一组用于改良稻米品质的分子标记及水稻改良方法和应用与流程

本发明涉及稻米育种
技术领域：
，具体涉及一组用于改良稻米品质的分子标记及水稻改良方法和应用。
背景技术：
：产量和品质是水稻育种的主要目标，但高产和优质常常存在矛盾。同时，劣质的稻米严重影响口感和市场价格。随着消费水平的提高，人们对优质稻的需求在逐年递增。农民也不愿意种植劣质的水稻品种。因此，如何在不影响产量的前提下改良稻米品质是育种工作者的主要任务，也是消费者关注的主要内容。外观品质是稻米品质考察的重要指标，主要通过粒型(粒长、粒宽和长宽比)和透明度来衡量。国家优质稻谷质量标准明确规定，籼稻一级米的长宽比不小于2.8，垩白粒率不大于10％，垩白度不大于1.0％(gb/t17891-19992000-04-01实施)。所以，细长粒和低垩白度的表型是水稻品质育种的重要选择目标(takano-kainetal.,2009,wangsketal.,2015,silzetal.,2016)。例如，细长粒的表型就是东南亚优质稻米的显著特征。粒型和垩白的变化受到多位点的遗传调控。同时，垩白很容易受到高温、土壤肥力及其他环境因素的影响(siebenmorgenetal.,2013,wangetal.,2015)。尽管一些粒型以及垩白相关的基因相继被克隆，但是粒型的发育过程，尤其是垩白形成的分子机制还并不清楚。因此，如何快捷、准确地选择有利等位基因进行品质育种，仍是育种者面临的一大难题。分子标记技术目前已经广泛地应用于水稻育种。例如，针对gs3的功能位点开发了基于限制性内切酶等标记(fanetal.，2009)，但该标记需要在聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)产物的基础上增加酶切，电泳分型等步骤，增加了操作和劳动成本。也有基于pcr体系开发的四引物扩增标记drr-gl，虽然省去了酶切的步骤，但是其扩增的带型复杂，pcr产物偏小(147～226bp)，电泳带容易弥散，不利于高通量的基因型分析(ramkumaretal.，2010)。上述分子标记，都需要电泳、染色和显带检测，操作不方便。品质基因的分子标记都要经过电泳分型、染色和显带检测的步骤，特别是基于聚丙烯酰氨凝胶电泳的分析费时、费力，限制了其在品质育种中的应用。现有技术并没有一套水稻品质改良的高效的分子标记及选择策略。技术实现要素：本发明的目的在于提供一组用于改良稻米品质的分子标记及水稻改良方法和应用。通过将本发明提供的分子标记应用于水稻品质的改良中，能够在不减产的基础上，降低稻米的垩白，增加长宽比，提高稻米品质。本发明提供了一组用于改良稻米品质的分子标记，所述分子标记包括qss7基因的kasp标记、gs3基因的kasp标记和chalk5基因的kasp标记；所述qss7基因的kasp标记的引物序列如seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3所示；所述gs3基因的kasp标记的引物序列如seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6所示；所述chalk5基因的kasp标记的引物序列如seqidno:7、seqidno:8和seqidno:9所示。本发明还提供了上述技术方案所述分子标记进行基因分型的方法，以植物基因组dna为模板，采用上述技术方案所述分子标记的引物进行聚合酶链式反应，待反应完成后，将pcr扩增的产物借助荧光定量pcr仪器获取对应的产物荧光信号值，最终完成基因分型。优选的是，所述反应的体系包括20～30ng/μldna5μl，权利要求1所述分子标记的引物0.14μl和2×kaspmastermixture。优选的是，所述反应的条件为：94℃，15min；10个逐步递减的循环：94℃，20s；由61℃开始，每个循环逐步递减0.6℃，每个循环持续60s；28个退火循环：95℃，20s；55℃，60s。优选的是，所述荧光信号值的读取条件为25℃，10s。本发明还提供了一种基于上述技术方案所述分子标记改良稻米品质的方法，包括以下步骤：1)以高垩白、短圆粒基因型为qss7/gs3/chalk5类型的待改良品种为受体亲本，以同时包含低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3的种质材料和另一个包含低垩白等位基因qss7的水稻种质为供体亲本；2)将受体亲本分别与供体亲本做杂交，获得杂交种f1；3)将受体亲本作为母本，分别与步骤2)获得的杂交种f1单株做杂交，获得回交种子bc1f1；4)在步骤3)获得的bc1f1植株苗期，提取植株dna样品，利用上述技术方案所述分子标记进行分子标记辅助选择，筛选含有低垩白等位基因chalk5、长粒等位基因gs3和低垩白等位基因qss7的植株，将其作为父本继续与受体亲本分别做杂交，获得bc2f1种子；5)在步骤4)获得的bc2f1植株苗期，提取植株dna样品，重复步骤4)的步骤获得bc3f1种子；6)将步骤5)获得的bc3f1杂交单株种植成行，自交，收获杂交种bc3f2；7)将步骤6)获得的bc3f2种植成50～200株的分离群体，在苗期提取dna，利用上述技术方案所述分子标记筛选同时含有低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3的以及仅含有低垩白等位基因qss7的纯合导入的两类植株即基因型为qss7/gs3/chalk5和qss7/gs3/chalk5两种纯合基因的单株；8)以步骤7)获得的qss7/gs3/chalk5和qss7/gs3/chalk5两种纯合导入的植株的任意一种为母本，另一种为父本，进行杂交获得杂交种f1’；同时，以待改良的受体亲本为母本，以qss7/gs3/chalk5为父本做杂交获得杂交种f1”；9)将步骤8)中获得杂交种f1’和f1”种植成行，令其自交，收获自交种f2’和f2”；11)将步骤9)获得的自交种f2’和f2”种植成200-400规模的分离群体利用上述技术方案所述分子标记筛选在f2’分离群体里筛选出包含qss7/gs3/chalk5、qss7/gs3/chalk5和qss7/gs3/chalk5的三类纯合基因型的单株，收获其自交种；在f2”分离群体里筛选出包含qss7/gs3/chalk5和qss7/gs3/chalk5纯合基因型单株，并收获其自交种；11)所述步骤10)中获得的纯合qss7/gs3/chalk5、qss7/gs3/chalk5和步骤7)中获得的纯合qss7/gs3/chalk5基因型的自交种为实现单基因qss7、gs3或chalk5导入的稻米品质改良型材料；所述步骤10)中获得的纯合qss7/gs3/chalk5和qss7/gs3/chalk5基因型的自交种即为实现双基因聚合的稻米品质改良型材料；所述步骤10)中获得的纯合qss7/gs3/chalk5基因型的自交种即为实现三基因聚合的稻米品质改良型材料。优选的是，所述改良后稻米的基因型组合为qss7/gs3/chalk5。本发明还提供了上述技术方案所述分子标记在改良稻米品质中的应用。本发明还提供了一种上述技术方案所述分子标记改良得到的水稻，所述水稻的基因型组合为qss7/gs3/chalk5。本发明提供了一组用于改良稻米品质的分子标记。通过将本发明提供的分子标记应用于水稻品质的改良中，能够在不减产的基础上，降低稻米的垩白，增加长宽比，提高稻米品质。结合实验结果可知，本发明筛选得到基因型组合为qss7/gs3/chalk5的高品质水稻，长宽比高达4.39±0.10，垩白粒率低至8.2±2.7％，垩白度低至1.5±0.5％。附图说明图1为本发明实施例1提供的分子标记qss7-kasp序列比对图；图2为本发明实施例2提供的分子标记gs3-ksap序列比对图；图3为本发明实施例3提供的分子标记chalk5-kasp序列比对图；图4为本发明实施例5提供的一种qss7近等基因系表型对比示意图；图5为本发明实施例6提供的分子标记制备及基因分型示意图；其中，a为qss7-kasp标记基因分型示意图；b为gs3-kasp标记基因分型示意图；c为chalk5-kasp标记基因分型示意图；图6为本发明实施例7和8提供的分子标记辅助改良珍汕97b稻米品质的制备方法的示意图；图7为本发明实施例7提供的单基因改良珍汕97b稻米品质比较示意图；其中，a为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；b为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；c为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；d为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；图8为本发明实施例8提供的两个或三个有利品质等位基因聚合改良珍汕97b品质比较示意图；其中，a为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；b为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；c为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；d为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图。具体实施方式本发明提供了一组用于改良稻米品质的分子标记，所述分子标记包括qss7基因的kasp标记、gs3基因的kasp标记和chalk5基因的kasp标记；所述qss7基因的kasp标记的引物序列如seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3所示；所述gs3基因的kasp标记的引物序列如seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6所示；所述chalk5基因的kasp标记的引物序列如seqidno:7、seqidno:8和seqidno:9所示。在本发明中，所述分子标记均为kasp标记，具体为qss7-kasp，gs3-kasp和chalk5-kasp分子标记。所述分子标记能够快捷、正确地在苗期对稻米品质进行鉴定，极大地改善了品质改良的操作性，可缩短育种周期。在本发明中，所述分子标记在扩增反应完成后，无需经过电泳分析，无需染色或添加荧光标记，只需要借助荧光定量pcr仪运行扫描程序1分钟，即可完成后续基因的分析工作；同时，基因分型结果可以方便导出，既省去了人工读取基因型的时间，也避免了人为误读所带来的偏差；极大地减轻了基因分型的工作量，显著地提高了检测效率。本发明对所述引物的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的人工合成核苷酸序列的方法即可，如由上海生工生物技术有限公司完成。本发明所述改良稻米品质的分子标记的引物序列如表1所示：表1编号名称序列seqidno:1qss7-fam-fgaaggtgaccaagttcatgctaagctgcaggccagagatgcgtseqidno:2qss7-hex-fgaaggtcggagtcaacggattaagctgcaggccagagatgcgcseqidno:3qss7-rctggtctcatgctcgccaatgcaaseqidno:4gs3-fam-fgaaggtgaccaagttcatgctacgctgcctccagatgctgcseqidno:5gs3-hex-fgaaggtcggagtcaacggattacgctgcctccagatgctgaseqidno:6gs3-raaacagcaggctggcttactctcseqidno:7chalk5-fam-fgaaggtgaccaagttcatgctgaagagagaagtgccaaggatctgcseqidno:8chalk5-hex-fgaaggtcggagtcaacggattgaagagagaagtgccaaggatctgtseqidno:9chalk5-rtggtggtttttgaataaaacaactctgggtca在本发明中，qss7基因的kasp标记的引物的制备原理为：利用qss7的基因id：os07g0603300，序列如seqidno:10所示，在数据库网站(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)查询水稻种质资源中该基因的dna序列变异。具体在本发明实施例中，选取短粒、高垩白的品种珍汕97b(中国公开品种)和长粒、低垩白的种质cypress(来源于国际水稻研究所，编号为：irgc117282)的qss7(os07g0603300)的基因组序列信息进行比对，确定其功能snp变异位点(编码区第1552位snp的变异(c/t))。本发明在qss7的snp变异位点两侧各选择100bp的碱基序列，利用primer5.0软件(www.premierbiosoft.com/faq)设计引物。本发明优选将引物设计在基因的保守序列上(即除去目标功能位点的变异，引物其他的设计区域不存在核酸序列的差异)；并设计两个等位基因的正向引物的最后碱基为第三外显子的功能snp(c/t)，并在两等位基因正向引物的5’端添加不同的荧光基团(fam或hex)；反向引物的设计区间在两等位基因间不存在碱基的变异；设计的引物组合在全基因组结合具有特异性。本发明得到的qss7-fam-f的引物序列包含44个碱基，碱基gc含量为52％，具体序列信息为：gaaggtgaccaagttcatgctaagctgcaggccagagatgcgt；qss7-hex-f的引物序列包含44个碱基，碱基gc含量为57％，具体序列信息为：gaaggtcggagtcaacggattaagctgcaggccagagatgcgc；qss7-r的引物序列包含25个碱基，碱基gc含量为52％，具体序列信息为：ctggtctcatgctcgccaatgcaa。在本发明中，gs3基因的kasp标记的引物的制备原理为：利用gs3的基因id：os03g0407400，序列如seqidno:11所示，在数据库网站(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)查询水稻种质资源中该基因的dna序列变异。具体在本发明实施例中，选取短粒的品种珍汕97b(中国公开品种)和长粒的品种明恢63(中国公开品种)的gs3(os03g0407400)的基因组序列信息进行比对，确定其功能snp变异位点(编码区第165位snp的变异(c/a))。在gs3的功能snp变异位点两侧各选择100bp的碱基序列，利用primer5.0软件(www.premierbiosoft.com/faq)设计引物。要求将引物设计在基因的保守序列上(即除去目标功能位点的变异，引物其他的设计区域不存在核酸序列的差异)；并设计两个等位基因的正向引物的最后碱基为第二外显子的功能snp(c/a)，并在两等位基因正向引物的5’端添加不同的荧光基团(fam或hex)；反向引物的设计区间在两等位基因间不存在碱基的变异；设计的引物组合在全基因组结合具有特异性。本发明得到的gs3-fam-f的引物序列包含42个碱基，碱基gc含量为57％，具体序列信息为：gaaggtgaccaagttcatgctacgctgcctccagatgctgc；gs3-hex-f的引物序列包含42个碱基，碱基gc含量为55％，具体序列信息为：gaaggtcggagtcaacggattacgctgcctccagatgctga；gs3-r的引物序列包含24个碱基，碱基gc含量为50％，具体序列信息为：aaacagcaggctggcttactctc。在本发明中，chalk5基因的kasp标记的引物的制备原理为：利用chalk5的基因id：os05g0156900，序列如seqidno:12所示，在数据库网站(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)查询水稻种质资源中该基因的dna序列变异。具体在本发明实施例中，选取高垩白的品种珍汕97b(中国公开品种)和低垩白的品种明恢63(中国公开品种)的chalk5(os05g0156900)的基因组序列信息进行比对，确定其功能snp变异位点(起始密码子atg上游721bp的snp变异(c/t))。本发明在chalk5的功能snp变异位点两侧各选择100bp的碱基序列，利用primer5.0软件(www.premierbiosoft.com/faq)设计引物。要求将引物设计在基因的保守序列上(即除去目标功能位点的变异，引物其他的设计区域不存在核酸序列的差异)；并设计两个等位基因的正向引物的最后碱基为启动子区的功能snp(c/t)，并在两等位基因正向引物的5’端添加不同的荧光基团(fam或hex)；反向引物的设计区间在两等位基因间不存在碱基的变异；设计的引物组合在全基因组结合具有特异性。本发明得到的chalk5-fam-f的引物序列包含47个碱基，碱基gc含量为49％，具体序列信息为：gaaggtgaccaagttcatgctgaagagagaagtgccaaggatctgc；chalk5-hex-f的引物序列包含47个碱基，碱基gc含量为49％，具体序列信息为：gaaggtcggagtcaacggattgaagagagaagtgccaaggatctgt；chalk5-r的引物序列包含33个碱基，碱基gc含量为36％，具体序列信息为：tggtggtttttgaataaaacaactctgggtca。本发明还提供了上述技术方案所述分子标记进行基因分型的方法，以植物基因组dna为模板，采用上述技术方案所述分子标记的引物进行聚合酶链式反应，待反应完成后，将pcr扩增的产物借助荧光定量pcr仪器获取对应的产物荧光信号值，最终完成基因分型。在本发明中，所述荧光定量pcr仪器优选为cfx-96。在本发明中，所述反应的体系包括20～30ng/μldna5μl，上述技术方案所述引物0.14μl和2×kaspmastermixture。在本发明中，所述引物为上述技术方案所述引物等浓度混合得到的引物。在本发明中，所述反应的条件为：94℃，15min；10个逐步递减的循环：94℃，20s；由61℃开始，每个循环逐步递减0.6℃，每个循环持续60s；28个退火循环：95℃，20s；55℃，60s。在本发明中，所述荧光信号值的读取条件为25℃，10s。正确匹配扩增的信号值很高，而对应的等位基因的信号值会很低。如此如果将两类信号值作为横坐标和纵坐标，即能画出散点图，也能将两等位基因进行分开。本发明还提供了一种基于上述技术方案所述分子标记改良稻米品质的方法。本发明对所述供体基因的基因型没有特殊的限制，在本发明中，所述供体亲本优选为聚合有chalk5、gs3和qss7三种等位基因的水稻种质；或为分别含有三种等位基因的三种水稻种质；或为含有两种等位基因的水稻种质与含有另一种等位基因的水稻种质的组合。在本发明具体实施方式中，优选采用含有两种等位基因的水稻种质与含有另一种等位基因的水稻种质的组合方式；上述含有两种等位基因的水稻种质与含有另一种等位基因的水稻种质作为供体亲本对应的改良稻米品质的方法包括以下步骤：1)以高垩白、短圆粒基因型为qss7/gs3/chalk5类型的待改良品种为受体亲本，以同时包含低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3的种质材料和另一个包含低垩白等位基因qss7的水稻种质为供体亲本；2)将受体亲本分别与供体亲本做杂交，获得杂交种f1；3)将受体亲本作为母本，分别与步骤2)获得的杂交种f1单株做杂交，获得回交种子bc1f1；4)在步骤3)获得的bc1f1植株苗期，提取植株dna样品，利用上述技术方案所述分子标记进行分子标记辅助选择，筛选含有低垩白等位基因chalk5、长粒等位基因gs3和低垩白等位基因qss7的植株，将其作为父本继续与受体亲本分别做杂交，获得bc2f1种子；5)在步骤4)获得的bc2f1植株苗期，提取植株dna样品，重复步骤4)的步骤获得bc3f1种子；6)将步骤5)获得的bc3f1杂交单株种植成行，自交，收获杂交种bc3f2；7)将步骤6)获得的bc3f2种植成50～200株的分离群体，在苗期提取dna，利用上述技术方案所述分子标记筛选同时含有低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3的以及仅含有低垩白等位基因qss7的纯合导入的两类植株即基因型为qss7/gs3/chalk5和qss7/gs3/chalk5两种纯合基因的单株；8)以步骤7)获得的qss7/gs3/chalk5和qss7/gs3/chalk5两种纯合导入的植株的任意一种为母本，另一种为父本，进行杂交获得杂交种f1’；同时，以待改良的受体亲本为母本，以qss7/gs3/chalk5为父本做杂交获得杂交种f1”；9)将步骤8)中获得杂交种f1’和f1”种植成行，令其自交，收获自交种f2’和f2”；12)将步骤9)获得的自交种f2’和f2”种植成200-400规模的分离群体利用上述技术方案所述分子标记筛选在f2’分离群体里筛选出包含qss7/gs3/chalk5、qss7/gs3/chalk5和qss7/gs3/chalk5的三类纯合基因型的单株，收获其自交种；在f2”分离群体里筛选出包含qss7/gs3/chalk5和qss7/gs3/chalk5纯合基因型单株，并收获其自交种；11)所述步骤10)中获得的纯合qss7/gs3/chalk5、qss7/gs3/chalk5和步骤7)中获得的纯合qss7/gs3/chalk5基因型的自交种为实现单基因qss7、gs3或chalk5导入的稻米品质改良型材料；所述步骤10)中获得的纯合qss7/gs3/chalk5和qss7/gs3/chalk5基因型的自交种即为实现双基因聚合的稻米品质改良型材料；所述步骤10)中获得的纯合qss7/gs3/chalk5基因型的自交种即为实现三基因聚合的稻米品质改良型材料。更具体的，在本发明实施例中，优选将含有低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3的品种明恢63以及含有低垩白等位基因qss7的cypress(来源于国际水稻研究所，编号为：irgc117282)作为供体亲本，利用上述分子标记进行稻米品质改良的方法包括以下步骤：1)选择高垩白的水稻品种珍汕97b作为受体亲本，将含有低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3的品种明恢63以及含有低垩白等位基因qss7的cypress(来源于国际水稻研究所，编号为：irgc117282)作为供体亲本；2)将珍汕97b作为母本，分别与供体亲本明恢63和cypress做杂交，获得杂交种f1；3)将珍汕97b作为母本，分别与步骤2)获得的杂种f1单株做杂交，获得回交种子bc1f1；4)在步骤3)中获得的bc1f1植株苗期，提取植株dna样品，利用上述技术方案所述分子标记的制备方法制备的分子标记，进行分子标记选择，筛选含有低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3或低垩白等位基因qss7的植株，将其作为父本继续与与珍汕97b分别做杂交，获得bc2f1种子；具体筛选方法为：由明恢63衍生的bc1f1植株利用针对低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3的标记筛选；由cypress衍生的bc1f1植株利用针对低垩白等位基因qss7的标记筛选；5)在步骤4)中获得的bc2f1植株苗期，提取植株dna样品，利用分子标记辅助选择的方法筛选含有低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3或低垩白等位基因qss7的植株作为父本分别与珍汕97b做回交，获得bc3f1种子。具体筛选方法同步骤4)；6)由明恢63和cypress衍生下来的两套bc3f1单株分别自交，收获杂交种bc3f2；7)将步骤6)收获的两套bc3f2种植成50～200株的分离群体，在苗期提取植株dna样品；由明恢63衍生的bc3f2群体利用针对低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3的标记筛选纯合的chalk5和gs3的植株，由cypress衍生的bc3f2群体利用针对低垩白等位基因qss7的标记筛选纯合的qss7的植株；获得纯合的近等基因系nil-qss7/gs3/chalk5和nil-qss7/gs3/chalk5；8)将两个纯合的近等基因系杂交，获得杂交种f1’；另外，以珍汕97b为母本与nil-qss7/gs3/chalk5杂交，获得杂交种f1”；9)将步骤8)中获得的两类杂种f1’和f1”单株分别种植成行，让其自交获得自交种f2’和f2”；10)将步骤9)中获得的两类f2’和f2”种植成200～400株的分离群体，利用上述技术方案所述分子标记筛选出纯合的nil-qss7/gs3/chalk5，nil-qss7/gs3/chalk5和nil-qss7/gs3/chalk5，以及纯合的nil-qss7/gs3/chalk5和nil-qss7/gs3/chalk5。在本发明中，所述供体亲本为聚合有chalk5、gs3和qss7三种等位基因的水稻种质；或为分别含有三种等位基因的三种水稻种质；或为含有两种等位基因的水稻种质与含有另一种等位基因的水稻种质的组合。在本发明中，所述改良后稻米的基因型组合为qss7/gs3/chalk5。即采用上述改良方法，获得的nil-qss7/gs3/chalk5高产且最为优质；即聚合有三种基因的改良型材料的品质最好。在本发明中，所述改良后稻米的基因型组合为qss7、gs3和chalk5。在本发明中，所述基因型组合qss7、gs3和chalk5能够在不减产的基础上，降低垩白，增加长宽比，改良稻米的外观品质，很好地解决了高产和优质无法兼得的育种矛盾。本发明还提供了上述技术方案所述分子标记或在改良稻米品质中的应用。本发明还提供了一种上述技术方案所述分子标记改良得到的水稻，所述水稻的基因型组合为qss7/gs3/chalk5。在本发明中，水稻材料的品质及农艺性状的考察方法如下：有效穗数：凡一个穗子上有超过5粒饱满的种子即为有效穗，单株有效穗的个数即为有效穗数。穗长：穗颈节到最上部颖尖之间的距离(cm)。千粒重：选取200粒饱满的种子称重，再转换成1000粒的重量即为千粒重(g)。单株产量：单株所有实粒的总重量(g)。粒型：随机选取饱满的种子若干(不少于100粒)，均匀的撒在扫描仪(canoscan,5600f)上，统一在300bpi的条件下扫描成像，并最终用imagej软件将图片数值化(rhaetal.,2015)。粒长和粒宽用毫米(mm)表示，长宽比为长于宽的比值。垩白粒率：使用大米外观品质检测仪(北京东孚久恒仪器技术有限公司株式会社，xljq-jmwt12)测定。垩白是米粒中胚乳的淀粉和蛋白质颗粒积累不够紧密所致，在日光灯下为阴影部分。有垩白的米粒数与全部米粒的比值即为垩白率(用百分比表示)。垩白度：垩白率与垩白大小的乘积即为垩白度。下面结合具体实施例对本发明所述的一组用于改良稻米品质的分子标记及水稻改良方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例所述的试剂配方如未特别说明，均参照j.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002。实施例1分子标记qss7-kasp引物的制备方法，其步骤是：1)利用qss7的基因id(os07g0603300)在数据库网站(http://rice.hzau.edu.cn/rice/)下载珍汕97b(中国公开品种)的基因序列；结合专利“一种水稻粒型基因qss7及制备方法和应用”(专利申请号：2013107534471)的权利要求书1所示的序列信息。比对两个等位基因的基因组序列，确定其功能snp变异位点(编码区第1552位snp的变异(c/t))。2)利用qss7的基因id：os07g0603300，在数据库网站(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)查询水稻种质资源中该基因的dna序列变异。3)在qss7的功能snp变异位点两侧各选择100bp的碱基序列，利用primer5.0软件(www.premierbiosoft.com/faq)设计引物。要求将引物设计在基因的保守序列上(即除去目标功能位点的变异，引物其他的设计区域不存在核酸序列的差异)；并设计两个等位基因的正向引物的最后碱基为第三外显子的功能snp(c/t)，并在两等位基因正向引物的5’端添加不同的荧光基团(fam或hex)；反向引物的设计区间在两等位基因间不存在碱基的变异；设计的引物组合在全基因组结合具有特异性。4)qss7-fam-f的引物序列包含44个碱基，碱基gc含量为52％，具体序列信息为：gaaggtgaccaagttcatgctaagctgcaggccagagatgcgt；qss7-hex-f的引物序列包含44个碱基，碱基gc含量为57％，具体序列信息为：gaaggtcggagtcaacggattaagctgcaggccagagatgcgc；qss7-r的引物序列包含25个碱基，碱基gc含量为52％，具体序列信息为：ctggtctcatgctcgccaatgcaa。基于上述引物扩增得到的分子标记qss7-kasp序列比对结果如图1所示。灰色背景字体加粗标注的snp为功能差异位点，灰色背景加下滑虚线标注序列为正向引物设计区域，波浪下划线标注的序列我反向引物设计区域。zs97b为珍汕97b的缩写。实施例2分子标记gs3-kasp引物的制备方法，包括以下步骤：1)利用gs3的基因id(os03g0407400)在数据库网站(http://rice.hzau.edu.cn/rice/)下载明恢63和珍汕97b(中国公开品种)的基因序列。比对短粒的品种珍汕97b(中国公开品种)和长粒的品种明恢63(中国公开品种)的gs3的基因组序列信息，确定其功能snp变异位点(编码区第165位snp的变异(c/a))。2)在gs3的功能snp变异位点两侧各选择100bp的碱基序列，利用primer5.0软件(www.premierbiosoft.com/faq)设计引物。将引物设计在基因的保守序列上(即除去目标功能位点的变异，引物其他的设计区域不存在核酸序列的差异)；并设计两个等位基因的正向引物的最后碱基为第二外显子的功能snp(c/a)，并在两等位基因正向引物的5’端添加不同的荧光基团(fam或hex)；反向引物的设计区间在两等位基因间不存在碱基的变异；设计的引物组合在全基因组结合具有特异性。3)结合以上几点完成引物设计。gs3-fam-f的引物序列包含42个碱基，碱基gc含量为57％，具体序列信息为：gaaggtgaccaagttcatgctacgctgcctccagatgctgc；gs3-hex-f的引物序列包含42个碱基，碱基gc含量为55％，具体序列信息为：gaaggtcggagtcaacggattacgctgcctccagatgctga；gs3-r的引物序列包含24个碱基，碱基gc含量为50％，具体序列信息为：aaacagcaggctggcttactctc。基于上述引物扩增得到的分子标记gs3-kasp序列比对结果如图2所示。灰色背景字体加粗标注的snp为功能差异位点，灰色背景加下滑虚线标注序列为正向引物设计区域，波浪下划线标注的序列我反向引物设计区域。zs97b为珍汕97b的缩写，mh63为明恢63的缩写。实施例3分子标记chalk5-kasp引物的制备方法，包括以下步骤：1)利用chalk5的基因id(os05g0156900)在数据库网站(http://rice.hzau.edu.cn/rice/)下载明恢63和珍汕97b(中国公开品种)的基因及其启动子序列。比对高垩白的品种珍汕97b(中国公开品种)和低垩白的品种明恢63(中国公开品种)的chalk5的基因组序列信息，确定其功能snp变异位点(起始密码子atg上游721bp的snp变异(c/t))2)在chalk5的功能snp变异位点两侧各选择100bp的碱基序列，利用primer5.0软件(www.premierbiosoft.com/faq)设计引物。将引物设计在基因的保守序列上(即除去目标功能位点的变异，引物其他的设计区域不存在核酸序列的差异)；并设计两个等位基因的正向引物的最后碱基为启动子区的功能snp(c/t)，并在两等位基因正向引物的5’端添加不同的荧光基团(fam或hex)；反向引物的设计区间在两等位基因间不存在碱基的变异；设计的引物组合在全基因组结合具有特异性。3)结合以上几点完成引物设计。chalk5-fam-f的引物序列包含47个碱基，碱基gc含量为49％，具体序列信息为：gaaggtgaccaagttcatgctgaagagagaagtgccaaggatctgc；chalk5-hex-f的引物序列包含47个碱基，碱基gc含量为49％，具体序列信息为：gaaggtcggagtcaacggattgaagagagaagtgccaaggatctgt；chalk5-r的引物序列包含33个碱基，碱基gc含量为36％，具体序列信息为：tggtggtttttgaataaaacaactctgggtca。基于上述引物扩增得到的分子标记chalk5-kasp序列比对结果如图3所示。灰色背景字体加粗标注的snp为功能差异位点，灰色背景加下滑虚线标注序列为正向引物设计区域，波浪下划线标注的序列我反向引物设计区域。zs97b为珍汕97b的缩写，mh63为明恢63的缩写。实施例4基于本发明kasp分子标记进行基因分型的方法：1)基于kasp分子标记反应体系为：5μl(20～30ng/μl)dna，实施例1～3所述引物0.14μl，5μl2×kaspmastermixture(lgc,kbs-1016-002)。2)基于kasp分子标记扩增步骤为：94℃，15min；10个逐步递减的循环(94℃，20s；由61℃开始，每个循环逐步递减0.6℃，每个循环持续60s)；紧接着完成28个退火循环(95℃，20s；55℃，60s)。3)pcr产物利用rt-pcr系统(cfx-96)，扫描获取荧光信号值(25℃，10s)，完成基因分型。结果以excel形式导出，整个过程不超过1分钟。实施例5制备低垩白等位基因qss7导入系：1)将珍汕97b作为受体亲本，包含低垩白等位基因qss7的cypress作为供体亲本。以珍汕97b为母本，cypress为父本做杂交，获得杂种。2)将受体亲本珍汕97b作为母本，与步骤1获得的杂种f1单株做杂交，获得回交种子bc1f1。3)在bc1f1苗期提取植株dna样品，利用分子标记辅助选择的方法筛选含有低垩白等位基因qss7的植株作为父本与受体亲本珍汕97b做杂交，获得bc2f1种子。4)在bc2f1苗期提取植株dna样品，利用分子标记辅助选择的方法筛选含有低垩白等位基因qss7的植株作为父本与受体亲本珍汕97b做杂交，获得bc3f1种子。具体方法同步骤4。5)将步骤4)收获的bc3f1种子播种成行，单株自交，收获杂交种bc3f2。6)将步骤5)收获的两套bc3f2种植成200～400株的分离群体，在苗期提取植株dna样品，利用针对低垩白等位基因qss7的标记筛选纯合的qss7导入的植株。即完成低垩白等位基因qss7导入系的制备，与受体亲本珍汕97b构成一对qss7近等基因系。7)分别收获10株珍汕97和nil-qss7的单株自交种，对垩白及其农艺性状进行考察。结果如图4所示，a为qss7近等基因系稻米外观品质比较示意图；b为qss7近等基因系垩白粒率表型比较柱形图；c为qss7近等基因系垩白度表型比较柱形图；d为qss7近等基因系千粒重表型比较柱形图；图4中所有黑色柱型图代表等位基因qss7，白色柱形图代表等位基因qss7。与珍汕97相比，nil-qss7能够显著降低垩白粒率和垩白度。实施例6分子标记制备及基因分型示意图如图5所示，其中a为qss7-kasp标记基因分型示意图；b为gs3-kasp标记基因分型示意图；c为chalk5-kasp标记基因分型示意图。利用本发明的分子标记对水稻种质进行基因分型：1)挑选一组具有代表性的水稻材料，具体为籼稻7份(明恢63、珍汕97b、93-11、广西红米、黄花占、kasalath和233)，粳稻2份(日本晴和中花11)、非洲栽培稻1份(acc9)以及普通野生稻一份(acc10)。2)利用ctab法提取水稻的幼苗dna(murraymgandthompsonwf,1980)。3)按照实施例1～3的标记制备方法和实施例4的方法对这11份水稻材料进行基因分型。结果显示，实施例1～3中制备的分子标记能够很好的对亚洲栽培稻(籼、粳稻)、非洲栽培稻和野生稻中的qss7、gs3和chalk5进行基因分型。实施例7品质基因聚合改良珍汕97b的获得品质改良新材料，改良方法步骤如图6所示，1)珍汕97b是一个高垩白的水稻品种。将珍汕97b作为受体亲本，将包含低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3的品种明恢63以及包含低垩白等位基因qss7的cypress(来源于国际水稻研究所，编号为：irgc117282)作为供体亲本。2)将珍汕97b作为母本，分别与供体亲本明恢63和cypress做杂交，获得杂交种。3)将珍汕97b作为母本，分别与步骤2中获得的两种杂种f1单株做杂交，获得回交f1(bc1f1)种子。4)在步骤3中获得的bc1f1植株苗期，提取植株dna样品，利用分子标记辅助选择的方法筛选含有低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3或低垩白等位基因qss7的植株作为父本分别与珍汕97b做回交，获得bc2f1种子。具体筛选方法为：由明恢63衍生的bc1f1植株利用针对低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3的标记筛选。由cypress衍生的bc1f1植株利用针对低垩白等位基因qss7的标记筛选。5)在步骤4中获得的bc2f1植株苗期，提取植株dna样品，利用分子标记辅助选择的方法筛选含有低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3或低垩白等位基因qss7的植株作为父本分别与珍汕97b做回交，获得bc3f1种子。具体方法同步骤4。6)分别将由明恢63和cypress衍生下来的两套bc3f1单株自交，收获杂交种bc3f2。7)将步骤6收获的两套bc3f2种植成200～400株的分离群体，在苗期提取植株dna样品。由明恢63衍生的bc3f2群体利用针对低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3的标记筛选纯合的chalk5和gs3的导入的植株，由cypress衍生的bc3f2群体利用针对低垩白等位基因qss7的标记筛选纯合的qss7导入的植株。即获得近等基因系nil-qss7/gs3/chalk5和nil-qss7/gs3/chalk5。另外，以珍汕97b位母本与nil-qss7/gs3/chalk5做杂交，获得杂交种f1。8)将步骤7)中获得的杂种f1单株分别种植成行，让其自交获得自交种f2。9)将步骤8)中获得的f2种植成200～400株的分离群体，利用针对低垩白等位基因chalk5和长粒等位基因gs3的标记筛选出纯合的nil-qss7/gs3/chalk5和nil-qss7/gs3/chalk5。综合以上步骤，完成了3个单个品质有利等位基因导入改良型新材料的制备，改良稻米品质比较示意图如图7所示；其中，a为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；b为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；c为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；d为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图具体农艺性状如表1所示。表1近等基因系的产量及品质性状比较注：表型值±的数值为标准差，标准差后括弧内的英文字母表示在0.05水平下多重比较的显著性。实施例8基因型组合(qss7，gs3和chalk5)在改良稻米品质中的应用，其步骤是：1)将实施例7中获得的纯合近等基因系nil-qss7/gs3/chalk5和nil-qss7/gs3/chalk5做杂交，获得杂交种f1。2)将步骤1)中获得的f1单株分别种植成行，让其自交获得自交种f2。3)步骤2)中获得的f2种植成200～400株的分离群体，利用针对低垩白等位基因chalk5，长粒等位基因gs3以及低垩白等位基因qss7的标记筛选出纯合的nil-qss7/gs3/chalk5，nil-qss7/gs3/chalk5和nil-qss7/gs3/chalk5。4)综合以上步骤，即完成两个有利等位基因聚合和三个有利等位基因聚合品质改良型新材料的制备，两个或三个有利品质等位基因聚合改良型新材料品质比较示意图如图8所示；其中，a为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；b为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；c为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图；d为nil-qss7/gs3/chalk5稻米外观品质示意图。具体农艺性状如表2所示。表2近等基因系的产量及品质性状比较注：表型值±的数值为标准差，标准差后括弧内的英文字母表示在0.05水平下多重比较的显著性。实施例9一种考察品质基因qss7/gs3/chalk5组合在改良水稻品质应用前景的方法：1)利用qss7第三外显子snp(c/t)在数据库网站(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)对应的id(sf0724665404)，下载其对应的518份水稻种质snp信息。2)利用gs3第三外显子snp(c/a)在数据库网站(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)对应的id(sf0316732087)，下载其对应的518份水稻种质snp信息。3)利用chalk5启动子的snp(c/t，-721bp)在数据库网站(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)对应的id(sf0503340415)，下载其对应的518份水稻种质snp信息。4)利用三个基因的snp信息，进行单倍型分析。5)分型结果显示(表3)，最优的组合hap7(qss7/gs3/chalk5)仅占1.7％，而高垩白的珍汕97类型的比例高达57.3％。根据实施例9的方法，能够有效地将高垩白的hap1类型品种改良为优质稻。因此，最优的组合(qss7/gs3/chalk5)在水稻品质育种中具有广阔的利用前景。表3品质基因qss7，gs3和chalk5的功能单倍型分析以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。sequencelisting<110>华中农业大学<120>一组用于改良稻米品质的分子标记及水稻改良方法和应用<130>2017<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>43<212>dna<213>人工序列<400>1gaaggtgaccaagttcatgctaagctgcaggccagagatgcgt43<210>2<211>43<212>dna<213>人工序列<400>2gaaggtcggagtcaacggattaagctgcaggccagagatgcgc43<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3ctggtctcatgctcgccaatgcaa24<210>4<211>41<212>dna<213>人工序列<400>4gaaggtgaccaagttcatgctacgctgcctccagatgctgc41<210>5<211>41<212>dna<213>人工序列<400>5gaaggtcggagtcaacggattacgctgcctccagatgctga41<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6aaacagcaggctggcttactctc23<210>7<211>46<212>dna<213>人工序列<400>7gaaggtgaccaagttcatgctgaagagagaagtgccaaggatctgc46<210>8<211>46<212>dna<213>人工序列<400>8gaaggtcggagtcaacggattgaagagagaagtgccaaggatctgt46<210>9<211>32<212>dna<213>人工序列<400>9tggtggtttttgaataaaacaactctgggtca32<210>10<211>4994<212>dna<213>人工序列<400>10ctgcatggcattcgcacgccattgacacatatctcatcataccatcaccataccacatct60catctcacgcgtcccaaagaaagtgatagtgtacgtacctctgcttgctccttggctttc120tgagctgagctgctctgcagttggatgtgcgtgagctggtgatctgggaggagtcggagt180cggaggaggagatgcctccggcgagggtgctcggcggcggtggtggaggaggggggttgg240gggacgaggcgccggagctggagaggcagatggggtgcatggccggcatcttccagatct300tcgaccgccgccagcgcctgctcaccgcgcgccgccgccgcccgccgcccaagatgctgc360ccccgggcccaggttaacggcgcatttttttttctctgcacatttcttcctgtggcatct420gctcctcttcccctgttctgttttcacaatcaccagcttcactccattcacacacccaag480atcatgtcagctgcgtctcaagcatttttacaagctgtttctcttttcttttccctctct540atcttggttactgtttttaagtattactactactgttttactgtttttaagccatctgtt600tttaagtgttactttctgaattattagctgcaactcgttctgcaaatgttgaccagagat660tagaaaagttgggtgcttcttttgtgggacagagaactactaatttcatgtgttggttga720aactcgagagacaagtcctttcagactattattcaaagtttggtaacagataacagttgg780aaggtgcagtagaacatgcattggttggttttttttaaaaaatgctattaattggaaaat840gggagttttcttcacttcttcacaactgcaggatactaatttcatctttaaccttctttt900attgaaaacagagtacccccctcaccctagataaaagacaacagtacaaaaaaacagatg960gcttacagtagttgtgatcataaaggcctttctttaaagaatgtaatatggcagcacaca1020ttgacataaggacaggcactgacgtggatttgggtgcccagaagtagcatgaggggataa1080cttttcgcactgactgaaaaggacagattatcagttagttactaaaattttcattaatat1140aatgaaactgaagaggacagcttaacatttggttttaaaatttccattctcgtcaatgat1200aaattaactgaagaagacagcttaacaattgattataaaacttccattcatgtatatgat1260taattgattatattattgaacaacaattaagaaaacacacaccttttcaccgctcaaatc1320catccattttgctcataccagactgtcttaataaatagctataattcctcaattcacagt1380ttaggctgtaattataatgtcttcttttttttcttttctaggccatactcttccaagaag1440cagcagcaatgttgcagcgcagagctcaagtacctccaagatcgttctggtaattttcct1500attcgaactccaactgttgtttgttaccacttgccagtaaaaaaaccatcccatgcatgc1560atcagaagtatactttggccacatcaagaagagtactctaacttatggattgcctttgca1620ggagaaaacattcagcaagagcatgaccgagaacagtagcctttcaatagagtcatcaag1680ggcttcctgttcttcctcctcatgctcatccttttcatcacttgatggcaacaaatcgat1740ccaacaagagctgccatacatcaacgagcagctctttgtacagaggccactgaagagctc1800accaagtctgaaggacccagtcatggacaccaggtctggacagtcaaacattggcttcag1860agacattgtgaaggactccattaaccgggacaccggaggccttactgtcaagacctcggt1920gaaggatgcaaggaggaatgggcagtacaaagactcaccaaggcccttgctgctctccaa1980atcaatggatgggacctacgtcatcgggatcgataggagcaccaaggtccctgctaatgc2040tgttgaatccagcaggcgattcccagagcagtcgcgcttctcatgcgatgatcggcggct2100cctgaggccagttgaagctcaagagaacaagaagccttccacaaggctcaaagagcttcc2160cagactgtccttggacagtaggaaagaaaccctgagctcgagttctcgccagaagacctt2220cagttacaggagaaccgacgacagtctcatggacgctcttaggcctcaagattccccagg2280ccataggcgtgccagcagtgtcattgccaagctgatggggttggaagaagcacccaatgc2340tacaggggtgctaactgttgatagctacgagcctgaaagatcaccaagaccagcagaaga2400cacacagaaggagcatccagtaccttcccctagaagattttgtcaggatccacgcgagtc2460gctgccaaaagatgagtctccggcaatgaaaaccaagccttctccaagaattcttactga2520atctgctccttggaggcagcaggagaagattgccaccagtagcaaggcttcacaatgccg2580agatgctgaagttcgaccaaggactgcatctctctatgcctacattgagagaaggggcgg2640ggggcttgagttcttggagtgcaacaaggacttcagggctctcaggatactggaagcgct2700gcacgcaaaggatgccaagcgccagaacgatggcaatggcgcattaacagtggctgctca2760gcaggcaggggatgcactgaacaccagttccagacacttccagcctcccattgtagtcat2820gaagccagcaagaagcactgagaagcagccaggggtttcacttgcttcagttgatcccct2880tgcagggttcagaaacctcaggaagctgcaggccagagatgcgccttgcattggcgagca2940tgagaccagcacaaatgagaaggtccattctcgcatttcaagggcacaatccaagtccga3000tgaacctgctagccgtgcaagctctccaaggcctacaggatcatcaagccccaggacagt3060gcagcggaaggcagagtcagaaaggaggtctcgtccacctgtctcaccgaagtccccaag3120caagaagtccagtgaagcagcctctcctggaggaagaacaagaacaaagccttctcaagg3180gaagaaccaccgtgacaatgaggtctcgaagagtccaagaagcagaatcagcatggtgaa3240ggagatcgacataagcatcatggattttcaaaagcccctagcatcgacaccaagtcacaa3300ggtatacataataaaatcagatataaggaaaccagccagttcaatcaatgttttttacct3360tgtacatcactaattagtaaatatgttctccttttttacagggaactccttcagttcttg3420cttcagatcagaagattaattcactggagaatgccccaagtcccatctctgtcctcgaca3480cgtcatattaccatacaagactgtcatattcattcaaaggtgagaagttgatacagtatt3540ttttctgcattaagataaccaactgcaagaacagcaacatgatggattctactgtttgct3600ctcattcaatccagaagcccatagtgtcattcaaaggacaagcatagttagctgtaagcg3660tgccaatgacgctagtgacagataatctgcaataaaagctacaaccaggtagcttgtggt3720cctgatatggggaggaaccacagcagatggactgttgcagagttgcagctagatgaccag3780aacattgttaggttatagcaaggcccacatgttgcacttgcttatgcaggacagcaggag3840catgatgtgtgtcttctggtgtatatgcattgctagtatagacgtgcc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