggluileasnasntyrhishisalahisaspalatyrleuasnala99510001005valvalglythralaleuilelyslystyrprolysleugluser101010151020gluphevaltyrglyasptyrlysvaltyraspvalarglysmet102510301035ilealalyssergluglngluileglylysalathralalystyr104010451050phephetyrserasnilemetasnphephelysthrgluilethr105510601065leualaasnglygluilearglysargproleu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