本申请是申请日为2011年5月25日、申请号为201180026040.8、申请公布号为cn102918147a、并且发明名称为“改进的rna酶h和核酸扩增的检测”的专利申请的分案申请。本公开描述了一种改进的rna酶h，用于改善rna序列的实时逆转录-pcr检测。
背景技术：
：：研究基因表达的最广泛使用的技术之一是采用mrna序列的第一链cdna作为模板进行pcr扩增。结合逆转录-pcr技术测量pcr反应的动力学的能力使得以必需水平灵敏度来准确并精确测量靶rna序列变得容易。具体地讲，诸如catacleavetm核酸内切酶测定(在第5,763,181号美国专利中详细地描述；见图1)的荧光双重标记杂交探针技术允许实时的逆转录-pcr扩增的检测。通过在扩增反应中包括catacleavetm探针连同rna酶h来实现靶序列的检测。在逆转录-pcr扩增产物中与靶序列互补的catacleavetm探针具有包括rna序列和dna序列的嵌合结构，并且在5'端和3'端两侧连接可检测标记，例如，fret对标记的dna序列。fret对的荧光标记与淬灭剂的接近阻止了完整探针发射荧光。当探针与逆转录pcr产物退火时，产生能够通过存在于反应混合物中的rna酶h切割的rna:dna复体。在退火探针的rna部分内的切割导致荧光标记与淬灭剂的分离并导致随后的荧光发射。技术实现要素：技术问题描述了一种可逆改进的“热启动”rna酶h组合物，用于改善测试试样中核酸序列的catacleavetm探针检测。酶组合物的关键特征是能够在逆转录pcr循环过程中调节rna酶h的催化活性。因此，在逆转录之前可以首先抑制rna酶h的活性以最小化rna:dna异源双链引物的降解。在完成cdna合成后，诱导rna酶h的活性以促进切割和退火到逆转录-pcr产物内的靶dna序列的catacleavetm探针的荧光检测。所述可诱导的rna酶h酶适用于在单一反应混合物中需要一步逆转录catacleavetmpcr的高通量应用。在一个实施例中，本发明包括热启动酶组合物，热启动酶组合物包含具有可诱导的rna酶h活性的酶。酶可以具有热稳定的rna酶h结构域，所述结构域可以与seqidno:11、12、13或14的氨基酸序列具有至少70％、80％或90％、95％或99％的序列同源性。热启动组合物可以具有例如dna聚合酶或逆转录酶活性的聚合酶活性。rna酶h活性可以是热诱导的或ph诱导的。在一个实施例中，具有可诱导的rna酶h活性的酶可以是pyrococcusfuriosusrna酶hii、pyrococcushorikoshirna酶hii、thermococcuslitoralisrna酶hi、thermusthermophilusrna酶hi、大肠杆菌火球菌rna酶hi或大肠杆菌火球菌rna酶hii。可以通过化学修饰可逆地改进具有可诱导的rna酶h活性的酶。在实施例中，可以通过对酶的诸如赖氨酸的氨基酸酰化或通过与具有大约0.2％至大约1％(w/v)的浓度的甲醛反应来对酶进行可逆地改进。在一个实施例中，热启动酶组合物还包括配体，其中，可通过配体与酶的结合抑制可诱导rna酶h的活性或通过干扰酶与配体的结合诱导可诱导rna酶h的活性。配体可以是热不稳定的。酶与配体的结合可以是非共价的。配体可以是对于具有可诱导rna酶h活性的酶具有10-1m或更小的kd解离常数的小分子、肽或核酸。在一些实施例中，配体可以结合到rna酶h结构域或可以诱导rna酶h结构域的构象变化。配体可以是抗体、抗体片段、适体或螯合剂。抗体片段可以是fab、fab'、f(ab')2、fd、单链fv或scfv、二硫键连接的fv、v-nar结构域、ignar、胞内抗体、iggdch2、小体、f(ab')3、四体、三体、二体、(scfv)2、单结构域抗体、dvd-ig、fcab、mab2或scfv-fc。rna酶h的活性可以通过(1)将包含酶的溶液加热至大约90℃或更高的温度或者(2)将包含酶的溶液的ph降低至大约7.0或更低来诱导。所述溶液可以是包含靶核酸序列的聚合酶链式反应试样。酶和配体的结合可以是共价的。例如，配体可以是交联剂。在一个实施例中，本发明公开了一种扩增靶序列的方法，所述方法包括：提供扩增反应混合物；以及使扩增反应组合物进行至少一次扩增反应以形成至少一种扩增产物，并且测量得到的扩增产物的可检测标记，其中，扩增反应包括将反应组合物加热到大约90℃的温度的步骤，扩增反应混合物包含：包含靶dna序列的试样；热启动酶组合物，包含dna聚合酶和可诱导的rna酶h活性；第一引物，包含与靶核酸序列的5'端互补的序列；第二引物，包含与靶核酸序列的3'端互补的序列；以及探针，结合到可检测标记并具有能被rna酶h切割的组分。可以在大约95℃进行加热反应组合物的步骤。探针可以是包含一个或多个dna序列部分以及rna序列部分的寡核苷酸，其中，rna部分以rna序列的3'端和5'端结合到两个dna序列中的每个dna序列的方式设置在两个dna序列之间。加热步骤可以通过破坏具有rna酶h活性的酶和配体之间的结合来诱导rna酶h的活性。配体可以是热不稳定的。在另一实施例中，本发明公开了检测试样中的靶核糖核酸序列的方法，所述方法包括：提供扩增反应组合物；开始靶rna的逆转录以形成rna:cdna(注意：cdna表示产物是双链dna，而不是逆转录产物)双链；将反应组合物加热至大约90℃或更高的温度，由此激活可诱导的rna酶h的活性以降解rna:dna双链的rna配基；开始至少一个扩增反应以形成至少一种扩增产物，并且测量得到的扩增产物的可检测标记，扩增反应组合物包含：包含靶rna序列的试样；热启动酶组合物，包含逆转录酶、dna聚合酶和可诱导的rna酶h活性，其中，rna酶h的活性受配体抑制；探针序列，包含可检测标记并包含rna酶h的切割序列；第一引物，包含与靶核酸序列的5'端互补的序列；以及第二引物，包含与靶核酸序列的3'端互补的序列。探针可以是包含一个或多个dna序列部分以及rna序列部分的寡核苷酸，其中，rna部分以rna序列的3'端和5'端结合到两个dna序列中的每个dna序列的方式设置在两个dna序列之间。靶核糖核酸序列可以是逆转录酶病毒。可以在大约95℃进行加热反应组合物的步骤。加热步骤可以激活可诱导的rna酶h的活性。配体可以是热不稳定的。在另一实施例中，本发明描述了具有在此描述的热启动酶组合物的微阵列。在又一实施例中，本发明公开了用于检测多个试样中的靶核糖核酸序列的方法，所述方法包括提供具有多个扩增反应组合物的微阵列以及在微阵列中对每个扩增反应组合物进行以下步骤：开始靶rna的逆转录以形成rna:cdna双链；将反应组合物加热至大约90℃或更高的温度，由此激活可诱导的rna酶h的活性以降解rna:cdna双链的rna配基；开始至少一个扩增反应以形成至少一种扩增产物，并且测量得到的扩增产物的可检测标记，每个扩增反应组合物包括：包含靶rna序列的试样；如权利要求18所述的热启动酶组合物，包含逆转录酶、dna聚合酶和可诱导的rna酶h活性，其中，所述rna酶h的活性受所述配体抑制；探针序列，包含可检测标记并包含rna酶h的切割序列；第一引物，包含与靶核酸序列的5'端互补的序列；以及第二引物，包含与靶核酸序列的3'端互补的序列。靶核糖核酸序列可以是逆转录酶病毒。可以在大约95℃进行可以激活可诱导rna酶h的活性的加热反应组合物的步骤。配体可以是热不稳定的。在一个实施例中，本发明公开了具有可以包括具有逆转录酶活性或dna聚合物酶活性的酶的热启动组合物的微阵列的试剂盒。上述实施例具有许多优点，包括使用改进的rna酶h酶来改善rna序列的catacleavetm逆转录pcr检测的灵敏度。改进的检测方法快速、准确并且适合高通量应用。也描述了用于rna序列的高通量检测的方便、易用并且可靠的诊断试剂盒。技术方案除非另有说明，否则这里描述的实施例的实践采用本领域内常规的分子生物学技术。这样的技术对本领域技术人员来讲是公知的，并且在文献中被充分地解释。参见，例如，ausubel等作者，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons公司，ny，n.y.(1987-2008)，包括所有增刊；sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual，第二版，coldspringharbor，n.y.(1989)。除非另有定义，否则这里使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域技术人员所通常理解的意思相同的意思。本说明书也提供了对术语的定义，以有助于解释本申请的公开内容和权利要求书。如果定义与别处的定义不一致，则将以本申请中所阐述的定义为准。rna酶h酶和rna酶h结构域本申请描述了在catacleavetm逆转录pcr反应中使用的改进的热稳定rna酶h组合物。rna酶h水解rna-dna杂交体中的rna。首先在小牛胸腺中确定了rna酶h，随后描述了各种生物体中的rna酶h。实际上，在真核生物和细菌中普遍存在rna酶h活性。尽管rna酶h形成了具有不同的分子量和溶核活性的蛋白质家族，但对于各种同种型来讲，底物要求是相似的。例如，至今所研究的大部分rna酶h用作核酸内切酶，并且需要二价阳离子(例如，mg2+、mn2+)以产生具有5'磷酸末端和3'羟基末端的切割产物。在原核生物中，rna酶h已经被克隆并被广泛地鉴定(参见，crooke等人，(1995)biochemj，312(pt2)，599-608；lima等人，(1997)jbiolchem，272，27513-27516；lima等人，(1997)biochemistry，36，390-398；lima等人，(1997)jbiolchem，272，18191-18199；lima等人，(2007)molpharmacol，71，83-91；lima等人，(2007)molpharmacol，71，73-82；lima等人，(2003)jbiolchem，278，14906-14912；lima等人，(2003)jbiolchem，278，49860-49867；itayam.，proc.natl.acad.sci.美国，1990，87，8587-8591)。例如，大肠杆菌rna酶hii是213个氨基酸长，而rna酶hi是155个氨基酸长。大肠杆菌rna酶hii表现出与大肠杆菌rna酶hi仅具有17％的同源性。从鼠伤寒沙门氏菌克隆的rna酶h与大肠杆菌的rna酶hi仅在11个位点不同，并且从鼠伤寒沙门氏菌克隆的rna酶h是155个氨基酸长(itayam.和kondok.，nucleicacidsres.，1991，19，4443-4449)。也已经从许多病毒、其他细菌和酵母中克隆并纯化出表现出rna酶h活性的蛋白质(wintersberger，u.pharmac.ther.，1990，48，259-280)。在许多情况下，具有rna酶h活性的蛋白质是融合蛋白，其中，rna酶h融合到其他酶(通常为dna聚合酶或rna聚合酶)的氨基端或羧基端。已发现rna酶h结构域与大肠杆菌rna酶hi一直高度同源，但是因为其他结构域有较大改变，所以融合蛋白的分子量和其他特性变化很大。在高等真核生物中，已基于分子量、二价阳离子的作用、对巯基试剂的敏感性和免疫学交叉反应性的不同定义了两类rna酶h(busen等人，eur.j.biochem.，1977，74，203-208)。报道了rna酶hi酶具有范围为68-90kda的分子量，通过mg2+或mn2+活化并且对巯基试剂敏感。相反，已报道rna酶hii酶具有范围为31-45kda的分子量，需要mg2+以对巯基试剂高度敏感并且受mn2+抑制(busenw.和hausenp.，eur.j.biochem.，1975，52，179-190；kanec.m.，biochemistry，1988，27，3187-3196；busen，w.，j.biol.chem.，1982，257，7106-7108)。在ohtanin，harukim，morikawam，kanayas，jbioscibioeng，1999；88(1)：12-9中报道了来自不同物种的rna酶的详细对比。也已经从人类胎盘纯化出具有rna酶hii特性的近同质性的酶(frank等人，nucleicacidsres.，1994，22，5247-5254)。该蛋白质具有大约33kda的分子量，在6.5-10的ph范围内(优选ph为8.5-9)具有活性。该酶需要mg2+并受mn2+和n-乙基马来酰亚胺抑制。切割反应的产物具有3'羟基末端和5'磷酸末端。可在实施例中使用的rna酶h的示例还包括但不限于从嗜热生物体分离出的热稳定rna酶h酶，例如，pyrococcusfuriosusrna酶hii、pyrococcushorikoshirna酶hii、thermococcuslitoralis(嗜热高温球菌)rna酶hi、thermusthermophilus(嗜热栖热菌)rna酶hi。例如，在uemori的第7,422,888号美国专利或公开的walder的第2009/0325169号美国专利申请中描述了在实施例中可以使用的其他rna酶h酶，通过引用将它们的内容包含于此。在一个实施例中，rna酶h酶是与下面示出的pfurna酶hii的氨基酸序列(seqidno:1)40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同源的热稳定rna酶h。使用例如计算机程序dnasismac(takarashuzo)、计算机算法fasta(第3.0版；pearson,w.r.等人，pro.natl.acad.sci.，85：2444-2448，1988)或计算机算法blast(第2.0版，altschul等人，nucleicacidsres，25：3389-3402，1997)可以确定同源性。在另一实施例中，rna酶h酶是具有与seqidno:1的位点5-20、33-44、132-150和158-173对应的至少一个或多个同源区域的热稳定rna酶h(见图12)。同源区域1：gideagrgpaigplvv(seqidno:10；对应于seqidno:1的位点5-20)同源区域2：lrnigvkdskql(seqidno:11；对应于seqidno:1的位点33-44)同源区域3：hkadakypvvsaasilakv(seqidno:12；对应于seqidno:1的位点132-150)同源区域4：klkkqygdfgsgypsd(seqidno:13；对应于seqidno:1的位点158-173)在另一实施例中，rna酶h酶是具有与seqidno:10、11、12或13的多肽序列有50％、60％、70％、80％、90％序列同源性的至少一个同源区域的热稳定rna酶h。这里使用的术语“序列同源性”是指在比较窗口上氨基酸与氨基酸相同或者功能上或结构上相似的程度。因此，例如，通过在比较窗口上比较两个最优比对序列、确定两个序列中出现相同氨基酸的位置数以得到匹配位置数、用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即，窗口尺寸)以及将该结果乘以100以得到序列同源性的百分比，可以计算出“序列同源性百分比”。rna酶h的改进这里使用的术语“改进的rna酶h”可以是可逆地结合到或可逆地键合到导致rna酶h的核酸内切酶活性丧失的抑制因子。抑制因子从rna酶h的释放或去结合使rna酶h的至少一部分或全部的核酸内切酶活性恢复。完整的rna酶h的活性的大约30％-100％可以是足够的。抑制因子可以是配体或化学修饰。配体可以是抗体、适体、受体、辅因子或螯合剂。配体可以键合到rna酶h酶的活性位点由此抑制酶活性，或者配体可以键合到远离rna酶的活性位点的位点。在一些实施例中，配体可诱导构象改变。化学修饰可以是交联(例如，通过甲醛)或酰化。可以通过将含有结合rna酶hii(无活性)的混合物或试样加热到大约65℃至大约95℃或更高的温度，并且/或者可以将混合物或试样的ph降低到大约7.0或更低来实现抑制因子从rna酶hii的释放或去结合。这里使用的术语“未激活rna酶h”或“无活性rna酶h”是指在其他相同实验条件下在50℃确定的与未改进rna酶h(核酸内切酶活性被认为是100％)相比核酸内切酶活性丧失了大于大约75％或大于大约85％或大于大约95％的rna酶h。这里使用的术语“激活rna酶h”或“活性rna酶h”是指如上所述已被改进的在其他相同实验条件下在50℃确定的与未改进rna酶h(核酸内切酶活性被认为是100％)相比核酸内切酶活性恢复了大于大约5％或大约10％或大约15％或大约20％或大约25％或大约30％或更多的rna酶h。如这里所使用，“可诱导”rna酶h活性是指这里描述的改进的rna酶h，其具有可以通过与配体结合来调节的核酸内切酶催化活性。在允许的条件下，rna酶h的核酸内切酶催化活性被激活；然而，在不允许的条件下，该催化活性被抑制。在一些实施例中，改进的rna酶h的催化活性可以在有助于逆转录的温度下被抑制，即，在大约42℃被抑制，并在pcr反应中发现在更高的温度下被激活，即，在大约65℃至95℃被激活。将具有这些特性的改进的rna酶称作“热诱导的”。在其他实施例中，可以通过改变含酶溶液的ph来调节改进的rna酶h的催化活性。如这里所使用，“热启动”酶组合物是指具有酶活性的组合物，该酶活性在大约25℃至大约45℃的不允许的温度下被抑制并在例如大约55℃至大约95℃的与pcr反应匹配的温度下被激活。在特定实施例中，“热启动”酶组合物可以具有本领域已知的‘热启动’rna酶h和/或‘热启动’热稳定dna聚合酶。可以使用例如甲醛来执行rna酶h酶的交联。在一个实施例中，对热稳定rna酶hii进行使用甲醛的受控和受限交联。通过将包含处于无活性状态的改进的rna酶hii的扩增反应组合物加热到大约95℃或更高的温度长达例如大约15分钟的长时间，使交联逆转(reverse)并使rna酶hii活性恢复。通常，交联的程度越低，交联逆转后酶的核酸内切酶活性越高。可以通过改变甲醛的浓度和交联反应的持续时间来控制交联的程度。例如，可以使用大约0.2％(w/v)、大约0.4％(w/v)、大约0.6％(w/v)或大约0.8％(w/v)的甲醛来交联rna酶h酶。使用0.6％甲醛进行交联反应大约10分钟可以足以使来自pyrococcusfuriosus的rna酶hii失活。交联的rna酶hii在大约37℃未显示出任何可测量的核酸内切酶活性。在一些情况下，交联的rna酶hii的可测量的部分再激活可以发生在大约50℃的温度，该温度低于pcr变性温度。为了避免这种不期望的酶再激活，可能需要将改进的rna酶hii储存或保持在低于50℃的温度下，直至其再激活。通常，pcr需要在每一循环将扩增组合物加热到大约95℃以使双链靶序列变性，这也将从rna酶h释放失活因子，部分或全部恢复酶的活性。也可以通过使用例如二羧酸的酰化剂对酶进行赖氨酸残基的酰化来改进rna酶h。可以通过将顺式乌头酸酐加到酰化缓冲液中的rna酶h溶液中并将得到的混合液在大约1-20℃温育5-30小时来执行rna酶h的酰化。在一个实施例中，可以在大约3-8℃进行酰化18-24小时。酰化缓冲液的类型不受具体限制。在实施例中，酰化缓冲液具有在大约7.5至大约9.0之间的ph。可以通过将扩增组合物的ph降低到大约7.0或更小来恢复酰化rna酶h的活性。例如，当将tris缓冲液用作缓冲剂时，可以将组合物加热到大约95℃，导致ph从大约8.7(在25℃)降低到大约6.5(在95℃)。可以根据改进的rna酶h、pcr中使用的缓冲液等来改变扩增反应组合物中加热步骤的持续时间。然而，通常，将扩增组合物加热到95℃长达大约30秒至4分钟足以恢复rna酶h的活性。在一个实施例中，使用诸如invitrogenagpathtm缓冲液的市售缓冲液，在加热大约2分钟后恢复了pyrococcusfuriosusrna酶hii的全部活性。可以使用本领域公知的方法确定rna酶h的活性。例如，根据第一种方法，在限定的测定条件下以及存在等摩尔多聚胸苷酸下，根据特定摩尔数的放射性标记多聚腺苷酸的酸-增溶来定义单位活性(参见epicentrehybridasethermostablernasehi)。在第二种方法中，在限定的测定条件下，根据包含等摩尔量的探针和互补模板dna的反应的相对荧光强度的特定增加来定义单位活性。在实施示例中更详细地解释了第二种方法。因此，在示例性实施例的上下文中公开了根据本发明的改进的rna酶h的使用方法，示例性实施例使用catacleavetm逆转录pcr检测来检测试试样中的rna序列。核酸模板的制备在一些实施例中，试样包括纯化的核酸模板(例如，mrna、rrna及其混合物)。从试样提取和纯化rna的程序在本领域内是公知的。例如，可以使用trizoltm试剂(invitrogen)提取法从细胞分离rna。然后，使用例如nanodroptm分光光度计和agilent2100生物分析仪确定rna的量和质量。在其他实施例中，试样是细胞裂解液，通过使用ph为大约6至大约9的裂解缓冲溶、浓度为大约0.125％至大约2％的两性离子洗涤剂、浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物和诸如蛋白酶k(大约1mg/ml)的蛋白酶裂解细胞来产生所述细胞裂解液。在55℃温育15分钟之后，在95℃处理10分钟使蛋白酶k失活，以产生适合于高效pcr或逆转录pcr分析的“基本上无蛋白质”的裂解液。在一个实施例中，1x裂解试剂包含12.5mmtris乙酸盐或tris-hcl或hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(ph＝7-8)、0.25％(w/v)chaps、0.3125mg/ml叠氮化钠和1mg/ml的蛋白酶k。这里使用的术语“裂解液”是指具有裂解的细胞碎片和核酸的液相。如这里所使用，术语“基本上无蛋白质”是指大部分蛋白质经蛋白酶的水解切割而失活的裂解液。蛋白酶可以包括蛋白酶k。在细胞裂解过程中加入蛋白酶k使核酸酶迅速失活，否则核酸酶会降解靶核酸。可以对“基本上无蛋白质”的裂解液进行除去失活的蛋白质的处理，或者可以不进行该处理。如这里所使用，术语“细胞”可以指原核细胞或真核细胞。在一个实施例中，术语“细胞”可以指诸如细菌的微生物，细菌包括但不限于革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和耐酸细菌等。在某些实施例中，可以使用表面的擦拭取样(swabsampling)来收集待测“细胞”。在其他实施例中，“细胞”可以指病原生物体。在其他实施例中，试样包括病毒核酸，例如，逆转录病毒核酸。在特定实施例中，试样可以包括慢病毒核酸，例如，hiv-1或hiv-2。如这里所使用，“两性离子洗涤剂”指表现出两性离子特性(例如，不具有净电荷、无导电性和电泳迁移率、不与离子交换树脂结合、破坏蛋白质-蛋白质相互作用)的洗涤剂，其包括但不限于chaps、chapso和三甲铵乙内酯衍生物，例如，三甲铵乙内酯衍生物优选是以商品名zwittergent(calbiochem，sandiego，ca)和anzergent(anatrace公司，maumee，oh)出售的磺基三甲铵乙内酯。在一个实施例中，两性离子洗涤剂是chaps(cas号：75621-03-3；可从sigma-aldrich购得，产品号为c3023-1g)，chaps是3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸的缩写(在第4,372,888号美国专利中被更详细地描述)，具有结构：在另一实施例中，chaps以总组合物的大约0.125％至大约2％重量/体积(w/v)的浓度存在。在另一实施例中，chaps以总组合物的大约0.25％至大约1％w/v的浓度存在。在又一实施例中，chaps以总组合物的大约0.4％至大约7％w/v的浓度存在。在其他实施例中，裂解缓冲液可以包括其他非离子型洗涤剂，例如，nonidet、tween或tritonx-100。如这里所使用，术语“缓冲液”是指可以将ph值有效地维持在6和9之间、在25℃具有大约6至大约9的pka的组合物。这里描述的缓冲液通常是生理兼容的缓冲液，其适于酶活性功能并能使生物大分子保持它们正常的生理和生物化学功能。缓冲液的示例包括但不限于hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、mops(3-(n-吗啉基)-丙磺酸)、n-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、三(羟甲基)甲胺酸(tris)、哌嗪-n,n′-二(2-乙磺酸)(pipes)以及含缓冲液的乙酸或磷酸(k2hpo4、kh2po4、na2hpo4、nah2po4)等。这里使用的术语“叠氮化物”由式-n3表示。在一个实施例中，叠氮化物是作为通用杀菌剂的叠氮化钠nan3(cas号26628-22-8；可从sigma-aldrich购得，产品号：s2002-25g)。这里使用的术语“蛋白酶”是水解肽键的酶(具有蛋白酶活性)。蛋白酶也称作例如肽酶、蛋白质酶、肽水解酶或蛋白质水解酶。根据本发明使用的蛋白酶可以是内作用于多肽链中的内切型(肽链内切酶)。在一个实施例中，蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶、蛋白酶k(ec3.4.21.64；从rocheappliedsciences购得，50u/ml重组蛋白酶k(来自毕氏酵母(pichiapastoris))，cat.号为03115887001)。蛋白酶k用于消化蛋白质并从核酸制备物除去污染物。将蛋白酶k加入核酸制备物使核酸酶迅速失活，否则核酸酶会在纯化过程中降解dna或rna。因为蛋白酶k在使蛋白质变性的化学物质的存在下具有活性并且可以在大约95℃的温度下处理大约10分钟而失活，所以它非常适合于本申请。在一个实施例中，诸如李斯特菌(listeria)、沙门氏菌(salmonella)和大肠杆菌的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的裂解也需要包括蛋白酶k(1mg/ml)的裂解试剂。用蛋白酶k在55℃消化细胞裂解液中的蛋白质15分钟，然后在95℃处理10分钟使蛋白酶k失活。冷却后，基本上无蛋白质的裂解液适用于高效pcr扩增。除了蛋白酶k之外或代替蛋白酶k，裂解试剂可以包括丝氨酸蛋白酶，例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、streptogrisin、嗜热蛋白酶、细胞溶解酶(aqualysin)、血纤维蛋白溶酶、黄瓜素(cucumisin)或者羧肽酶a、d、c或y。除了丝氨酸蛋白酶之外，裂解溶液还可以包括：半胱氨酸蛋白酶，例如，木瓜蛋白酶、钙蛋白酶或梭菌蛋白酶；酸性蛋白酶，例如，胃蛋白酶、凝乳酶或组织蛋白酶；或者金属蛋白酶，例如，链酶蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胶原酶、中性蛋白酶、氨基肽酶或者羧肽酶a、b、e/h、m、t或u。蛋白酶k在宽的ph范围(ph4.0-10.0)内稳定并且在具有两性离子洗涤剂的缓冲液中稳定。逆转录-pcr扩增可以将逆转录-pcr程序设置为终点测定或实时测定。cdna扩增基本上需要两个独立的分子合成：(i)从rna模板合成cdna；以及(ii)通过pcr扩增复制新合成的cdna。为试图解决经常与逆转录-pcr相关的技术问题，考虑到该程序的三个基本步骤，已经形成了一些操作规程：(a)rna的变性和反向引物的杂交；(b)cdna的合成；以及(c)pcr扩增。在所谓的“未结合”逆转录-pcr程序中(例如，两步逆转录-pcr)，使用对逆转录酶活性来讲最佳的缓冲液条件，作为单独的步骤来执行逆转录。合成cdna之后，稀释反应物以将mgcl2和脱氧核苷三磷酸(dntp)的浓度降低到对taqdna聚合酶活性来讲最佳的条件，根据标准条件执行pcr(参见第4,683,195号和第4,683,202号美国专利)。相反，“结合”逆转录pcr方法使用对于逆转录酶和taqdna聚合酶的活性来讲通用的缓冲液。在一种情况下，反向引物的退火是加酶之前的单独步骤，然后将酶加到单独的反应器中。在另一种情况下，逆转录酶活性是热稳定tthdna聚合酶的组成部分。在mn2+的存在下执行退火和cdna合成，然后，在通过螯合剂除去mn2+之后，在mg2+的存在下执行pcr。最后，“连续”方法(例如，一步逆转录-pcr)将三个逆转录-pcr步骤整合为单个连续反应，避免了为加入组分或酶而打开反应管。连续逆转录-pcr已经被描述为使用热稳定taqdna聚合酶和tth聚合酶的逆转录酶活性的单一酶体系以及使用amv逆转录酶和taqdna聚合酶的二酶体系，其中，省略了初始的65℃rna变性的步骤。为了维持最高的灵敏度，重要的是在cdna合成之前使rna不被降解。如上所指出的，在一步逆转录pcr操作规程中，rna酶h的存在可能导致rna:dna杂交引物在可以用作逆转录底物之前而被不希望地降解。这里描述的改进的rna酶h通过在逆转录所需的温度即大约45℃-55℃使rna酶h的核酸内切酶催化活性失活，解决了该问题。例如，如这里所使用，热启动rna酶h活性可以是在碱性条件下rna酶h与顺式乌头酸酐反应之后产生的具有可逆化学修饰的rna酶h。当将改进的酶用在利用tris基缓冲液的反应中并将温度升高至95℃时，溶液的ph下降并且rna酶h活性恢复。该方法允许在逆转录开始之前将rna酶h包含于反应混合物中。实时逆转录pcr的第一步是使用模板特异dna引物中的一个来产生互补dna链。在传统pcr反应中，将该产物变性，将第二模板特异引物键合到cdna，并延伸以形成双链dna。然后，在后续的pcr扩增循环中扩增该产物。术语“聚合酶链式反应”(pcr)是指本领域公知的用来增加试样中靶多核苷酸片段的浓度的扩增方法，其中，试样可以是一种多核苷酸或多种多核苷酸。通常，pcr工艺包括将摩尔数过量的两种或多种可延伸的寡核苷酸引物引入10-100ml反应混合物，反应混合物包含试样、缓冲试剂、热稳定dna聚合酶、靶核酸序列、dntp(四种脱氧核苷酸datp、dctp、dgtp、dttp中的每种)以及与试样中的双链靶序列的相反链互补的引物。在dna聚合酶的存在下，对反应混合物进行热循环程序，导致侧端相接有dna引物的期望靶序列的扩增。一个pcr反应可以由大约5至大约100个“循环”组成，“循环”由多核苷酸分子的变性和合成组成。在许多出版物中描述了pcr技术，包括：pcr：apracticalapproach，m.j.mcpherson等人，irl出版社(1991)；pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications，innis等人，academic出版社(1990)；以及pcrtechnology：principalsandapplicationsfordnaamplification，h.a.erlich，stockton出版社(1989)。在许多美国专利中也描述了pcr，包括第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号、第4,965,188号、第4,889,818号、第5,075,216号、第5,079,352号、第5,104,792号、第5,023,171号、第5,091,310号和第5,066,584号美国专利，通过引用将它们中的每个包含于此。如这里所使用，术语“核苷酸”是指包含核苷酸碱基的化合物，其中，核苷酸碱基连接到诸如核糖、树胶醛糖、木糖和吡喃糖及其糖类似物的糖的c-1'碳。术语核苷酸也包含核苷酸类似物。糖可以是取代的或未取代的。取代的核糖包括但不限于一个或多个碳原子(例如，2'碳原子)被一个或多个相同或不同的cl、f、-r、-or、-nr2或卤素基团取代的这些核糖，其中，每个r独立地为h、c1-c6烷基或c5-c14芳基。示例性核糖包括但不限于：2'-(c1-c6)烷氧基核糖、2'-(c5-c14)芳氧基核糖、2',3'-二脱氢核糖、2'-脱氧-3'-卤代核糖、2'-脱氧-3'-氟代核糖、2'-脱氧-3'-氯代核糖、2'-脱氧-3'-氨基核糖、2'-脱氧-3'-(c1-c6)烷基核糖、2'-脱氧-3'-(c1-c6)烷氧基核糖和2'-脱氧-3'-(c5-c14)芳氧基核糖、核糖、2'-脱氧核糖、2',3'-二脱氧核糖、2'-卤代核糖、2'-氟代核糖、2'-氯代核糖和2'-烷基核糖，例如，2'-o-甲基,4'-α-异头核苷酸、1'-α-异头核苷酸、2'-4'-和3'-4'-连接及其他“锁(locked)”或“lna”的二环糖变型(参见，例如，第wo98/22489号、第wo98/39352号和第wo99/14226号pct公开申请以及第6,268,490号和第6,794,499号美国专利)。如这里所使用，术语“核酸”是指寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸可以被修饰或可以包含被修饰的碱基。寡核苷酸是包含2至60个核苷酸的单链核苷酸聚合物。多核苷酸是包含两个或多个核苷酸的核苷酸聚合物。多核苷酸可以是包括退火的寡核苷酸的双链dna，其中，第二链是具有第一寡核苷酸的反向互补序列的寡核苷酸，多核苷酸也可以是包含脱氧胸苷的单链核酸聚合物、单链rna、双链rna或rna/dna异源双链体。核酸包括但不限于基因组dna、rna、cdna、hnrna、snrna、mrna、rrna、trna、mirna、sirna、片段化核酸、从诸如线粒体或叶绿体的亚细胞器获得的核酸以及从可以存在于生物试样上或生物试样中的dna或rna病毒或者微生物获得的核酸。核酸可以由单一类型的糖配基组成，例如，如在rna和dna的情况下，或者可以由不同的糖配基的混合物组成，例如，如在rna/dna嵌合体的情况下。在本说明书中，核苷酸“a”、“c”和“g”可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，在寡核苷酸的序列中，“ra”表示核糖核苷酸a，“rc”表示核糖核苷酸c，“rg”表示核糖核苷酸g。“靶dna”或“靶rna”或“靶核酸”或“靶核酸序列”是指作为dna扩增的目标的核酸。靶核酸序列在pcr反应或逆转录-pcr反应中用作用于扩增的模板。靶核酸序列可以包括自然产生的分子和合成的分子。示例性靶核酸序列包括但不限于基因组dna或基因组rna。如这里所使用，术语“寡核苷酸”有时与“引物”或“多核苷酸”可交换地使用。术语“引物”是指在pcr反应中用作dna合成起始位点的寡核苷酸。引物通常是大约15至大约35个核苷酸长并杂交到与靶序列互补的区域。可以通过本领域已知的任何合适的方法(例如，化学合成)来合成和制备寡核苷酸。寡核苷酸也可以通过商业来源方便地购得。术语“退火”和“杂交”被可交换地使用，并表示一个核酸与另一个核酸的碱基对相互作用，导致形成二级结构、三级结构或其他更高级的结构。在某些实施例中，初级相互作用是通过沃森/克里克以及胡斯坦型氢键的碱基特异性，例如，a/t和g/c。在某些实施例中，碱基堆积和疏水作用也可以有助于二级稳定。“缓冲试剂”或“缓冲液”是加入扩增反应的化合物，其通过调节扩增反应的ph来改变扩增反应的一种或多种组分的稳定性、活性和/或寿命。某些缓冲试剂在本领域内是公知的，并且包括但不限于tris、tricine、mops(3-(n-吗啉基)丙磺酸)和hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)。术语“试样”是指包含核酸材料的任何物质。添加剂是加入组合物的化合物，其改变组合物的一种或多种组分的稳定性、活性和/或寿命。在某些实施例中，组合物是扩增反应组合物。在某些实施例中，添加剂使污染物酶失活、稳定蛋白质折叠和/或减少聚集。在扩增反应中可以包含的示例性添加剂包括但不限于三甲铵乙内酯、甲酰胺、kcl、cacl2、mgoac、mgcl2、nacl、nh4oac、nai、na(co3)2、licl、mnoac、nmp、海藻糖、二甲基亚砜(“dmso”)、丙三醇、乙二醇、二硫苏糖醇(“dtt”)、焦磷酸酶(包括但不限于嗜酸热原体无机焦磷酸酶(thermoplasmaacidophiluminorganicpyrophosphatase)(“tap”))、牛血清白蛋白(“bsa”)、丙二醇、甘氨酰胺、ches、percolltm、金精三羧酸、tween20、tween21、tween40、tween60、tween85、brij30、np-40、tritonx-100、chaps、chapso、mackernium、ldao(n-十二烷基-n,n-二甲胺-n-氧化物)、两性洗涤剂3-10、xwittergent3-14、xwittergentsb3-16、empigen、ndsb-20、t4g32、大肠杆菌ssb、reca、切口内切酶(nickingendonuclease)、7-deazag、dutp和ung、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、非离子洗涤剂、两性洗涤剂、固醇、渗透剂、阳离子以及任何其他可以改变扩增效率的化学制品、蛋白质或辅因子。在某些实施例中，两种或多种添加剂包括在扩增反应中。如这里所使用，“dna聚合酶活性”是指催化脱氧核糖核苷酸的聚合作用的酶活性。通常，酶将在退火到核酸模板序列的引物的3'端开始合成，并将朝着模板链的5'端进行。已知的dna聚合酶包括例如pyrococcusfuriosus(pfu)dna聚合酶(lundberg等人，1991，gene，108:1)、大肠杆菌dna聚合酶i(lecomte和doubleday，1983，nucleicacidsres.11:7505)、t7dna聚合酶(nordstrom等人，1981，j.biol.chem.256:3112)、thermusthermophilus(tth)dna聚合酶(myers和gelfand，1991，biochemistry30:7661)、bacillusstearothermophilus(嗜热脂肪芽孢杆菌)dna聚合酶(stenesh和mcgowan，1977，biochimbiophysacta475:32)、thermococcuslitoralis(嗜热高温球菌)(tii)dna聚合酶(也称作ventdna聚合酶，cariello等人，1991，nucleicacidsres，19:4193)、9°nmdna聚合酶(来自newenglandbiolabs的停售产品)、thermotogamaritima(海栖热袍菌)(tma)dna聚合酶(diaz和sabino，1998brazj.med.res，31：1239)、thermusaquaticus(栖热水生菌)(taq)dna聚合酶(chien等人，1976，j.bacteoriol，127:1550)、pyrococcuskodakaraensis(超好热始源菌)koddna聚合酶(takagi等人，1997，appl.environ.microbiol.63:4504)、jdf-3dna聚合酶(第wo0132887号专利申请)和pyrococcus(火球菌属)gb-d(pgb-d)dna聚合酶(juncosa-ginesta等人，1994，biotechniques，16:820)。以上任何酶的聚合酶活性可以通过本领域公知的方法测定。将根据主题发明的一单位dna聚合酶活性定义为在最佳温度下(例如，对于pfudna聚合酶是72℃)在30分钟内将总dntp中的10纳摩dntp混合催化为聚合形式的酶的量。术语“逆转录酶活性”和“逆转录”是指特征为依赖rna的dna聚合酶的一类聚合酶的酶活性，依赖rna的dna聚合酶可以利用rna链作为模板来合成dna链(即，互补dna、cdna)。“逆转录-pcr”是pcr反应，其使用rna模板和逆转录酶或具有逆转录酶活性的酶在依赖dna的dna聚合酶引物延长的多个循环之前首先产生单链dna分子。多重pcr是指在单一反应中产生多于一种的扩增产物的pcr反应，典型地通过在单一反应中包含多于两种的引物。示例性逆转录酶包括但不限于如第4,943,531号美国专利中描述的莫洛尼鼠白血病病毒(m-mlv)rt、如第5,405,776号美国专利中描述的缺少rna酶h活性的m-mlv-rt的突变形式、牛白血病病毒(blv)rt、劳斯氏肉瘤病毒(rsv)rt、禽成髓细胞瘤病毒(amv)rt和第7,883,871号美国专利中公开的逆转录酶。对于pcr扩增，本发明中使用的酶优选是热稳定的。术语“热稳定”是指对热稳定、耐热并且在例如50℃至90℃的高温下起作用的酶。根据本发明的热稳定酶必须满足对扩增反应有效的单一准则，即，当酶经历升温一段时间(双链多核苷酸的有效变性所必须)时，酶必须不会变得不可逆地变性(失活)。在这一点上所使用的“不可逆变性”表示引起酶活性永久和完全丧失的过程。变性需要的加热条件将取决于例如缓冲液盐浓度以及被变性的多核苷酸的长度和核苷酸组成，但是典型地，从大约85℃(对于较短多核苷酸)至大约105℃范围长达主要取决于温度和多核苷酸长度的时间，典型地，从大约0.25分钟(对于较短多核苷酸)至大约4分钟(对于较长片段的dna)。随着缓冲液盐浓度和/或多核苷酸的gc组分的增加，可以耐受更高的温度。优选地，酶在大约90℃至大约100℃将变得不可逆地变性。根据本发明，未变得不可逆地变性的酶在扩增反应过程中保留至少大约10％或至少大约25％或至少大约50％或更多的功能或活性。在某些实施例中，可以标记一个或多个引物。如这里所使用，在本说明书中可交换地使用的“标记”、“可检测标记”或者“标签”或“可检测标签”是指附着到核苷酸、核苷酸聚合物或核酸结合因子的任何化学配基，其中，附着可以是共价的或非共价的。优选地，标记是可检测的并且可以使核苷酸或核苷酸聚合物对本发明实施者是可检测的。可检测标记包括发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光淬灭剂、着色分子、放射性同位素或闪烁体。可检测标记还包括任何有用的连接分子(例如，维生素h、抗生物素蛋白、链酶亲和素、hrp、蛋白质a、蛋白质g、抗体或其片段、grb2、多组氨酸、ni2+、flag标签、myc标签)、重金属、酶(示例包括碱性磷酸酶、过氧化物酶和荧光素酶)、电子供体/受体，吖啶酯、染料和量热物质。还应想到，可以将质量改变(changeinmass)认为是检测标记，就像表面等离子共振检测的情况。技术人员将容易地识别上面未提到的可以在本发明的操作中使用的有用的可检测标记。一步逆转录-pcr相比于未结合逆转录-pcr具有几点优点。一步逆转录-pcr对反应混合试剂和核酸产物的处理比未结合逆转录-pcr(例如，在两个反应步骤之间为了加入组分或酶打开反应管)更少，因此劳动强度更小，减少了所需的人时(personhour)数。此外，一步逆转录-pcr需要更少的试样，并且降低了被污染的风险。已经证明一步逆转录-pcr的灵敏度和特异性非常适合研究给定试样中的一个到若干个基因的表达水平或病原体rna的检测。典型地，这种程序已经被限于使用基因特异引物来开始cdna合成。结合这些逆转录-pcr技术通过实时检测来测量pcr反应动力学的能力使得能够以高灵敏度准确且精确地确定rna的拷贝数。通过在扩增工艺过程中通过荧光双重标记杂交探针技术荧光检测和测量pcr产物来检测逆转录pcr产物(例如，下面讨论的5'荧光核酸酶测定(“taq-man”)或核酸内切酶测定(“catacleave”))使以上技术变得可能。使用catacleave探针的沙门氏菌靶核酸序列的实时pcr后扩增扩增子的检测费时费力。已经开发了实时方法来对pcr工艺过程中的扩增进行监测。这些方法典型地使用键合到新合成dna的荧光标记探针或在插入双链dna时荧光发射增加的染料。通常将探针设计成在没有目标的情况下，通过两个发色团之间的荧光共振能量转移(fret)使供体发射淬灭。当供体发色团和受体发色团非常接近时，处于激发态的供体发色团可以将能量转移给受体发色团。这种转移常常是非辐射的，并通过偶极-偶极结合发生。充分地增加发色团之间的距离的任何过程将降低fret的效率，从而可以辐射地检测到供体发色团的发射。常见供体发色团包括fam、tamra、vic、joe、cy3、cy5和德克萨斯红。选择受体发色团使得它们的激发光谱与供体的发射光谱重叠。这样的供体发色团和受体发色团的示例是fam-tamra。也存在将淬灭宽范围供体的非荧光受体。合适的供体-受体fret对的其他示例对本领域技术人将是已知的。能够用于实时pcr检测的fret探针的常见示例包括分子信标(例如，第5,925,517号美国专利)、taqman探针(例如，第5,210,015号和第5,487,972号美国专利)和catacleave探针(例如，第5,763,181号美国专利)。分子信标是单链寡核苷酸，其被设计成使得在未结合状态下探针形成供体发色团和受体发色团非常接近并且供体发射减少的二级结构。在合适的反应温度下，信标展开并特异性地结合到扩增子。一旦展开，供体发色团和受体发色团之间的距离增加，从而fret反转并且可以使用专用设备来监测供体的发射。taqman和catacleave技术与分子信标不同之处在于：使用的fret探针被切割，从而供体发色团和受体发色团充分分开以使fret反转。taqman技术使用5'端标记有供体发色团并且3'端标记有受体发色团的单链寡核苷酸探针。用于扩增的dna聚合酶必须包含5'->3'的核酸外切酶活性。taqman探针结合到扩增子的一条链，同时引物结合。随着dna聚合酶延伸引物，聚合酶将最终与结合的taqman探针相遇。这时，聚合酶的核酸外切酶活性将从5'端开始顺序地降解taqman探针。随着探针被消化，包含探针的单核苷酸被释放到反应缓冲液中。供体扩散离开受体，而fret被反转。监测来自供体的发射以确定探针的切割。由于taqman的作用方式，对于每个pcr循环，只可以监测到一次特异扩增子。引物通过taqman靶位点的延伸产生了双链产物，其防止了taqman探针的再次结合，直到扩增子在下一个pcr循环中被变性。第5,763,181号美国专利描述了另一实时检测方法(在此称作“catacleave”)，通过引用将该美国专利的内容包含于此。catacleave技术与taqman不同之处在于：由不具有聚合酶活性的第二酶完成探针的切割。例如，catacleave探针在分子内具有作为诸如限制酶或rna酶的核酸内切酶的目标的序列。在一个实施例中，catacleave探针具有嵌合结构，其中，探针的5'端和3'端由dna构成并且切割位点包含rna。探针的dna序列部分在端部或内部标记有fret对。pcr反应包括将rna-dna二聚体的rna序列部分特异性切割的rna酶h酶(见图2)。切割之后，探针的两段在反应温度下从靶扩增子分离下来并扩散到反应缓冲液中。随着供体和受体分开，fret以与taqman探针相同的方式反转，并可以监测供体的发射。切割和分离再次产生用于catacleave再次结合的位点。以这种方式，单个扩增子能够用作探针切割的多次循环或目标，直到引物延伸通过catacleave探针结合位点。catacleave探针的标记术语“探针”包含具有特异部分的多核苷酸，所述特异部分被设计成以序列-特异方式与特定核酸序列(例如，靶核酸序列)的互补区域杂交。在一个实施例中，寡核苷酸探针的长度在大约15至大约60个核苷酸的范围内。在另一实施例中，寡核苷酸探针的长度在大约18至大约30个核苷酸的范围内。寡核苷酸探针的精确序列和长度部分取决于其结合的靶多核苷酸的性质。可以改变结合的位置和长度，以获得用于特定实施例的合适的退火和熔解性质。可以在许多描述taq-man测定或catacleave的参考文献中找到用于做出这样的设计选择的指导，第5,763,181号、第6,787,304号和第7,112,422号美国专利中描述了taq-man测定或catacleave，通过引用将它们的内容全部包含于此。可以用如上所讨论的“标记”或“可检测标记”来标记探针。在实施例中，标记是通过共价或非共价方式附着到探针的荧光染料化合物。如这里所使用，“荧光染料”是指在被波长比发射的光的波长短的光激发时而发光的荧光化合物。术语“荧光的供体”或“荧光供体”是指发射以本发明中描述的测定来测量的光的荧光染料。更具体地讲，荧光供体提供能量。这种转移是非辐射的，这是为什么将被荧光受体吸收的“光”这个词除去。术语“荧光的受体”或“荧光受体”是指第二荧光染料或吸收从荧光供体发射的能量的淬灭分子。第二荧光染料吸收荧光供体发射的能量并发射波长比荧光供体发射的光的波长长的光。淬灭分子吸收由荧光供体发射的能量。任何发光分子，优选荧光染料和/或荧光淬灭剂，都可以在本发明的实施中使用，包括例如alexafluor350、alexafluor430、alexafluor488、alexafluor532、alexafluor546、alexafluor568、alexafluor594、alexafluor633、alexafluor647、alexafluor660、alexafluor680、7-二乙胺基香豆素-3-羧酸、荧光素、oregongreen488、oregongreen514、四甲基罗丹明、罗丹明x、德克萨斯红染料(texasreddye)、qsy7、qsy33、dabcyl、bodipyfl、bodipy630/650、bodipy6501665、bodipytmr-x、bodipytr-x、二烷氨基香豆素、cy5.5、cy5、cy3.5、cy3、dtpa(eu3+)-amca和ttha(eu3+)amca。在一个实施例中，寡核苷酸探针的3'端核苷酸被封闭或被修饰(render)而不能通过核酸聚合酶延伸。通过将报告分子或淬灭分子附着到探针3'端位置，可以方便地进行这样的封闭。在另一实施例中，报告分子是通过连接配基附着到探针的3'端或5'端的衍生的荧光有机染料。优选地，淬灭分子也是有机染料，根据本发明的实施例，其可以是荧光的或可以不是荧光的。例如，在本发明的优选实施例中，淬灭分子是非荧光的。通常，无论淬灭分子是荧光的还是仅通过非辐射衰减释放由报告分子传递的能量，淬灭剂的吸收能带应该与报告分子的荧光发射能带基本重叠。吸收来自激发的报告分子的能量但不辐射地释放能量的非荧光淬灭分子在本申请中称为显色分子。示例性报告-淬灭对可以选自于包括荧光素的呫吨染料和罗丹明染料。这些化合物的许多合适形式可以广泛地购买到，它们苯配基上的取代基可以用作用于结合到寡核苷酸的位点或者可以用作用于附着到寡核苷酸的结合功能。另一组荧光化合物是在α或β位置具有氨基的萘胺。这样的萘胺化合物中所包括的是1-二甲基萘胺-5-磺酸盐、1-苯胺-8-萘磺酸盐和2-对-甲苯胺基-6-磺酸盐。其他染料包括3-苯基-7-香豆素异氰酸酯、吖啶(诸如9-吖啶异硫氰酸酯和吖啶橙)；n-(p-(2-苯并恶唑基)苯基)马来酰亚胺；苯并恶二唑、二苯乙烯、嵌二萘等。在一个实施例中，报告分子和淬灭分子选自于荧光素和非荧光淬灭染料。有许多用于将报告分子或淬灭分子附着到寡核苷酸的3'端或5'端的连接配基或方法，如下面文献所例举：eckstein编辑，oligonucleotidesandanalogues：apracticalapproach(irl出版社，oxford，1991)；zuckerman等人，nucleicacidsresearch，15：5305-5321(1987)(寡核苷酸上的3'硫醇基)；sharma等人，nucleicacidsresearch，19：3019(1991)(3'巯基)；giusti等人，pcrmethodsandapplications，2：223-227(1993)；fung等人，第4,757,141号美国专利(通过氨基连接臂ii(aminolink..ii)的5'磷酸化氨基，从加利福尼亚，福斯特市的appliedbiosystems获得)；stabinsky，第4,739,044号美国专利(3'氨烷基磷酰基)；agrawal等人，tetrahedronletters，31：1543-1546(1990)(通过磷酰胺酯键而附着)；sproat等人，nucleicacidsresearch，15：4837(1987)(5'巯基)；nelson等人，nucleicacidsresearch，17：7187-7194(1989)(3'氨基)；以及等等。在固相合成开始时，还将罗丹明和非荧光淬灭染料方便地附着到寡核苷酸的3'端，例如，woo等人的第5,231,191号美国专利和hobbs,jr.的第4,997,928号美国专利。catacleave探针向固体支撑的附着在本发明的某些实施例中，寡核苷酸探针可以附着到固体支撑。不同的探针可以附着到固体支撑并且可以用于同时检测试样中不同的靶序列。可以在不同的探针上使用具有不同荧光波长的报告分子，因此能够杂交到不同的探针以单独地检测。用于固定寡核苷酸探针的优选类型的固体支撑的示例包括聚苯乙烯、抗生物素蛋白涂覆聚苯乙烯珠纤维素(avidincoatedpolystyrenebeadscellulose)、尼龙、丙烯酰胺凝胶和激活右旋糖酐、可控孔度玻璃(cpg)、玻璃板和高度交联的聚苯乙烯。由于这些固体支撑化学稳定、易于功能化且表面积好限定，所以它们优选用于杂交和诊断研究。考虑到它们与寡核苷酸合成的兼容性，特别优选的是诸如可控孔度玻璃(500、1000)和非膨胀高度交联聚苯乙烯(1000)的固体支撑。寡核苷酸探针在反应溶液中可以以自由形式存在。可选择地，寡核苷酸探针可以以各种方式附着到固体支撑。例如，探针可以通过将探针的3'端或5'端核苷酸附着到固体支撑而附着到固体支撑。然而，探针可以通过用于使探针远离固体支撑的连接物附着到固体支撑。连接物最优选地是至少30个原子长，更优选地是至少50个原子长。固定到固体支撑的探针的杂交通常需要探针与固体支撑分开至少30个原子，更优选至少50个原子。为了实现这种分开，连接物通常包括位于连接物和3'核苷酸之间的空间。对于寡核苷酸的合成，通常通过酯键将连接臂附着到3'核苷酸的3'-oh，可以使用基础试剂切割酯键以从固体支撑释放寡核苷酸。可以用于将寡核苷酸探针附着到固体支撑的各种连接物在本领域内是已知的。连接物可以由不显著干扰靶序列和附着到固体支撑的探针的杂交的任何化合物形成。连接物可以由能够通过自动合成而容易地添加到连接物上的同聚物寡核苷酸形成。可选择地，诸如功能化聚乙二醇的聚合物可以被用作连接物。与同聚物寡核苷酸相比，优选这样的聚合物，这是由于它们不显著干扰探针与靶寡核苷酸的杂交。特别优选聚乙二醇，因为其可以购得、在有机介质和水介质中都可溶、易于功能化并且在寡核苷酸合成和合成之后的条件下完全稳定。固体支撑、连接物和探针之间的键优选地在高温下在基本条件下除去碱基保护基团的过程中不被切割。优选的键的示例包括氨基甲酸酯键和酰胺键。探针的固定在本领域内是公知的，本领域技术人员可以确定固定条件。根据本方法的一个实施例，将杂交探针固定在固体支撑上。在有利于杂交的条件下，将寡核苷酸探针与核酸试样接触。在未杂交的状态下，淬灭剂淬灭荧光标记。在与目标杂交时，荧光标记与淬灭剂分离而导致荧光。杂交探针固定到固体支撑也能够使与探针杂交的靶序列容易地从试样分离。在后面的步骤中，可以将分离出的靶序列与固体支撑分开，并且可以基于研究者的具体需求根据本领域公知的方法(例如，纯化、扩增)处理靶序列。使用catacleave探针实时检测靶核酸序列可以将标记的寡核苷酸探针用作用于实时检测试样中的靶核酸序列的探针(见图1和图2)。首先，用dna和rna序列合成catacleave寡核苷酸探针，所述dna和rna序列与包含选择的靶序列的pcr扩增子中发现的序列互补。在一个实施例中，用fret对(例如，在探针一端的荧光素分子和在另一端的非荧光的淬灭分子)标记探针。然后，在热稳定核酸聚合酶，热稳定的改进的rna酶h活性、能够与靶多核苷酸杂交的pcr扩增引物对和标记的catacleave寡核苷酸探针的存在下，对靶多核苷酸执行实时核酸扩增。对于靶rna序列的检测，反应混合物包括如这里所描述的用于起始cdna合成步骤的逆转录酶活性。在实时pcr反应过程中，探针与pcr扩增子的杂交形成可以被rna酶h活性切割的rna:dna异源双链。探针被rna酶h切割导致荧光供体与荧光淬灭剂的分离，致使探针的荧光与试样中靶dna序列的实时检测对应地实时增加。在某些实施例中，实时核酸扩增允许在小于大约40个pcr扩增循环内实时检测单一靶dna分子。试剂盒本公开在这里还提供了包括封装单元的试剂盒，封装单元具有用于实时检测试样中的靶核酸序列的一种或多种试剂。试剂盒还可以包含下列项中的一种或多种：缓冲液、说明书以及正对照或负对照。试剂盒可以包括以合适比例混合在一起的试剂的容器以执行这里描述的方法。试剂容器优选地包含单位量的试剂，从而在执行本主题的方法时省略测量的步骤。试剂盒还可以包含用于实时pcr的试剂，该试剂包括但不限于热稳定聚合酶、热稳定的改进的rna酶h、选择以扩增核酸靶序列的引物和标记的catacleave寡核苷酸探针，标记的catacleave寡核苷酸探针与实时pcr产物退火并允许根据这里描述的方法检测靶核酸序列。试剂盒可以包含用于检测两种或更多种靶核酸序列的试剂。在另一实施例中，试剂盒试剂还包含用于从生物试样中提取基因组dna或rna的试剂。试剂盒试剂还可以包括在合适的情况下用于逆转录-pcr分析的试剂。附图说明本领域技术人员将理解的是，下面描述的附图仅用于说明的目的。这些图不意图以任何方式限制本教导的范围。图1是如在第5,753,181号美国专利中描述的catacleavetm探针技术的示意图；图2是使用被核酸内切酶降解的catacleavetm探针实时监测核酸扩增的方法的示意图；图3是根据一个实施例的rna酶hii的酰化的反应方案；图4a、图4b、图4c和图4d是示出了如示例2中所描述的在37℃和50℃测量(未激活)的和在60℃测量(在95℃激活后)的甲醛处理的rna酶hii的活性的曲线图；图5a和图5b是描绘已被甲醛处理的再激活的pfurna酶hii的性能(图5a中的荧光，图5b中的cp值)的曲线图；图6a和图6b是描绘没有再激活的可逆地酰化的pfurna酶hii(图6a)和再激活的可逆地酰化的pfurna酶hii(图6b)的活性的曲线图；图7a和图7b是描绘已被酰化的再激活的pfurna酶hii在ph8.4(图7a)和ph8.7(图7b)的活性的曲线图；图8是描绘了根据示例6的对hiv-1基因组rna测量的未处理的rna酶hii和可逆改进的rna酶hii的核酸内切酶活性的曲线图；图9描绘了示出如示例7中所描述的用于检测hiv-1基因组rna的可逆酰化的pfurna酶hii的灵敏度的曲线图；图10描绘了示出使用未改进的pfurna酶hii和可逆酰化的rna酶hii检测沙门氏菌invarna的曲线图；图11a和图11b描绘了示出如示例1中所描述的rna酶hii的活性的测定的曲线图；图12示出了选择的热稳定的rna酶h(来自pyrococcusfuriosis、pyrococcushorikoshi、thermococcuskodakarensis、archeoglobusprofundis、archeoglobusfulgidis、thermococcusceler和thermococcuslitoralis)之间的氨基酸序列比对。实心条形表示同源区域1-4。具体实施方式下面的示例阐明了使用根据本发明的改进的rna酶h酶组合物的方法。理解的是，在这些示例中描述的方法的步骤不意图成为限制。通过不意图限制本发明的范围的示例，本发明的除了上述目的和优点之外的另外的目的和优点将变得明显。示例1.pfurna酶hii切割试验检测pfurna酶hii的定性的切割活性，其中，反应中pfu的量保持恒定而改变探针:模板比率。也这样检测活性，即，探针:模板比率保持恒定而反应中pfu的量改变。pfurna酶hii的氨基酸序列是seqidno:1并复制如下：如下测定pfurna酶hii的活性。将均含有30ml10x反应缓冲液、20pmol的探针、不同pmol的模板和300mlh2o的反应混合物在64℃下温育10分钟，然后加入1mlpfurna酶hii。以下在示例2中描述反应缓冲液、探针和模板组合物。通过520nm的荧光发射(在490nm激发时)监测pfurna酶hii对荧光素标记的探针的切割。结果在图11a中示出。图11a中的结果表明随着探针:模板比率的增加，反应速率增加。在20:20pmol比率下，反应是立即发生的，意味着pfurna酶hii相对于底物大大过量。已经确定的是，正确地设定了该比率，使用不同浓度的pfu执行实验。结果在图11b中示出。pfurna酶hii被稀释为1x反应缓冲液。随着pfurna酶hii的稀释，切割活性降低。在1:200稀释时，速率随时间是线性的。示例2.pfurna酶hii的可逆甲醛交联使用不同浓度的甲醛对pfurna酶hii进行甲醛交联。使用下面的缓冲试剂。交联缓冲液：20mmhepes，ph7.9，200mmkcl和1mmedta2xrna酶hii储存缓冲液：100mmtris-hcl，ph8.0，200mmnacl和0.2mmedta用475ml交联缓冲液(1.25mg/ml，大约2.5od)稀释25ml的25mg/ml(大约50od)pfurna酶hii。在如表1的以下条件下在冰上进行pfurna酶hii的交联反应：表1【表1】【表】然后，将反应混合物在37℃水浴中温育30分钟。将混合物放置在冰上并将2mlph8.0的2mtris-hcl加入到每个反应混合物。反应完成后，使用预先用2xrna酶hii储存缓冲液平衡的g50微型旋转柱纯化反应混合物，随后使用等体积的丙三醇稀释，以储存在-20℃。使用下述条件执行一系列等温的切割反应来测试上表中的每一交联条件。类型“a”的反应不含有与探针互补的靶。类型“c”的反应不含有任何pfurna酶hii。1x反应缓冲液具有以下组成：32mmhepes-koh，ph7.8100mm乙酸钾4mm乙酸镁0.11％牛血清白蛋白1％二甲亚砜4mmmgcl2inv-cc探针1探针具有以下序列：5'-fam-tctggttgarurururcctgatcgca-iowablackfq-3'(seqidno:2)saltargetoligo具有以下序列：5'-tgcgatcaggaaatcaaccaga-3'(seqidno:3)seqidno:3与seqidno:2互补并用作探针杂交的模板。不激活rna酶hii，在50℃下测量rna酶hii的活性；在95℃下激活rna酶hii15分钟后，在50℃下测量rna酶hii的活性。在指定的试验温度下，通过510nm的荧光发射(在465nm激发时)监测pfurna酶hii对荧光素标记的探针的切割，持续0-30分钟。试验结果表明，4号pfu交联条件导致对切割活性最大程度的抑制，在95℃下激活后，活性恢复最大，并在图中示出。图4a表明，pfu与0.75μl13.8％甲醛的反应导致的对pfu切割活性的抑制与不存在酶时所看到的相似。假处理的pfu试样的活性表示切割活性的基准线。如图4b中所示，在95℃下激活后，甲醛处理的pfu的切割活性恢复到假处理的水平的大约50％。图4b和图4c表明，在实验条件下，模板不存在时不发生探针切割。示例3：使用甲醛交联的rna酶hii检测沙门氏菌inva扩增使用沙门氏菌invacatacleavetmpcr测定法测量甲醛交联的pfurna酶hii的性能。测试未处理的pfurna酶hii和甲醛交联的pfurna酶hii(示例2中的试样#4)在用于检测5至5x106拷贝数的沙门氏菌inva基因靶的catacleavetmpcr测定法中发挥作用的能力。catacleavetm预混液(mastermix)(μl)inv-cc-探针2探针：5'-fam-cgatcagrgrararatcaaccag(seqidno:4)-iowablackfq-3'，**沙门氏菌-f1引物：5'-tcgtcattccattacctacc(seqidno:5)-3'，***sal-invr2引物：5'-tactgatcgataatgccagacgaa(seqidno:6)-3'。如可从图5a和图5b看出的，未处理的pfurna酶hii(图5中的“假处理的pfu”，示例2中的试样#1)和甲醛交联的pfurna酶hii(图5中的“甲醛交联的pfu”，示例2中的试样#4)的pcr效率没有显著的差异。与未处理的rna酶hii相比，甲醛交联的rna酶hii的cp值高大约2.5-3个循环(cycle)。对于使用甲醛交联的rna酶hii的扩增，终点荧光(endpointfluorescence)也更低。示例4：pfurna酶hii的可逆顺式乌头酸酰化使用不同浓度的顺式乌头酸酐(顺式乌头酸酐与酶的摩尔比从50:1到200:1)将pfurna酶hii顺式乌头酸酰化(见图3)。酰化使用下面的缓冲液：2xrna酶hii储存缓冲液：100mmtris-hcl，ph8.0200mmnacl0.2mmedta10x酰化缓冲液500mmtris-hcl，ph7.5650mmkcl10mmedta用475ml酰化缓冲液(1.25mg/ml，大约2.5od)稀释25ml的25mg/ml(大约50od)pfurna酶hii，在冰上进行酰化反应。将反应混合物在4℃温育大约18小时。使用预先用2xrna酶hii储存缓冲液平衡过的g50微型旋转柱纯化反应混合物。用等体积的丙三醇稀释每个反应混合物，以在-20℃储存。下面的表2中示出了顺式乌头酸酐和rna酶hii的摩尔比率和其他酰化的条件。表2【表2】【表】然后，在95℃下执行热处理(再激活)15分钟的情况下在50℃下确定顺式乌头酸酰化的pfurna酶hii的核酸内切酶活性，且不在95℃下执行热处理(再激活)的情况下在50℃下确定顺式乌头酸酰化的pfurna酶hii的核酸内切酶活性。使用下面的rna酶hii测定混合物。rna酶hii测定预混液(1)(μl)*inv-cc-探针1：5'-famtctggttgarurururcctgatcgca(seqidno:2)-iowablackfq-3'**saltargetoligo序列：5'-tgcgatcaggaaatcaaccaga(seqidno:3)-3'图6a(没有再激活)和图6b(再激活)中示出了结果。结果表明，对于在50℃下rna酶hii活性的完全失活，需要顺式乌头酸酐：酶的大约200：1的摩尔比率。当使用tris乙酸盐ph8.4的缓冲液执行再激活(即在95℃下加热)时，在95℃下15分钟后，所使用的所有浓度的顺式乌头酸酐导致rna酶hii活性的几乎完全再激活。为了评估缓冲试剂对再激活是否具有任何影响，使用rna酶hii测定预混液(2)执行相同的再激活工序，所述预混液使用了1x反应缓冲液(在示例2中描述的组合物)。rna酶hii测定预混液(2)(μl)对于每个循环，在50℃下(60个循环)保持30秒的时间测量rna酶hii的活性。结果(未示出)表明，包含ph7.8的hepes-koh(代替tris-hcl)的反应缓冲液也能够再激活。示例5使用酰化的rna酶hii检测沙门氏菌inva使用沙门氏菌inva和catacleavetmpcr测定来测量甲醛交联的pfurna酶hii(示例2中的试样4)的性能。下面是用于扩增的预混液。在ph8.4或ph8.7执行测定。catacleavetm预混液(以μl)ph8.4ph8.7反应数：66反应体积(μl)：2525试样体积(μl)：10.510.55xtris-乙酸缓冲液：30302mmdntp混合物(4mmdutp)：6625μminv-cc-探针2探针*：1.21.2100μm沙门氏菌-f1引物**：1.21.2100μmsal-invr2引物***：1.21.2超纯h2o：112105尿嘧啶dnan-糖基化酶：0.60.6taqdna聚合酶：33已混合的总体积：8787*inv-cc-探针2探针：5'–fam–cgatcagrgrararatcaaccag(seqidno:4)–iowablackfq–3'**沙门氏菌-f1引物：5'–tcgtcattccattacctacc(seqidno:5)–3'，***sal-invr2引物：5'–tactgatcgataatgccagacgaa(seqidno:6)–3'。图7a(在ph8.4)和图7b(在ph8.7)的结果表明，使用tris-乙酸缓冲液(ph8.4或ph8.7)足以在沙门氏杆菌invacatacleave的qpcr测定(95℃热处理15分钟)中获得接近全部再激活的顺式乌头酸酰化的pfurna酶hii。另外，对于产生在扩增中很好地发挥作用并且在没有热激活的情况下具有最小rna酶h活性的热启动pfurna酶hii，需要大约200:1的摩尔比的顺式乌头酸酐和酶并且这些足够。示例6：hiv-1的一步rtpcr扩增所描述和制备的可逆地改进的rna酶hii可以尤其适用于病毒靶rna的一步rtpcr扩增。改进且失活的rna酶hii不切割试样中的靶核糖核酸分子，它允许逆转录以从rna核酸产生病毒cdna分子。在当前示例性实施例中，使用改进的rna酶hii来检测hiv-1靶rna。将示例2中的试样#4(组合物2)和示例3中的试样#4(组合物3)用作改进的rna酶hii。使用未改进的pfurna酶hii(组合物1)作为对照。1xtrisph8.7缓冲液610mmtris碱ph8.7(w/乙酸)50mmkoac2.5mmmgoac1mmdtt组合物1.一步rt-pcrtris8.7缓冲液6(未改进的pfurna酶hii)(以μl)1μlhiv-1_f11-jo引物*7.5μm1μlhiv-1_r6-jo引物**7.5μm1μlhiv-1_cc探针5***10μm1μldntp每种10mm5μl5xtris8.7缓冲液2****1μlrt-pcr酶混合物1μlpfurna酶hii13μlh2o将24μl加入1μlrna模板组合物2.rt-pcrtris8.7缓冲液6，具有示例2的改进的rna酶hii(试样4)(以μl)1μlhiv-1_f11-jo引物*7.5μm1μlhiv-1_r6-jo引物**7.5μm1μlhiv-1_cc探针5***10μm1μldntp每种10mm5μl5xtris8.7缓冲液2****1μlrt-pcr酶混合物1μlpfurna酶hii(甲醛)13μlh2o将24μl加入1μlrna模板组合物3.一步rt-pcrtris8.7缓冲液6，具有示例3的改进的rna酶hii(试样4)1μlhiv-1_f11-jo引物*7.5μm1μlhiv-1_r6-jo引物**7.5μm1μlhiv-1_cc探针5***10μm1μldntp每种10mm5μl5xtris8.7缓冲液2****1μlrt-pcr酶混合物1μlpfurna酶hii(顺式乌头酸酐)13μlh2o将24μl加入1μlrna模板*hiv-1-f11-jo：5'-ccaaggggaagtgacatagcaggaactact-3'(seqidno:7)，**hiv-1_r7-jo：5'-ctgacgacagggctatacattcttactattt-3'(seqidno:8)，***hiv-1_cc探针：5'-fam-tacccttcagrgrararcaaataggatggat-iablk_fq-3'，(seqidno:9)****缓冲液2：tris-乙酸ph8.7，50mmkoac，2.5mmmgoac和1mmdtt。以下是rt-pcr的条件：50℃30分钟95℃15分钟50个循环95℃30秒，60℃30秒和72℃60秒。通过以下示例2中描述的程序测量rna酶hii的核酸内切酶活性。图8中示出了结果，分别示出了对使用组合物1、组合物2和组合物3的rt-pcr产物确定的荧光。如图8所示，酰化的rna酶hii示出了比甲醛交联的rna酶hii的曲线更陡峭的曲线，这可能是由于在示例中使用的条件下，酰化的rna酶hii被再激活得更充分。对于等同的试样，看到：甲醛处理的rna酶hii通过高温温育而全部或完全恢复的活性低于酰化处理的酶通过ph改变而全部或完全恢复的活性。示例7：可逆酰化的rna酶hii的灵敏度为确定改进的rna酶hii的灵敏度，随后使用酰化的rna酶hii(示例3的试样#4)进行了与示例6中描述的程序相同的程序，不同之处在于不同浓度的hiv-1靶rna存在于扩增组合物中。图9中示出了结果。如在图9中所可以看到的，包含酰化的pfurna酶hii的一步rtpcr可以检测到仅10个输入拷贝的hiv-1基因组rna。在负对照中未观察到扩增。另外，反应显示了浓度依赖性(未示出)。示例8：可逆酰化的rna酶hii和未改进的rna酶hii之间的对比1xtrisph8.7缓冲液610mmtris碱ph8.7(w/乙酸)50mmkoac2.5mmmgoac1mmdtt一步rt-pcrcatacleave缓冲液60.5μl沙门氏菌-f1引物*0.5μlsal-invr2引物**1μlinv_cc探针15μm***1μldntp每种10mm2.5μl5xtris8.7缓冲液6****1μlrt-pcr酶混合物0.5μlpfurna酶hii(顺乌头酸酐)17μlh2o将24μl加入1μlrna模板*沙门氏菌-f1引物：5'–tcgtcattccattacctacc–3'(seqidno:5)，**sal-invr2引物：5'–tactgatcgataatgccagacgaa–3'(seqidno:6)，***inv_cc探针1：5'-fam-tctggttgarurururcctgatcgca-3iablk_fq-3'，(seqidno:2)****缓冲液6：tris-乙酸ph8.7，50mmkoac，2.5mmmgoac，1mmdtt。下面是rt-pcr的条件：50℃30分钟95℃15分钟50个循环95℃30秒，60℃30秒和72℃60秒。使用t7/聚合酶系统合成大约1500个核苷酸的沙门氏菌invarna。通过拷贝数将rna量化和标准化为预先等分的每μl106、105、104、103、102和10个拷贝的稀释液。这些稀释液在使用之前在大约-80℃保存。对分别包含106、105、104、103、102和10个拷贝invarna/μl的一步rt-pcr扩增组合物(如上示出的“一步逆转录-pcrccatacleavetm缓冲液6”)在以下条件下进行rt-pcr，然后测量得到的扩增产物的荧光(465-510nm)。使用示例3的样品#4作为酰化的pfurna酶hii。使用包含未改进的pfurna酶hii而不是示例3(试样#4)的酰化的pfurna酶hii的相同的扩增组合物作为对照。图10中示出了结果。如从图10中所可以看到的，包含酰化的rna酶hii的组合物能够检测到少到10个拷贝的具有大约1500个核苷酸的沙门氏菌靶核酸rna。当使用未改进的pfurna酶hii时，观察到大的cp变化(大约10个循环)和灵敏度的丧失(1-2个数量级)。这个试验证明，如果在活性rna酶hii存在下执行rt反应，则灵敏度可能因rna模板的降解而降低。这表现为实时反应的cp值的显著增加。通过引用将说明书中确定的任何专利、专利申请、公布或其他公开的材料全部包含于此。将通过引用包含于此的但与这里阐述的已存在的定义、论述或其他公开材料相冲突的任何材料或其部分，仅被包含到在包含的材料与本公开的材料之间不产生冲突的程度。序列表自由文本作为序列表提交了seqidno:1至seqidno:19的核苷酸或多核苷酸的序列，序列表的内容全部包含到本申请中。当前第1页12当前第1页12