一种苹果果肉原生质体的提取方法与流程

本发明属于原生质体技术领域，尤其涉及一种苹果果肉原生质体的提取方法。

背景技术：

植物细胞主要由细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核组成。原生质体由于去掉了细胞壁，细胞膜成为细胞活物质与外界环境的唯一屏障。原生质体可以用来观察各种细胞过程和活动，如在细胞壁的合成，细胞分裂，再生组织的分化，ca²⁺信号转导和调控，在不同种类植物中响应光、胁迫、激素等因素的离子通道的调控等研究领域有着重要的应用。cocking自1960年首次用酶法制备番茄根原生质体获得成功之后，植物原生质体的研究才逐渐变得活跃起来，原生质体已经成为细胞壁再生、细胞分裂、胚的生成、分化及植物病毒研究的有效工具，经过许多研究者的不断努力，已建立起了酶解分离出原生质体的基本程序。但几乎所有的研究都表明，由于植物本身存在差异性，不同的种类，甚至同种植物不同的供试组织，其原生质体分离所需的条件都存在着很大差异。

苹果作为世界上栽培面积最大的四大水果之一，也是我国重要的栽培树种。目前生产上的主要问题是是品质差，投入效益低，这些问题限制了苹果产业的进一步发展。由于苹果有性杂交育种周期长，遗传上高度杂合，难以筛选出集父母优良性状与一体的植株，因此采用生物技术方法充分利用资源优良性状是其遗传改良及种质创新的重要内容。而原生质体的提取是现代生物技术领域中重要的一部分。

目前关于苹果分离原生质体的来源主要是花药愈伤组织、胚珠愈伤组织、叶片和花粉等，至今尚未有以苹果果肉中原生质体的提取的报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种苹果果肉原生质体的提取方法，本发明方法可有效的保持原生质体的活性以及完整性，其苹果果肉原生质体的分离率可达15.63％。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种苹果果肉原生质体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、取苹果果肉薄片置于酶液中，得到混合物；

b、将步骤a中得到的混合物加入离心管中，在25-30℃黑暗环境中静置酶解，得到酶解初级产物；

c、将步骤b中得到的酶解产物过筛，过筛收集筛出物得到已酶解的苹果果肉汁，再加入甘露醇cpw溶液，经过离心、洗涤、沉淀得到苹果果肉原生质体。

本发明的有益效果是：本发明方法可有效的保持原生质体的活性以及完整性，其苹果果肉原生质体的分离率可达15.63％。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

作为本发明进一步优选方案，在步骤a中，所述酶液的配置方法：以甘露醇cpw溶液为溶剂，加入mes0.1％(w/v)，bsa0.1％(w/v)，pvp1％(w/v)，离析酶r-101％(w/v)混合均匀即可，其ph值控制在5.6，其中mes0.1％(w/v)表示100ml的酶液中含有0.1gmes，bsa0.1％(w/v)表示100ml的酶液中含有0.1gbsa，pvp1％(w/v)表示100ml的酶液中含有1gpvp，离析酶r-101％(w/v)表示100ml的酶液中含有1g离析酶r-10；

所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水为溶剂，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均匀即可。

作为本发明进一步优选方案，在步骤a中，所述苹果果肉厚度为0.2cm，其苹果果肉薄片的质量与酶液的体积比为1:3。

作为本发明进一步优选方案，在步骤b中，所述酶解时间控制在20-30min。

作为本发明进一步优选方案，在步骤c中，所述过筛目数为320目。

作为本发明进一步优选方案，在步骤c中，所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水为溶剂，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均匀即可，其中101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇表示每升甘露醇cpw溶液中分别含有101.0mgkno3，27.2mgkh2po4，246.0mgmgso4·7h2o，1480.0mgcacl2·2h2o，0.16ki，0.025cuso4·5h2o，0.7mol甘露醇。

作为本发明进一步优选方案，在步骤c中，所述甘露醇cpw溶液与已酶解苹果果肉混合时温度控制在20-25℃。

作为本发明所用到的材料其化学式与中文对比如下：

kno3(硝酸钾)；

kh2po4(磷酸二氢钾)；

mgso4·7h2o(七水硫酸镁)；

cacl2·2h2o(二水氯化钙)；

ki(碘化钾)；

cuso4·5h2o(五水硫酸铜)；

mes(2-(n-吗啡啉)乙磺酸：c6h13no4s)；

bsa(牛血清静蛋白)；

pvp(聚乙烯吡咯烷酮)；

离析酶r-10(酶的型号)。

附图说明

图1为本发明提取的苹果果肉原生质体电镜图；

图2为本发明提取的苹果果肉原生质体经fda染色的电镜图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

a、先用蒸馏水冲洗苹果数次，将其果皮下的果肉用手术刀切下0.5cm×0.5cm的小方块，再徒手将其切成1mm×1mm，厚度为0.2cm的薄片，将苹果果肉薄片置于酶液中，得到混合物；

b、将步骤a中得到的混合物加入离心管中，在25℃黑暗环境中静置酶解20min，中间每5min取出来，轻轻摇匀，得到酶解初级产物；

c、将步骤b中得到的酶解产物过筛，过筛收集筛出物得到已酶解的苹果果肉汁，再加入甘露醇cpw溶液，经过2000r/min离心、洗涤3次，弃除上清液，去除酶液沉淀得到苹果果肉原生质体。

原生质体的计数

轻轻摇匀沉淀的原生质体，用移液枪吸取20μl滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于显微镜下观察原生质体，并拍照，统计原生质体分离率(视野中的原生质体数/视野内的细胞数)，每次取10个视野，3次重复。果肉原生质体的分离率可达15.63％。

在步骤a中，所述酶液的配置方法：以甘露醇cpw溶液为溶剂，加入mes0.1％(w/v)，bsa0.1％(w/v)，pvp1％(w/v)，离析酶r-101％(w/v)混合均匀即可，其ph值控制在5.6；

所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水为溶剂，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均匀即可。

在步骤a中，其苹果果肉薄片的质量与酶液的体积比为1:3。

在步骤c中，所述过筛目数为300目。

在步骤c中，所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水为溶剂，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均匀即可。

在步骤c中，所述甘露醇cpw溶液与已酶解苹果果肉混合时温度控制在20℃。

实施例2

a、先用蒸馏水冲洗苹果数次，将其果皮下的果肉用手术刀切下0.5cm×0.5cm的小方块，再徒手将其切成1mm×1mm，厚度为0.2cm的薄片，将苹果果肉薄片置于酶液中，得到混合物；

b、将步骤a中得到的混合物加入离心管中，在28℃黑暗环境中静置酶解25min，中间每5min取出来，轻轻摇匀，得到酶解初级产物；

c、将步骤b中得到的酶解产物过筛，过筛收集筛出物得到已酶解的苹果果肉汁，再加入甘露醇cpw溶液，经过2000r/min离心、洗涤3次，弃除上清液，去除酶液沉淀得到苹果果肉原生质体。

原生质体的计数

轻轻摇匀沉淀的原生质体，用移液枪吸取20μl滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于显微镜下观察原生质体，并拍照，统计原生质体分离率(视野中的原生质体数/视野内的细胞数)，每次取10个视野，3次重复。果肉原生质体的分离率可达15.53％。

在步骤a中，所述酶液的配置方法：以甘露醇cpw溶液为溶剂，加入mes0.1％(w/v)，bsa0.1％(w/v)，pvp1％(w/v)，离析酶r-101％(w/v)混合均匀即可，其ph值控制在5.6；

所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水为溶剂，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均匀即可。

在步骤a中，其苹果果肉薄片的质量与酶液的体积比为1:3。

在步骤c中，所述过筛目数为320目。

在步骤c中，所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水为溶剂，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均匀即可。

在步骤c中，所述甘露醇cpw溶液与已酶解苹果果肉混合时温度控制在22℃。

实施例3

a、先用蒸馏水冲洗苹果数次，将其果皮下的果肉用手术刀切下0.5cm×0.5cm的小方块，再徒手将其切成1mm×1mm，厚度为0.2cm的薄片，将苹果果肉薄片置于酶液中，得到混合物；

b、将步骤a中得到的混合物加入离心管中，在30℃黑暗环境中静置酶解30min，中间每5min取出来，轻轻摇匀，得到酶解初级产物；

c、将步骤b中得到的酶解产物过筛，过筛收集筛出物得到已酶解的苹果果肉汁，再加入甘露醇cpw溶液，经过2000r/min离心、洗涤3次，弃除上清液，去除酶液沉淀得到苹果果肉原生质体。

原生质体的计数

轻轻摇匀沉淀的原生质体，用移液枪吸取20μl滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于显微镜下观察原生质体，并拍照，统计原生质体分离率(视野中的原生质体数/视野内的细胞数)，每次取10个视野，3次重复。果肉原生质体的分离率可达15.56％。

在步骤a中，所述酶液的配置方法：以甘露醇cpw溶液为溶剂，加入mes0.1％(w/v)，bsa0.1％(w/v)，pvp1％(w/v)，离析酶r-101％(w/v)混合均匀即可，其ph值控制在5.6；

所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水为溶剂，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均匀即可。

在步骤a中，其苹果果肉薄片的质量与酶液的体积比为1:3。

在步骤c中，所述过筛目数为350目。

在步骤c中，所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水为溶剂，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均匀即可。

在步骤c中，所述甘露醇cpw溶液与已酶解苹果果肉混合时温度控制在25℃。

附图1与附图2为本发明实施例2提取得到的苹果果肉原生质体，由附图1所示，苹果果肉脱去了全部的细胞壁，而呈现为球形状，其提取得到的苹果果肉原生质体保持了相对的完整性；附图2是将提取得到的原生质体经fda(荧光素二乙酸)染色，在荧光显微镜用蓝色光激发下(495nm)观察，其原生质体具有绿色荧光，说明获得的原生质体保持了活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。