一种从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法与流程

本发明涉及大豆蛋白提取技术领域，具体涉及一种从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法。

背景技术：

1998年，中国正式实施“国家大豆行动计划”，积极推动大豆产业的发展。大豆营养丰富，特别是蛋白质中氨基酸组成经fao/who氨基酸评分与动物蛋白相当，按沉降系数可将大豆蛋白分为2s、7s、11s、15s，其在大豆蛋白中所占比例分别为8％、35％、52％、5％，即7s、11s两种蛋白占比之和接近90％。目前，大豆已成为世界各国的重要食品和发展畜牧业的重要蛋白质资源。因此，对大豆进行合理科学的开发利用具有重要意义。富硒大豆是指大豆中硒含量高于0.02-0.3mg/kg的大豆。1973年，世界卫生组织(who)和国际营养组织确认硒是人和动物体内必需的微量元素之一。大量研究表明很多种疾病都与硒缺乏密切相关，现已确认与硒缺乏相关的疾病达40余种，其中甚至包括癌症、sars和艾滋病。后续又有诸多文献报道硒具有提高机体抵御氧化损伤能力、提高机体免疫力、预防肿瘤及降低癌症发病率等功效。然而，硒资源的分布却严重地不平衡。在中国的1094个县市中，土壤硒含量达到国际公布正常临界值(0.1mg/kg)的县只有1/3。其中含量小于或等于0.02mg/kg的占29％，为严重缺硒地区。将大豆蛋白这一重要蛋白资源与硒结合，在增加了大豆产业附加值，同时也有助于解决硒资源分布不平衡的问题。

已有文献报道大豆中蛋白的分离方法，例如thanh采用tris-hcl缓冲液提取大豆中的11s和7s蛋白；wolf、robertsandbriggs、eldridgeandwolf、koshiyama也先后尝试不同方法提取大豆蛋白，但他们均未对富硒大豆蛋白提取进行研究，并且关于大豆蛋白中硒提取率的研究尚未有人报道。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，该方法简单易操作，且可有效地富集高硒蛋白组分，适合于工业化生产。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，包括如下步骤：

1、富硒大豆的脱脂：

将干燥的富硒大豆籽粒粉碎，得到富硒大豆粉，按照液料比为1g:20-30ml的比例，将石油醚加入富硒大豆粉中，室温下密封搅拌浸提脱脂2-4h，脱脂结束后静置，待沉淀完全后，分离，将所得的沉淀干燥去除石油醚，得到脱脂豆粉；

2、去除脱脂豆粉中的非蛋白组分：

按照料液比为1g:25-35ml的比例，将脱脂豆粉加入0.01-0.05mol/l磷酸氢二钠溶液中，室温下搅拌浸提45-90min，浸提结束后，离心分离，取上清液a，即为大豆蛋白溶液；

3、提取11s大豆球蛋白：

向大豆蛋白溶液中加入nacl，使nacl的终浓度为45-55mmol/l，用0.5-1.5mol/l的盐酸溶液调节ph至6-6.5后，离心分离，得沉淀a和上清液b，沉淀a即为11s大豆球蛋白；

4、去除11s大豆球蛋白和7s大豆球蛋白以外的蛋白质组分：

将步骤3所得的上清液b用0.5-1.5momol/l的盐酸溶液调节ph至5-5.5后，离心分离，得沉淀b和上清液c，沉淀b即为11s大豆球蛋白和7s大豆球蛋白以外的蛋白质组分；

5、提取7s大豆球蛋白：

将步骤4所得的上清液c用0.5-1.5momol/l的盐酸溶液调节ph至4.5-5后，离心分离，得沉淀c，沉淀c即为7s大豆球蛋白。

进一步，将步骤1分离所得的上清液回收石油醚进行循环利用。

进一步，离心分离时离心转速3000-3500r/min，离心时间为10min。

进一步，步骤3中，加入nacl，使nacl的终浓度为50mmol/l。

进一步，盐酸溶液的浓度为1mol/l。

进一步，步骤3中，用盐酸溶液调节ph至6.4。

进一步，步骤4中，将步骤3所得的上清液b用盐酸溶液调节ph至5.25.

进一步，步骤5中，将步骤4所得的上清液c用盐酸溶液调节ph至4.8。

与现有技术相比，本发明的优点与有益效果在于：

将富硒大豆进行脱脂处理后，进行以下两个处理：①在普通大豆蛋白提取方法的基础上，通过加入nacl，利用盐溶作用，使7s大豆球蛋白增溶，减少对11s大豆球蛋白的干扰，从而使11s大豆球蛋白得到有效富集；②通过调整ph至5.25，以除去11s大豆球蛋白和7s大豆球蛋白以外的蛋白质组分(这部分蛋白是以2s大豆球蛋白和15s大豆球蛋白为主的混合物)，从而使后续的7s大豆球蛋白富集效率得到提升。试验表明，此种方法得到的11s、7s大豆球蛋白单位质量硒含量分别是脱脂豆粉的3.16倍和2.47倍。

附图说明

图1为不同硒含量的富硒大豆中提取得到的11s、7s大豆球蛋白的sds-page凝胶电泳图谱。

1泳道为富硒大豆蛋白；2-5泳道分别为1#、2#、3#、4#富硒大豆蛋白中提取得到的11s大豆球蛋白组分；6-9泳道分别为1#、2#、3#、4#富硒大豆蛋白中提取得到的7s大豆球蛋白组分

图2：不同硒含量的富硒大豆提取得到的大豆蛋白的sds-page凝胶电泳图谱。

1泳道为普通大豆蛋白；2-5泳道分别为1#、2#、3#、4#富硒大豆中提取所得大豆蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

1、富硒大豆的脱脂：

将干燥的1#富硒大豆(硒含量为3.25±0.09mg/kg)籽粒用粉碎机磨碎至80目，得到富硒大豆粉，称取50g富硒大豆粉，加入1500ml石油醚中，保鲜膜封口后，置于磁力搅拌器上，室温下(25℃)搅拌浸提脱脂2h，脱脂结束后静置，待沉淀完全后，分离，将所得的上清液回收石油醚用于循环利用，将所得的沉淀在通风橱中铺开以挥干石油醚，24h后收集，得到脱脂豆粉，标记为1#脱脂豆粉；

2、去除脱脂豆粉中的非蛋白组分：

称取30g脱脂豆粉，加入1000ml0.02mol/l的磷酸氢二钠溶液(ph约为8.5)中，室温搅拌浸提45min，浸提结束后，以3000r/min的转速离心10min，取上清液a，即为大豆蛋白溶液，标记1#大豆蛋白溶液；

3、提取11s大豆球蛋白：

向大豆蛋白溶液中加入nacl，使nacl的终浓度为50mmol/l，用1mol/l的盐酸溶液调节ph至6.4后，以3000r/min的转速离心10min，分离得沉淀a和上清液b，沉淀a即为11s大豆球蛋白，标记为1#11s大豆球蛋白，冻干备用；

4、去除11s大豆球蛋白和7s大豆球蛋白以外的蛋白质组分：

将步骤3所得的上清液b用1mol/l的盐酸溶液调节ph至5.25后，以3000r/min的转速离心10min，分离得沉淀b和上清液c，沉淀b即为11s大豆球蛋白和7s大豆球蛋白以外的蛋白质组分；

5、提取7s大豆球蛋白：

将步骤4所得的上清液c用1mol/l的盐酸溶液调节ph至4.8后，以3500r/min的转速离心10min，分离得沉淀c，沉淀c即为7s大豆球蛋白，标记为1#7s大豆球蛋白，冻干备用。

实施例2-4

实施例2-4的操作同实施例1，唯一不同的是原料富硒大豆不同，分别为2#富硒大豆、3#富硒大豆和4#富硒大豆，2#富硒大豆、3#富硒大豆和4#富硒大豆的硒含量分别为4.98±0.08mg/kg、7.34±0.04mg/kg、9.87±0.12mg/kg。

一、富硒大豆蛋白组分中蛋白含量测定和纯度检测

1、采用凯氏定氮法(gb/t5009.5-2003)测定各蛋白组分的蛋白含量：

经检测，四种不同硒含量的富硒大豆脱脂得到的脱脂豆粉中蛋白平均含量为43.63±0.1％，提取出的11s和7s大豆球蛋白组分的蛋白平均含量分别为94.03±0.18％和93.73±0.26％，蛋白纯度得到了有效提高。

2、采用sds-page法检测11s和7s大豆球蛋白纯度及普通大豆和富硒大豆中其蛋白成分的变化。

检测方法具体如下：

2.1、配制试剂：

称取18.17gtris(三羟甲基氨基甲烷)、0.4gsds(十二烷基磺酸钠)溶于水，用1mol/lhcl溶液调ph至8.8，定容至100ml，为分离胶缓冲液；

称取6.06gtris、0.4gsds溶于水，用1mol/lhcl溶液调ph至6.8，定容至100ml，得浓缩胶缓冲液；

称取30gacr(丙烯酰胺)和0.8gbis(甲叉双丙烯酰胺)，用蒸馏水溶解后定容至100ml，得acr/bis贮备液；

取4ml双蒸水、1.0ml0.5mol/ltris-hcl(ph6.8)缓冲液、0.8ml甘油、1.6ml10wt％sds溶液、0.4ml巯基乙醇和0.2ml0.1wt％溴酚蓝溶液，总体积8ml，混匀，作为样品缓冲液，于4℃保存；

称取3.03gtris、14.14ggly(甘氨酸)、1.0gsds溶于水，用hcl溶液调ph至8.3，定容至1000ml，得电极缓冲液；

称取1g考马斯亮蓝r-250溶于250ml甲醇及100ml冰醋酸中，溶解后定容至1000ml，得染色液；

10wt％过硫酸铵溶液用时现配，采用10％(v/v)醋酸溶液脱色。

2.2、检测过程：

将实施例1-4提取得到的1#11s大豆球蛋白、2#11s大豆球蛋白、3#11s大豆球蛋白和4#11s大豆球蛋白溶于样品缓冲液中，配置1mg/ml的1#11s大豆球蛋白样品液、2#11s大豆球蛋白样品液、3#11s大豆球蛋白样品液、4#11s大豆球蛋白样品液。

将实施例1-4提取得到的1#7s大豆球蛋白、2#7s大豆球蛋白、3#7s大豆球蛋白和4#7s大豆球蛋白溶于样品缓冲液中，配置1mg/ml的1#7s大豆球蛋白样品液、2#7s大豆球蛋白样品液、3#7s大豆球蛋白样品液、4#7s大豆球蛋白样品液。

取4ml分离胶缓冲液、6.7mlacr/bis贮备液、5.3mlh2o、0.8ml10wt％过硫酸铵溶液和0.008mltemed(四甲基乙二胺)，混匀，制得浓度为12.5％的分离胶，迅速沿长玻璃板将分离胶加入两块玻璃板之间，过程中不能出现气泡，加到距短玻璃板上边缘3cm处，立即覆盖2-3mm水层，待分离胶与水之间形成清晰界面，即为聚合完毕。

取1.25ml浓缩胶缓冲液、0.75mlacr/bis贮备液、3mlh2o、0.015ml10wt％过硫酸铵溶液和0.005mltemed，混匀，制得浓缩胶，吸去分离胶上面的水分，将配置好的浓缩胶注入分离胶之上，立即插入点样槽模板，待浓缩胶聚合好之后拔出模板，用微量注射器分别吸取5μl标准蛋白样品液、25μl1#11s大豆球蛋白样品液、25μl2#11s大豆球蛋白样品液、25μl3#11s大豆球蛋白样品液、25μl4#11s大豆球蛋白样品液、25μl1#7s大豆球蛋白样品液、25μl2#7s大豆球蛋白样品液、25μl3#7s大豆球蛋白样品液、25μl4#7s大豆球蛋白样品液、25μl1#大豆蛋白溶液、25μl2#大豆蛋白溶液、25μl3#大豆蛋白溶液和25μl4#大豆蛋白溶液，从左至右依次点样。

加样完毕后，向两槽注入上述配制好的电极缓冲液，接通电源，调节电流至15ma，当样品缓冲液中的指示剂溴酚蓝进入分离胶后，加大电流至30ma，电压恒定在80-100v之间，约2h后，指示剂到达距前沿1-2cm时终止电泳。

取出凝胶后在水中浸泡10min，然后浸入染色液中染色，约45min后将凝胶移入脱色液中脱色，每隔0.5h换一次脱色液，待蓝色基本脱掉再继续放在脱色液中浸泡至蛋白条带清晰为止，采用bandscan软件分析蛋白条带。

2.3、检测结果：

结果如图1和图2所示，从图1可以看出，四种不同硒含量的富硒大豆提取的11s大豆球蛋白的亚基分子量均在35kda以下，7s大豆球蛋白的亚基分子量在50kda以上。经bandscan软件分析，四种不同硒含量的富硒大豆提取的11s大豆球蛋白、7s大豆球蛋白的平均纯度分别为89.14％、91.20％，由此可见，本发明方法分离得到的11s大豆球蛋白和7s大豆球蛋白的纯度很高。

从图2可以看出，普通大豆和不同硒含量的富硒大豆的蛋白条带基本一样，由此可见，普通大豆和富硒大豆中其蛋白成分基本一致。

二、富硒大豆及其蛋白中硒含量测定

测定方法：

分别称量0.5000g1#脱脂豆粉、2#脱脂豆粉、3#脱脂豆粉、4#脱脂豆粉、1#11s大豆球蛋白、2#11s大豆球蛋白、3#11s大豆球蛋白、4#11s大豆球蛋白、1#7s大豆球蛋白、2#7s大豆球蛋白、3#7s大豆球蛋白和4#7s大豆球蛋白于锥形瓶中，向各锥形瓶中分别加入10ml混合酸(v硝酸:v高氯酸＝9:1，硝酸浓度为65-68wt％，高氯酸浓度为70-72wt％)，冷消化12h后放置在电热板上，在180下℃加热消化，直至出现白烟，且消化液呈透明无色或微黄色，待消化液冷却后，加入4ml6mol/lhcl溶液，再加水定容至50ml，将所得的溶液取5ml移入试管中，加入2.5mll0wt％铁氰化钾(k3[fe(cn)6])溶液和5ml6mol/lhcl溶液，混合均匀，用原子荧光光谱仪仪器进行检测。

原子荧光光谱仪仪器参数及操作条件如下：原子化温度800℃，分析线196.0nm，灯电流8ma，流速为1.2l/min，光谱通带0.4nm，载气为高纯氮气。

测定结果：

测定结果如表1所示：

表1不同硒含量富硒大豆提取的11s和7s大豆球蛋白组分的硒含量(mg/kg)

从表1可以看出，对于不同硒含量的富硒大豆，与脱脂豆粉相比，提取出的11s和7s大豆球蛋白组分中硒含量均得到了有效提高。