本发明属于生物工程领域，特别是涉及一种高产曲酸米曲霉的选育方法。
背景技术：
曲酸是一种重要的有机酸，广泛应用于化妆品、食品加工、医药、农业等领域。特别是在食品加工领域，由于其安全无毒，作为理想的多酚氧化酶抑制剂，最具应用前景。微生物发酵是曲酸工业化生产的主要途径，由于曲酸是微生物代谢的次级产物，其合成过程较复杂，合成机制至今仍不清楚，因此，应用基因工程的方法提高曲酸产量仍有困难。目前，产曲酸菌株主要集中于米曲霉和黄曲霉，其中，黄曲霉为条件性致病菌。manabe等对149株米曲霉和46株黄曲霉进行研究时发现，黄曲霉全部产曲酸且有34株同时产黄曲霉毒素；而米曲霉只有105株产曲酸且全部不产黄曲霉毒素。为了提高曲酸产量，国内外学者进行了大量研究工作，主要包括菌株选育、发酵方法优化两方面。
多年来，通过运用多种不同的诱变方法进行曲酸生产菌株的选育，获得了一些曲酸高产菌株。诱变方法仍以传统的物理诱变和化学诱变居多，存在诱变方法随机、方向不易掌握、理想个体筛选困难等局限性。近年来出现了一些新的诱变手段，如钴、氮离子注入，离子注入技术是集化学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方法，可使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失，显著提高生物的变异率，获得损伤轻、突变率高、突变谱广、遗传稳定的诱变，但这类方法普遍设备昂贵，不易操作，从而使其应用受到了限制。也有文献（陈锡剑等）报道，常压室温等离子体（artp）生物诱变育种技术是一种新型的诱变手段，具有射流温度低、产生的等离子体均匀、与生物大分子和细胞作用明显等优点。
微波是指频率为300mhz-300ghz的电磁波，微波频率比一般的无线电波频率高，通常也称为“超高频电磁波”。微波作为一种电磁波也具有波粒二象性，微波的基本性质通常呈现为穿透、反射、吸收三个特性。微波辐射过程是高频电磁波穿透介质到达内部的微管束和腺胞系统的过程，分子原子核在外加电磁场的周期力作用下所呈现的许多共振现象都发生在微波范围，因而微波为探索物质的内部结构和基本特性提供了有效的研究手段。
技术实现要素：
本发明的目的在于：提供一种高产曲酸米曲霉的选育方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：以微波/紫外复合诱变选育，筛选出产曲酸水平高的菌种。
具体的技术路线是这样的：一种高产曲酸米曲霉的选育方法，涉及微波/紫外复合诱变，反复筛选，包括起始菌株的筛选、菌种诱变和种子培养。所述起始菌株的筛选是将曲霉菌种活化后，对得到的菌株进行筛选，选产酸最高菌株为诱变出发菌株；所述菌种诱变包括一次微波辐射和两次紫外线照射的复合诱变、高通量筛选、摇瓶复筛和传代验证；所述的种子培养是在种子罐中进行培养，培养条件是温度28℃、风量1.8m3/h、转速150rpm、罐压0.05mpa；
优选，微波频率为1500mhz至2450mhz，辐射时间为10-80s(秒)；
优选，紫外线为20w紫外灯20cm处照射2~6min；
进一步地，通过菌种传代实验，考察曲酸高产菌株的遗传稳定性，
结果显示，经6代传代验证，所选育的菌种产酸均在6.3~6.7％。
本发明工艺流程：
1、菌种筛选
经过复合诱变后，用96孔板平板高通量初筛，摇瓶验证复筛后，筛选出的高产菌株，接入斜面培养基培养，放入4℃保存。
2、种子的培养
种子罐中进行培养，培养条件:温度28℃、风量1.8m3/h、转速150rpm、罐压0.05mpa。
3、发酵罐中发酵培养
接入发酵罐中培养,发酵条件:温度30℃,转速200rpm,风量40m3/h,罐压0.05mpa。发酵过程中每隔4h取样进行检测，对发酵液中的残糖进行监控，生产发酵周期为60~70小时，产酸能力为63~67g/l。
配方：葡萄糖14-15%，酵母膏0.6-1%，磷酸二氢钾0.2-0.5%，硫酸镁0.06-0.1%，乙醇1-3%。
由于采用了上述方案，本发明的有益效果在于：采用微波/紫外复合诱变育种技术获得的优良菌种，产率高、转化率高、发酵周期短、发酵液颜色浅。通过复合诱变获高产曲酸米曲霉ck2147菌种、产酸能力为63-65g/l，发酵长期稳定，非常有利于最佳生产工艺的建立。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：微波/紫外诱变菌株摇瓶筛选试验
一、实验目的
微波/紫外诱变（微波1次，紫外2次）菌株通过高通量平板简单初筛后，需要对所得到的菌株进行定量筛选，通过摇瓶筛选，直观、定量的选出高产菌株。
二、实验材料
1.曲酸菌株
2.1％三氯化铁溶液：准确称取10g氯化铁，加入22.5ml浓盐酸，用蒸馏水定容到1000ml。
3.曲酸：标准品，纯度≥99.5%。
4.发酵培养基：葡萄糖14~15%、酵母膏0.6~1%、磷酸二氢钾0.2~0.5%、硫酸镁0.06~0.1%、乙醇1~3%。
三、实验操作步骤
1、将配制好的发酵培养基，分别装至500ml三角瓶中，装液量为60ml，在120℃下灭菌20min，冷却备用。
2、将微波/紫外诱变所得菌种分别接种至发酵培养基中，在28℃，180rm下培养120h时，对培养得到的发酵液进行分析检测。
3、曲酸线性回归方程确定：准确称取曲酸标准品0.1000g,溶于蒸馏水中，定容至100ml，用移液管准确吸取0ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml共6个标准样品母液，分别移入6个100ml容量瓶中，在分别加入显色剂2ml，再定容至100ml，其浓度分别为0mg/l，10mg/l，20mg/l，30mg/l，40mg/l，50mg/l，在波长为500nm下分别测定其吸光值，求得线性回归方程。
4、发酵液曲酸含量测定：取发酵液在3000rpm下离心10min,取发酵上清液，经过一定的稀释，备用。取稀释后发酵上清液2ml于100ml容量瓶中，加入2ml1%三氯化铁溶液，再定容至100ml。在波长500nm处测其吸光值，代入以上求得的线性方程即得曲酸含量。
四、结果
结果如表1所示，通过摇瓶筛选得出一株菌株m/uv-5比原始菌株产量提高5.1%。
实施例2：突变菌株传代稳定性试验
一、实验目的
将所得到的高产菌株进行传代稳定性试验，确定突变株是否具有好的遗传稳定性。
二、实验材料
5.曲酸突变菌株
6.1％三氯化铁溶液：准确称取10g氯化铁，加入22.5ml浓盐酸，用蒸馏水定容到1000ml。
7.曲酸：标准品，纯度≥99.5%。
8.斜面培养基：葡萄糖14~15%、酵母膏0.6~1%、磷酸二氢钾0.2~0.5%、硫酸镁0.06~0.1%。
9.发酵培养基：葡萄糖14~15%、酵母膏0.6~1%、磷酸二氢钾0.2~0.5%、硫酸镁0.06~0.1%、乙醇1~3%。
三、实验操作步骤
1、将配制好的斜面培养基，分装至试管中，120℃下灭菌15min，冷却后备用。
2、将冷却后的斜面在培养箱中28℃下进行空白培养24h。
3、将突变菌株接种与斜面上，进行传代培养，培养好的菌株置于4℃冰箱中保存，待用。
4、将培养好的斜面，用无菌水将洗脱，制成一定浓度的孢子悬浮液，按5%接种量接至三角瓶发酵培养基中，在28℃,180rpm培养120h时终止，对培养得到的发酵液进行分析检测。
5、曲酸线性回归方程确定：准确称取曲酸标准品0.1000g,溶于蒸馏水中，定容至100ml，用移液管准确吸取0ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml共6个标准样品母液，分别移入6个100ml容量瓶中，在分别加入显色剂2ml，再定容至100ml，其浓度分别为0mg/l，10mg/l，20mg/l，30mg/l，40mg/l，50mg/l，在波长为500nm下分别测定其吸光值，求得线性回归方程。
6、发酵液曲酸含量测定：取发酵液在3000rpm下离心10min,取发酵上清液，经过一定的稀释，备用。取稀释后发酵上清液2ml于100ml容量瓶中，加入2ml1%三氯化铁溶液，再定容至100ml。在波长500nm处测其吸光值，代入以上求得的线性方程即得曲酸含量。
四、结果
从表1可以看出，突变菌株能在6代内具有较好的遗传稳定性。
结论：
以米曲霉ck0113为出发菌株，采用新型的微波/紫外诱变手段进行诱变，得到一株曲酸产量为63~67g/l的高产菌株，产酸能力比出发菌株ck0113提高了6.1~6.5％且该菌株产酸性能稳定，说明微波/紫外诱变育种是有效可行的提高曲酸产量的一种育种手段。