一种与阿尔茨海默病相关的核酸及其应用的制作方法

本申请涉及基因领域，特别是涉及一种与阿尔茨海默病相关的核酸及应用。

背景技术：

阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease,缩写ad，俗称老年性痴呆)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床早期表现主要为患者记忆力的减退和生活自理能力的下降，最终导致发生进行性认知功能障碍和缺失、神经行为异常，出现精神状况及生活自理能力的完全丧失，病因未明。迄今为止，阿尔茨海默病基因研究发现β-淀粉样前体蛋白(缩写app)、早老素1和2(分别缩写为psen1、psen2)共3种致病基因；同时证实载脂蛋白e(缩写apoe)等位基因为其重要遗传因素。并且这些基因相关的阿尔茨海默病遗传模式均为常染色体显性遗传。虽然，目前在这些基因上已经发现了一些突变会导致阿尔茨海默病，但是仍然有许多患者病因未明。但是，在这些基因上或其它基因上，仍然存在很多未被发现或检测到的突变，这直接导致通过现有的检测方法不能准确地对疑似患病的患者是否患病进行准确判断，对于阿尔茨海默病的诊断、阻断疾病在家族中的遗传，以及靶点药物开发等都有很大影响。

技术实现要素：

本申请的目的是提供一种新的与阿尔茨海默病相关的核酸，以及该核酸的应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种与阿尔茨海默病相关的核酸，该核酸由野生型psen2基因的编码区发生c.505c>a突变而成。

具体的，本申请的核酸的序列为seqidno.1所示序列。

需要说明的是，本申请在大量的研究和实践过程中发现了一种新的与阿尔茨海默病相关的核酸，该核酸是野生型psen2基因的编码区发生c.505c>a突变而成，即野生型psen2基因的编码区序列中，第505为碱基由c突变为了a。该突变直接导致psen2基因编码的氨基酸序列，其第169为组氨酸(缩写his)突变为天冬酰胺(缩写asn)，改变了多肽的结构和功能，进而导致阿尔茨海默病发生。

本申请的另一面公开了一种与阿尔茨海默病相关的多肽，该多肽为野生型psen2的氨基酸序列发生p.his169asn突变而成。

具体的，本申请的多肽为seqidno.2所示序列。

需要说明的是，本申请的多肽，实际上就是本申请的核酸编码的多肽，因此，该多肽的出现或存在是直接与阿尔茨海默病相关的。

本申请的另一方面公开了本申请的核酸或本申请的多肽在制备阿尔茨海默病检测试剂、试剂盒或设备中的应用。

可以理解，本申请的核酸作为一个新发现的阿尔茨海默病相关的致病核酸，本领域技术人员可以按照现有的核酸检测方法和技术，针对本申请的核酸序列设计检测试剂，形成试剂盒或专用检测设备，例如针对本申请的核酸序列按照常规方法设计相应的检测引物、荧光探针、基因杂交探针、锁式探针等，对阿尔茨海默病进行检测。同样的，本申请的多肽也是一种全新的物质，该多肽的存在与阿尔茨海默病直接相关，因此，本领域技术人员可按照现有的蛋白质或多肽检测方法，针对本申请的多肽设计检测试剂，形成试剂盒或专用检测设备。

本申请的另一方面公开了一种含有本申请的核酸的重组载体。

本申请的另一方面公开了一种含有本申请的重组载体的重组细胞。

可以理解，为了研究方便，完全可以将本申请的核酸插入到载体中，制成重组载体，以方便后续的研究或检测。具体的载体类型，可以根据研究目的不同而选择，例如，作为阿尔茨海默病检测的阳性对照时，载体可以选择常规的pmd18-t或pmd19-t等；至于重组载体的制备方法可以参考现有技术。同样的，重组细胞也是为了方便后续的研究或检测，将插入有本申请的核酸的重组载体导入而成，具体宿主细胞类型可以根据研究目的不同而选择，此不做限定。

本申请的再一方面公开了一种检测阿尔茨海默病的试剂盒，该试剂盒中包括检测本申请的核酸的试剂，和/或检测本申请的多肽的试剂。

优选的，试剂盒中还包括本申请的重组载体。

优选的，试剂盒中还包括本申请的重组细胞。

优选的，本申请的试剂盒中，检测本申请的核酸的试剂包括一对扩增引物，该扩增引物的正向引物为seqidno.3所示序列，反向引物为seqidno.4所示序列，

seqidno.3：5’-taggagacacccagcattac-3’

seqidno.4：5’-aaatcaggaacgagacagaa-3’。

需要说明的是，seqidno.3所示序列和seqidno.4所示序列的引物，是针对野生型psen2基因的编码区发生c.505c>a突变，这个靶标位点设计的，即引物的扩增片段中包含c.505c>a突变；在本申请的一种实现方式中，采用seqidno.3所示序列和seqidno.4所示序列的引物对提取的dna进行扩增后，通过对扩增产物进行测序分析，确定是否存在c.505c>a，因此，可将seqidno.3所示序列和seqidno.4所示序列的引物单独作为检测阿尔茨海默病的试剂盒。

可以理解，检测本申请的核酸序列的试剂并不只限于seqidno.3所示序列和seqidno.4所示序列的引物，针对本申请的c.505c>a突变，还可以设计出更多的扩增引物，此处的扩增引物特指扩增片段包含c.505c>a突变的引物，通过这些扩增引物对dna进行扩增后，分析扩增片段中是否含有本申请的突变，由此确认是否存在本申请的核酸序列。此外，也可以根据c.505c>a突变设计特异性引物或特异性探针，特异性探针例如实时荧光探针、基因杂交探针、锁式探针等；而对于c.505c>a突变的确认方法也不仅限于测序，还可以通过特异性引物或特异性探针对c.505c>a突变进行确认；当然，测序是最直接、有效且准确的方法。

本申请的有益效果在于：

本申请的核酸是阿尔茨海默病的一种新的相关的致病核酸，该核酸或致病突变位点的发现，进一步拓展和完善了阿尔茨海默病的检测和研究，为该疾病的诊断或治疗提供了新的检测位点，以及新的检测方法和途径，也为靶点药物的开发提供了一个新的靶标位点。

附图说明

图1是本申请实施例中阿尔茨海默病患者测序结果中，位于c.505c>a突变位点附近的测序峰图。

具体实施方式

目前虽然已经有一些阿尔茨海默病的相关致病基因研究和报道，但是，其致病基因或者基因位点突变仍然存在相当一部分未知；因此，本申请在对阿尔茨海默病进行深入研究的基础上，发现了一种新的突变的基因，即野生型psen2基因的编码区发生c.505c>a突变产生的核酸，该基因突变目前暂无文献报道。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例一

本例选取一位阿尔茨海默病患者，对其血液样品进行外显子测序；外显子测序采用bgiexomev4kit59m全外显子捕获kit，结合bgiseq-500高通量测序平台获得变异数据。随后通过dbsnp数据库、千人基因组数据库、hapmap数据库等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异；同时结合阿尔茨海默病已知基因信息，去掉同义突变以及非编码区的变异，并利用sift软件进行snp功能预测，最终得到1个可能引起致病的基因突变。具体如下：

一、样品采集

抽取患者的外周血样品，提取全基因组dna，本例采用omegablooddnamidikit进行dna提取，具体步骤包括：

s11，取2ml外周血样本、150μlobprotease、2.1mlbufferbl和20μlrnasea加入ep管中，然后最大速度漩涡1分钟彻底混匀后；于65摄氏度水浴15～20分钟，并在水浴过程中漩涡5次；

s12，向ep管中加入2.2ml无水乙醇，最大速度漩涡30秒，彻底混匀，进行裂解，得裂解液；

s13，将3.5ml裂解液移入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；

将步骤s12剩余裂解液加入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

s14，加入3mlhbbuffer，洗涤过滤柱，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；

s15，加入3mldnawashbuffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；

s16，再次加入3mldnawashbuffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；4000转离心15分钟，甩干过滤柱；

s17，将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500μl70摄氏度的elutionbuffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有dna的过滤液；

s18，再次将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500μl70摄氏度的elutionbuffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有dna的过滤液；

利用分光光度计测量dna的浓度及纯度，所得的每个标本基因组dna的od260/od280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30μg。

二、外显子捕获和测序

采用bgiexomev4kit59m全外显子捕获kit进行外显子捕获，具体包括：

采用超声波高性能样品处理系统(covaris)对基因组dna样品进行随机打断，经过片段选择后得到150bp-250bp左右的片段。随后进行dna片段末端修复、3’端加“a”碱基、两端加上文库接头。接头连接后的文库进行线性扩增(lm-pcr)制备成杂交文库。其中，文库接头采用bgiseq-500高通量测序平台的测序接头，末端修复、加“a”和接头连接的具体反应体系和条件参考常规的文库构建，在此不做具体限定。

将制备的杂交文库与59mb外显子芯片bgiexomev4kit进行捕获富集，洗脱掉未富集的片段后进行扩增。扩增产物进行单链分离和环化处理，环化文库经过滚环复制(rollingcircleamplification，缩写rca)生成dna纳米球(dnananoball，缩写dnb)，质控合格后上机测序。其中，芯片捕获富集的具体方法参考试剂盒说明书。单链分离、环化、滚环扩增参考常规的dnb纳米球制备方法，在此不做具体限定。

三、外显子测序

本例采用bgiseq-500高通量测序平台对外显子捕获产物测序，具体包括：

bgiseq-500采用优化的联合探针锚定聚合技术(缩写cpas)和改进的dna纳米球(缩写dnb)核心测序技术。首先dna分子锚和荧光探针在纳米球上进行聚合，随后高分辨率成像系统对光信号进行采集，光信号经过数字化处理后即可获得待测序列。其中，dnb通过线性扩增增强信号，降低单拷贝的错误率。而且，dnb大小与芯片上活性位点的大小相匹配，每个位点结合一个dna纳米球，在保证测序精度的情况下提高了测序芯片的利用效率。采用先进的半导体精密加工工艺，在硅片表面形成结合位点阵列，实现dna纳米球的规则排列吸附。测序得到的原始图像数据，经碱基识别软件(basecalling)转化为原始序列数据(rawreads)，数据以fastq文件格式存储。

四、测序数据和分析

得到最终的测序结果之后，通过bgiseq-500高通量测序平台获得变异数据。随后通过dbsnp数据库、千人基因组数据库、hapmap数据库等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。同时结合阿茨海默病已知基因信息，去掉同义突变以及非编码区的变异，并利用sift软件进行snp功能预测，最终得到1个可能引起致病的基因突变。

dbsnp数据库的网址为：

http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenpath/hg19/database/snp132.txt.gz.

hapmap数据库网址为：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap

千人基因组数据库网址为：ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp

由此，得到患者在psen2基因编码区存在突变c.505c>a，为杂合子，初步判断患者psen2基因编码区上的c.505c>a突变是其阿尔茨海默病的致病位点。根据测序结果，该突变基因的核酸序列为seqidno.1所示序列，其第505位碱基由野生型的c碱基突变为a碱基，使得蛋白翻译发生错义突变，使多肽的第169位由野生型的组氨酸变为天冬酰胺；也就是说，错义突变得到的seqidno.1所示序列的基因翻译得到了一条新的氨基酸多肽，该多肽即seqidno.2所示序列。突变信息如表1所示。

seqidno.1：

5’-atgctcacattcatggcctctgacagcgaggaagaagtgtgtgatgagcggacgtccctaatgtcggctgagagccccacgccgcgctcctgccaggagggcaggcagggcccagaggatggagagaacactgcccagtggagaagccaggagaacgaggaggacggtgaggaggaccctgaccgctatgtctgtagtggggttcccgggcggccgccaggcctggaggaagagctgaccctcaaatacggagcgaagcacgtgatcatgctgtttgtgcctgtcactctgtgcatgatcgtggtggtagccaccatcaagtctgtgcgcttctacacagagaagaatggacagctcatctacacgccattcactgaggacacaccctcggtgggccagcgcctcctcaactccgtgctgaacaccctcatcatgatcagcgtcatcgtggttatgaccatcttcttggtggtgctctacaagtaccgctgctacaagttcatcaatggctggttgatcatgtcttcactgatgctgctgttcctcttcacctatatctaccttggggaagtgctcaagacctacaatgtggccatggactaccccaccctcttgctgactgtctggaacttcggggcagtgggcatggtgtgcatccactggaagggccctctggtgctgcagcaggcctacctcatcatgatcagtgcgctcatggccctagtgttcatcaagtacctcccagagtggtccgcgtgggtcatcctgggcgccatctctgtgtatgatctcgtggctgtgctgtgtcccaaagggcctctgagaatgctggtagaaactgcccaggagagaaatgagcccatattccctgccctgatatactcatctgccatggtgtggacggttggcatggcgaagctggacccctcctctcagggtgccctccagctcccctacgacccggagatggaagaagactcctatgacagttttggggagccttcataccccgaagtctttgagcctcccttgactggctacccaggggaggagctggaggaagaggaggaaaggggcgtgaagcttggcctcggggacttcatcttctacagtgtgctggtgggcaaggcggctgccacgggcagcggggactggaataccacgctggcctgcttcgtggccatcctcattggcttgtgtctgaccctcctgctgcttgctgtgttcaagaaggcgctgcccgccctccccatctccatcacgttcgggctcatcttttacttctccacggacaacctggtgcggccgttcatggacaccctggcctcccatcagctctacatctga-3’。

seqidno.1所示序列中，第505位碱基突变为了a，而野生型psen2基因的第505位碱基为c。

seqidno.2：

mltfmasdseeevcdertslmsaesptprscqegrqgpedgentaqwrsqeneedgeedpdryvcsgvpgrppgleeeltlkygakhvimlfvpvtlcmivvvatiksvrfytekngqliytpftedtpsvgqrllnsvlntlimisvivvmtiflvvlykyrcykfingwlimsslmllflftyiylgevlktynvamdyptllltvwnfgavgmvcihwkgplvlqqaylimisalmalvfikylpewsawvilgaisvydlvavlcpkgplrmlvetaqernepifpaliyssamvwtvgmakldpssqgalqlpydpemeedsydsfgepsypevfeppltgypgeeleeeeergvklglgdfifysvlvgkaaatgsgdwnttlacfvailiglcltllllavfkkalpalpisitfglifyfstdnlvrpfmdtlashqlyi

seqidno.2所示序列中，第169位碱基突变为了n，即天冬氨酰asn的简写；而野生型psen2多肽的第169位碱基为h，即组氨酸his的简写。

表1psen2突变基因

实施例二

本例根据实施例一测定的阿尔茨海默病致病基因psen2c.505c>a杂合突变，设计特异性引物，进行pcr扩增，并采用sanger测序确定该突变的真实性，具体如下：

本例设计的引物序列如下：

上游引物：

seqidno.3：5’-taggagacacccagcattac-3’

下游引物：

seqidno.4：5’-aaatcaggaacgagacagaa-3’。

采用设计的特异性引物，对提取的患者的全基因组dna进行pcr扩增，然后进行sanger测序验证。dna提取参考实施例一，利用分光光度计测量dna的浓度及纯度，所得的每个标本基因组dna的od260/od280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30μg。

pcr扩增反应体系为：10×extaqbuffer2.5μl、10mm的dntps2μl、5u/μl的extaq酶0.15μl、100ng/μl的primers1μl、dna模板1μl，补充ddh2o至25μl。

pcr反应条件为：95℃预变性5min；然后进行30个“变性、退火、延伸”循环：95℃30s、55℃30s、72℃30s；循环结束后72℃延伸7min，4℃待机。

pcr扩增产物进行测序前，先进行纯化处理，具体包括，配置消化液，分别取虾碱酶与外切酶1:1混合。pcr产物离心后，每个孔中加入1μl以上消化液到pcr反应液中；将上述产物上pcr仪进行程序反应：37℃60min，80℃15min，4℃保存。

sanger测序包括：

(1)配置seqmix体系：pcr产物模板1μl，bigdye4μl，3.2pmol/μl的引物1μl，去离子灭菌水4μl。

测序pcr循环条件：96℃1min，然后进入25个循环：96℃10s、50℃5s、60℃4min，循环结束后，4℃保存。

(2)测序产物纯化：测序反应板离心后，每个反应孔加入1μl125mmedta，1μl3mnaac溶液，无水乙醇25μl，充分震荡3min，室温放置15min；4300rpm离心30min，立即倒置384孔板离心，至300rpm停止，去除酒精；每反应孔加入35μl70％酒精，4300rpm4℃离心15min，立即倒置384孔板离心，至300rpm停止，去除酒精；重复70％酒精洗涤1次；让残余的酒精在室温挥发干，加入10μlhi-di甲酰胺，95℃变性4min，迅速4冰冷4min。

(3)上机测序：变性结束后，上测序仪abi3730进行测序。

pcr扩增产物的sanger测序，结果显示，与标准psen2基因序列相比，患者发生c.505c>a杂合突变，该突变是引起阿尔茨海默病的致病突变，c.505c>a突变位置部分测序峰图如图1所示。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

sequencelisting

<110>深圳华大基因研究院

<120>一种与阿尔茨海默病相关的核酸及其应用

<130>17i24789

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1347

<212>dna

<213>psen2突变致病基因

<400>1

atgctcacattcatggcctctgacagcgaggaagaagtgtgtgatgagcggacgtcccta60

atgtcggctgagagccccacgccgcgctcctgccaggagggcaggcagggcccagaggat120

ggagagaacactgcccagtggagaagccaggagaacgaggaggacggtgaggaggaccct180

gaccgctatgtctgtagtggggttcccgggcggccgccaggcctggaggaagagctgacc240

ctcaaatacggagcgaagcacgtgatcatgctgtttgtgcctgtcactctgtgcatgatc300

gtggtggtagccaccatcaagtctgtgcgcttctacacagagaagaatggacagctcatc360

tacacgccattcactgaggacacaccctcggtgggccagcgcctcctcaactccgtgctg420

aacaccctcatcatgatcagcgtcatcgtggttatgaccatcttcttggtggtgctctac480

aagtaccgctgctacaagttcatcaatggctggttgatcatgtcttcactgatgctgctg540

ttcctcttcacctatatctaccttggggaagtgctcaagacctacaatgtggccatggac600

taccccaccctcttgctgactgtctggaacttcggggcagtgggcatggtgtgcatccac660

tggaagggccctctggtgctgcagcaggcctacctcatcatgatcagtgcgctcatggcc720

ctagtgttcatcaagtacctcccagagtggtccgcgtgggtcatcctgggcgccatctct780

gtgtatgatctcgtggctgtgctgtgtcccaaagggcctctgagaatgctggtagaaact840

gcccaggagagaaatgagcccatattccctgccctgatatactcatctgccatggtgtgg900

acggttggcatggcgaagctggacccctcctctcagggtgccctccagctcccctacgac960

ccggagatggaagaagactcctatgacagttttggggagccttcataccccgaagtcttt1020

gagcctcccttgactggctacccaggggaggagctggaggaagaggaggaaaggggcgtg1080

aagcttggcctcggggacttcatcttctacagtgtgctggtgggcaaggcggctgccacg1140

ggcagcggggactggaataccacgctggcctgcttcgtggccatcctcattggcttgtgt1200

ctgaccctcctgctgcttgctgtgttcaagaaggcgctgcccgccctccccatctccatc1260

acgttcgggctcatcttttacttctccacggacaacctggtgcggccgttcatggacacc1320

ctggcctcccatcagctctacatctga1347

<210>2

<211>448

<212>prt

<213>psen2突变致病基因编码多肽

<400>2

metleuthrphemetalaseraspsergluglugluvalcysaspglu

151015

argthrserleumetseralagluserprothrproargsercysgln

202530

gluglyargglnglyprogluaspglygluasnthralaglntrparg

354045

serglngluasnglugluaspglyglugluaspproaspargtyrval

505560

cysserglyvalproglyargproproglyleugluglugluleuthr

65707580

leulystyrglyalalyshisvalilemetleuphevalprovalthr

859095

leucysmetilevalvalvalalathrilelysservalargphetyr

100105110

thrglulysasnglyglnleuiletyrthrprophethrgluaspthr

115120125

proservalglyglnargleuleuasnservalleuasnthrleuile

130135140

metileservalilevalvalmetthrilepheleuvalvalleutyr

145150155160

lystyrargcystyrlyspheileasnglytrpleuilemetserser

165170175

leumetleuleupheleuphethrtyriletyrleuglygluvalleu

180185190

lysthrtyrasnvalalametasptyrprothrleuleuleuthrval

195200205

trpasnpheglyalavalglymetvalcysilehistrplysglypro

210215220

leuvalleuglnglnalatyrleuilemetileseralaleumetala

225230235240

leuvalpheilelystyrleuproglutrpseralatrpvalileleu

245250255

glyalaileservaltyraspleuvalalavalleucysprolysgly

260265270

proleuargmetleuvalgluthralaglngluargasngluproile

275280285

pheproalaleuiletyrserseralametvaltrpthrvalglymet

290295300

alalysleuaspproserserglnglyalaleuglnleuprotyrasp

305310315320

proglumetglugluaspsertyraspserpheglygluprosertyr

325330335

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340345350

gluglugluglugluargglyvallysleuglyleuglyasppheile

355360365

phetyrservalleuvalglylysalaalaalathrglyserglyasp

370375380

trpasnthrthrleualacysphevalalaileleuileglyleucys

385390395400

leuthrleuleuleuleualavalphelyslysalaleuproalaleu

405410415

proileserilethrpheglyleuilephetyrpheserthraspasn

420425430

leuvalargprophemetaspthrleualaserhisglnleutyrile

435440445

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

taggagacacccagcattac20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

aaatcaggaacgagacagaa20