一种利用单片段置换系聚合改良水稻抽穗扬花期及灌浆期耐热性的分子育种方法与流程

本发明属于分子育种领域，涉及一种利用单片段置换系聚合改良水稻抽穗扬花期及灌浆期耐热性的分子育种方法，具体涉及一种利用野生稻单片段置换系聚合同步改良水稻抽穗扬花期及灌浆期耐热性的分子育种方法。

背景技术：

高温热害是影响全球水稻产量和品质的主要因子之一，也是中国稻作的主要自然灾害，主要发生在长江流域以南(熊振民，蔡洪法主编.中国水稻.北京:中国农业科技出版社，1992)。水稻高温障碍具有发生突然、成灾面积大、常造成严重减产等特点(王志刚,王磊,林海,庞乾林,鄂志国,张玉屏,朱德峰.水稻高温热害及耐热性研究进展[j].中国稻米,2013,19(1):27–31)。全球热带地区水稻受到高温潜在威胁的面积约有4.0×106hm²,我国长江流域也是水稻花期高温危害的重灾区,湖南、湖北、江西、江苏、四川等地均有水稻高温灾害的报道,受灾严重时不少品种大面积结实率降低到50％以下,损失惨重(汪寿康,汪更文,汪又佳.2003年水稻高温热害情况的调查[j].安徽农学通报,2004,10(1):27–35)。在水稻灌浆成熟期,因高温缩短了灌浆成熟过程,秕粒增多,千粒重下降,形成高温逼熟。因此,水稻耐高温指标应包括两个方面:一方面以花粉在培养基上的萌发率、柱头上的萌发率、结实率的下降为指标筛选孕穗期耐热品种。国外从20世纪70年代开始就以高温胁迫后结实率与常温下结实率的比值为指标进行耐热品种的筛选以及耐热性的数量遗传分析。另一方面以千粒重的下降为指标,筛选灌浆期耐热材料。水稻不同生长期对高温耐性不一样,有的耐热性状qtl/基因在抽穗扬花期对高温有较强的耐性,这一时期对结实率影响不大；有的耐热性状qtl/基因在灌浆期较耐高温,这一时期对千粒重影响不大。因此,将这两类耐热性状qtl/基因聚合到一个材料中是耐热性水稻新种质创造的目标之一。

应用传统育种方法和分子标记辅助育种技术培育水稻耐热品种是目前最有效和可行的控制高温胁迫危害的方法。籼稻是栽培稻的一个亚种，主产区为长江中下游平原、四川盆地，江南各省，所以是遗传研究和育种的主要对象，但是这些地区的双季稻区的早稻抽穗扬花期经常遇到连续高温热害，影响杂交早稻高产组合的产量和品质。元江野生稻是长期生长在云南元江干热河谷地区的普通野生稻，具备了适应高温干旱等恶劣自然环境的特性。因此元江野生稻是重要的耐热及耐旱资源的重要来源。育种家们一直想通过种间杂交的方式把元江野生稻中耐热的基因导入到栽培稻中去，但是由于连锁累赘和杂交后代不容易稳定等原因限制了耐热品种的培育。分子标记技术在提高水稻耐热性育种中的应用大大减少了育种过程中选择的盲目性，快速实现外源优良种质向栽培品种渗透，拓宽了品种的遗传基础。国内外研究人员对耐热性进行了大量的qtl定位研究，有的已经用于标记辅助选择育种实践。

单片段置换系(singlesegmentsubstitutionlines,sssl)是利用杂交，回交和分子标记辅助选择(marker-assistedselection,mas)构建的覆盖作物整个基因组的一系列近等基因系。它的基因组内只有来自供体亲本的一个纯合的染色体片段，而基因组的其余部分与轮回亲本相同。它是进行基因组研究，特别是qtl定位和分子设计育种的理想材料。peleman等(pelemanj.d.andvandervoortj.r.，breedingbydesign[j].trendsplantsci，2003，8(7):330-334)提出了分子设计育种的新概念，包括定位相关性状的qtl、评价这些位点的等位性变异和开展设计育种，有望突破水稻精确高效育种等方面的障碍。目前广东省植物分子育种重点实验室培育了1600多份水稻单片段置换系(xiz.y.,hef.h.,zengr.z.etal.developmentofawidepopulationofchromosomesinglesegmentsubstitutionlines(sssls)inthegeneticbackgroundofanelitecultivarinrice(oryzasatival)[j].genome,2006,49:476-484)，用这些材料鉴定了许多重要农艺性状的qtls及其等位基因(杨自凤，朱海涛，刘自强，等.基于单片段置换系的水稻抽穗期qtl上位性研究[j].华南农业大学学报,2014，35(6):24-28.)，并广泛开展了分子设计育种(梁海福.基于单片段置换系的高产优质水稻设计育种[d].广州:华南农业大学，2011.)。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种利用元江野生稻单片段置换系聚合同步改良水稻抽穗扬花期及灌浆期耐热性的分子育种方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种利用元江普通野生稻单片段置换系聚合改良水稻抽穗扬花期及灌浆期耐热性的分子育种方法，包含如下步骤：

(1)以保藏号为cgmccno.12532的中籼两系骨干恢复系9311为母本，保藏号为cgmccno.12534和cgmccno.12535的元江普通野生稻(荷花塘3号)单片段置换系yj07‐04‐06和yj01‐05‐03杂交得到的f1为亲本，聚合杂交1代，回交3代，再自交3代获得稳定纯合株系bc3f4，每代都是单穗收获；

(2)分子标记辅助第一次选择：种植bc1f1，应用ctab法提取dna，采用所述的元江野生稻单片段置换系yj07‐04‐06对应的分子标记引物对rm3394和rm6223(表1)进行pcr扩增，单片段置换系yj01‐05‐03对应的分子标记引物对rm6515和rm8069(表1)进行pcr扩增，选择同时含有上述4个来源于元江普通野生稻的分子标记条带，分子量分别是404bp，184bp，224bp和392bp的单株与轮回亲本9311回交，种子按单株收获；其中分子标记引物对rm3394正/反向序列为seqidno.1/seqidno.2，rm6223正/反向序列为seqidno.3/seqidno.4；rm6515正/反向序列为seqidno.5/seqidno.6；rm8069正/反向序列为seqidno.7/seqidno.8。

(3)分子标记辅助第二次选择：种植bc2f1，每株提取dna后，再利用所述的分子标记引物对确定bc2f1单株的基因型，同时具有4个来源于上述野生稻的分子标记条带，分子量分别是404bp(rm3394)；184bp(rm6223)；224bp(rm6515)和392bp(rm8069)的单株继续与轮回亲本9311回交。

(4)分子标记辅助第三次选择：种植bc3f1，每株提取dna后，继续利用所述的分子标记引物对确定bc3f1单株的基因型，同时具有4个来源于上述野生稻的分子标记条带，分子量分别是404bp(rm3394)；184bp(rm6223)；224bp(rm6515)和392bp(rm8069)的单株自交，按单株收获种子。

(5)分子标记辅助第四次选择：种植bc3f2，每株提取dna后，继续利用所述的分子标记引物对确定bc3f2单株的基因型，同时具有4个来源于上述野生稻的分子标记条带，分子量分别是404bp(rm3394)；184bp(rm6223)；224bp(rm6515)和392bp(rm8069)的单株自交获得bc3f3，按单株收获种子。

所述的分子育种方法还包括步骤(6)：将步骤(5)筛选到的含纯合基因型的bc3f3株系种在盆钵中，分别在抽穗后第0天移进人工气候室处理5天结束后一直自然条件下正常生长，然后在抽穗后第10天继续移进人工气候室处理5天，结束后一直置于自然条件下正常生长，以结实率及千粒重下降分别评价抽穗扬花期及灌浆期耐热性，筛选获得抽穗扬花期及灌浆期耐热性显著改良的育成新品系。

有益效果：

本发明所提供的一种利用元江野生稻单片段置换系改良中籼两系骨干恢复系抽穗扬花期耐热性的分子育种方法，与传统的回交聚合育种技术相比具有如下优点：传统的回交聚合育种技术存在杂交工作量大、选择可靠性差、育种周期长的缺陷。通过分子标记辅助选择目标性状，可在3～4年内快速高效培育出抽穗扬花期及灌浆期耐热性显著增强的中籼两系骨干恢复系。本发明以元江野生稻单片段导入系yj07‐04‐06、yj01‐05‐03和中籼两系骨干恢复系9311为材料，通过分子标记辅助选择获得了抽穗扬花期及灌浆期耐热性显著提高的新品系“元野3号”，“元野3号”在抽穗扬花期模拟高温胁迫下结实率比对照9311提高18.4％，单株产量为25.02g，比轮回亲本增加8.72g。在灌浆期模拟高温胁迫下千粒重比对照9311提高1.2g，单株产量为36.2g，比轮回亲本增加3.1g。

附图说明

图1分子标记辅助选择抽穗扬花期及灌浆期耐热性显著优于轮回亲本的新品系。

图29311背景中目标区间不同基因型高温胁迫下结实率表现(2014‐2015)。

图39311背景中目标区间不同基因型高温胁迫下千粒重表现(2014‐2015)。

生物材料保藏证明

yj07‐04‐06为籼稻(oryzasativaindica.)，2016年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.12534；

yj01-05-03为籼稻(oryzasativaindica.)，2016年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.12535；

9311为籼稻(oryzasativaindica.)，2016年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.12532。

具体实施方式

实施例1选择亲本

江西省农业科学院水稻国家工程实验室(南昌)超级水稻研究发展中心以蜀恢527为轮回亲本，以元江野生稻(荷花塘3号)为供体亲本，在回交5代自交3代结合覆盖全基因组的ssr分子标记辅助选择，培育了一套蜀恢527为背景的元江普通野生稻单片段置换系112个，其基因组的覆盖率达73.5％。2010年，于水稻抽穗后第1天,选取生长一致的植株装入盆钵,移入人工气候室。每盆栽3株,每份材料设3个重复,常规水肥管理。设定相对湿度为85％,光照12h/d,恒温38.0℃(白天)/28℃(夜晚)。处理5d,处理后,将试验材料移到常温下,直至成熟。调查结实率,各个处理均设对照(对照为田间正常生长条件下各试验材料),以结实率下降为指标评价抽穗扬花期耐热性。筛选出抽穗扬花期耐热性显著提高的导入系11个，其中包括导入系yj07‐04‐06，在模拟高温胁迫情况下，结实率比对照提高13.4％。2010年，于水稻抽穗后第10天,选取生长一致的植株装入盆钵,移入人工气候室。每盆栽3株,每份材料设3个重复,常规水肥管理。设定相对湿度为85％,光照12h/d,恒温38.0℃(白天)/28℃(夜晚)。处理5d,处理后,将试验材料移到常温下,直至成熟。调查千粒重,各个处理均设对照(对照为田间正常生长条件下各试验材料),以千粒重下降为指标评价灌浆期耐热性。筛选出灌浆期耐热性显著提高的导入系13个，其中包括导入系yj01-05-03，在模拟高温胁迫情况下，千粒重比对照提高13.4％。

导入系yj07‐04‐06和yj01-05-03为栽培籼稻(oryzasativaindica)，2016年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号分别为cgmccno.12534和cgmccno.12535；9311为栽培籼稻(oryzasativaindica)，2016年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号分别为cgmccno12532。

实施例2

(1)2011年夏季在江西省农业科学院南昌试验站分别种植yj07‐04‐06和9311各一行，9311(cgmccno.12532)为母本，yj07‐04‐06(cgmccno.12534)和yj01-05-03(cgmccno.12535)杂交得到的f1为父本配制杂交组合产生f1，成熟后全部混收。2011年冬季在海南三亚种植3行f1，回交获得bc1f1，成熟后全部混收。田间管理按常规方法进行。

(2)分子标记辅助选择：2012年夏季在江西省农业科学院南昌试验站种植50行bc2f1，每行8株，每株采集叶片放入2ml的eppendorf管中，装人小钢珠，利用高通量组织研磨仪高速震荡研磨之后加入1.25％的sds提取液600μl，应用sds法提取dna，采用yj07‐04‐06(cgmccno.12534)和9311(cgmccno.12532)导入片段上的分子标记(表1)进行pcr扩增，扩增体系10μl，dna模板1μl，94℃预变性5min，94℃变性0.5min，57℃复性0.5min，72℃延伸1min，32个循环后，72℃再延伸10min，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度为8％，电泳缓冲液为0.5倍tbe，175v恒压电泳1.5小时。选择含有4个分子标记的10个单株继续回交获得bc3f1种子。

(3)2012年冬季在海南三亚将bc3f1种植10行，每行8株，每株采集叶片，提取dna后，利用表1提供的分子标记确定bc3f1单株的基因型，选择4个标记都含有的单株继续自交得到bc3f2(同时具有表1中来源于上述野生稻的4个分子标记条带)。

表1yj07‐04‐06和yj01-05-03导入片段的ssr分子标记

(4)2013年冬季在海南三亚将bc3f2种植40行，每行8株，每株采集叶片，提取dna后，利用表1提供的分子标记确定bc3f2单株的基因型，选择4个标记纯合的单株自交得到bc3f3(同时具有表1中来源于上述野生稻的4个分子标记条带)。

(5)人工气候室模拟高温胁迫鉴定：2014‐2015年，将纯合的bc3f4及bc3f5株系于抽穗后第1天,选取生长一致的植株装入盆钵,移入人工气候室。每盆栽3株,每份材料设3个重复,常规水肥管理。设定相对湿度为80％,光照11h/d,恒温38.0℃(白天)/28℃(夜晚)。处理5d,处理后,将试验材料移到常温下进行正常生长。然后于抽穗后10天继续移入人工气候室进行高温胁迫处理5天。处理后,将试验材料移到常温下,直至成熟。每盆栽3株,每份材料设3个重复,常规水肥管理。设定相对湿度为80％,光照11h/d,恒温38.0℃(白天)/28℃(夜晚)。处理后,将试验材料移到常温下,直至成熟。调查结实率及千粒重,及其他重要农艺性状，各个处理均设对照(对照为田间正常生长条件下各试验材料),分别以结实率和千粒重下降为指标评价抽穗扬花期和灌浆期的耐热性。

通过方差分析，经过两个世代以上鉴定的纯系中选择在人工气候室中扬花期及灌浆期人工模拟高温胁迫情况下结实率及千粒重显著高于轮回亲本的株系，即为育成品系“元野3号”。

由于本发明选择的耐热株系背景亲本为9311，其为中籼两系骨干恢复系代表性品系，因此通过该分子育种方法选育的“元野3号”品系显著特点是配合力高，具有抽穗扬花期及灌浆期耐热显著提高的特点。

注:rm编号的引物来自利用temnykh等(2000)和mccouch等(2002)公布的ssr引物序列合成的ssr标记(temnykhs,parkwd,ayresn,etal.mappingandgenomeorganizationofmicrosatellitesequencesinrice(oryzasatival.).theoreticalandappliedgenetics,2000,100(5):697-712；mccouchsr,teytelmanl,xuy,etal.developmentandmappingof2240newssrmarkersforrice(oryzasatival.).dnaresearch,2002,9(6):199-207.)。