乳酸菌的筛选方法与流程

本发明涉及乳酸菌的筛选方法，特别是涉及用于探索抗菌物质的产生能力高的乳酸菌的筛选方法。

背景技术：

细菌素(bacteriocin)是乳酸菌等细菌类所产生的具有抗菌活性的肽或蛋白的总称(例如参照日本特开2011-41474号公报)。细菌素中，乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)的一部分菌株所产生的乳酸链球菌素(nisin)在世界约50个国家以上作为食品添加物被使用。

为了在工业上廉价地生产乳酸链球菌素，需要将培养液中的乳酸链球菌素浓度提高至极限，但当在产生乳酸链球菌素的乳酸乳球菌(l.lactis)中、培养液中的乳酸链球菌素浓度提高至一定值时，可见更多乳酸链球菌素的产生受到抑制的天花板现象，在乳酸链球菌素的高效率生产中成为问题。因此，期待获得通过暴露于高浓度乳酸链球菌素所导致的自然突变或uv照射等的突变处理，即便是在高浓度的乳酸链球菌素存在下也不会发生乳酸链球菌素的产生抑制的乳酸链球菌素产生株。

作为确认l.lactis的乳酸链球菌素产生量的方法，已知微生物学的定量法(通过对乳酸链球菌素敏感性菌的抑菌环的大小进行评价)或液相色谱质量分析法(lc/ms法)，其中分析操作简单的微生物学定量法在基础研究领域中被广泛采用。但是，微生物学的定量法是对培养液中的乳酸链球菌素量进行定量的方法，为了评价菌株水平的乳酸链球菌素产生能力，需要对各个菌株制备培养液，包括之后的定量分析，因此需要大量的劳动力和时间。

因此，作为一齐评价菌株水平的乳酸链球菌素产生能力的方法，考虑了将乳酸链球菌素敏感性菌和乳酸链球菌素产生菌进行倾注平板培养的方法(琼脂培养基倾注平板法)、或者利用在敏感性菌倾注平板培养基上表面涂抹乳酸链球菌素产生菌的方法(琼脂培养基表面涂抹法)形成集落，利用在集落周边出现的抑菌环的大小对乳酸链球菌素产生能力进行评价的方法。

但是，在使用了琼脂培养基的培养中，存在由于乳酸菌自身所产生的乳酸的浓度增加而受到增殖阻碍，集落的生长停止、无法进行具有妥当性的评价的问题。

技术实现要素：

因此，本发明的目的在于提供能够精度良好地评价乳酸菌产生的抗菌物质的产生能力、能够探索抗菌物质的产生能力高的乳酸菌的筛选方法。

本发明的乳酸菌的筛选方法的特征在于，在倾注平板培养有乳酸菌和对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基上层叠添加有对乳酸进行中和的中和剂的中和剂添加琼脂培养基，在此状态下进行培养，根据在倾注平板琼脂培养基中出现的集落周边所形成的抑菌环大小选择乳酸菌。

或者，还可以按顺序层叠添加了对乳酸进行中和的中和剂的第1中和剂添加琼脂培养基、倾注平板培养有乳酸菌和对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基、和添加有对乳酸进行中和的中和剂的第2中和剂添加琼脂培养基，在此状态下进行培养，根据在倾注平板琼脂培养基中出现的集落周边所形成的抑菌环大小选择乳酸菌。

或者，还可以在倾注平板培养有对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基上涂抹乳酸菌的培养液，在涂抹该培养液之后的倾注平板琼脂培养基上隔着膜过滤器层叠添加了对乳酸进行中和的中和剂的中和剂添加琼脂培养基，在此状态下进行培养，根据在倾注平板琼脂培养基中出现的集落周边所形成的抑菌环大小选择乳酸菌。

根据本发明，可以提供能够精度良好地评价乳酸菌产生抗菌物质的产生能力、能够探索抗菌物质的产生能力高的乳酸菌的筛选方法。

附图说明

图1为表示第1实施方式的乳酸菌的筛选方法的概略截面图。

图2为表示第2实施方式的乳酸菌的筛选方法的概略截面图。

图3为表示第3实施方式的乳酸菌的筛选方法的概略截面图。

具体实施方式

本发明的乳酸菌的筛选方法使用摄取了对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的琼脂培养基，利用倾注平板培养法或平板涂抹培养法对含有从多个菌株或同一菌株分裂、增殖的菌的乳酸菌的培养液进行培养，根据在出现的集落周围所形成的抑菌环大小，对特定抗菌物质的产生能力高的乳酸菌进行选择。但是，当乳酸菌产生的乳酸的浓度上升、培养基的ph降低时，则会阻碍乳酸菌的集落的生长、无法正确地评价特定抗菌物质的产生能力。另外，为了防止ph降低，还已知在琼脂培养基中作为中和剂添加碳酸钙的方法，但由于碳酸钙是不溶性的、琼脂培养基发生白浊，因而无法观察到抑菌环。因此，本发明中，通过将倾注平板培养有乳酸菌的琼脂培养基或涂抹有乳酸菌的琼脂培养基与添加有对乳酸进行中和的中和剂的琼脂培养基层叠，在此状态下对乳酸菌进行培养，利用中和剂对伴随乳酸菌增殖所产生的乳酸进行中和，抑制因ph降低所导致的增殖阻碍。之后，通过将层叠的、含有中和剂的琼脂培养基除去，从而兼顾了ph的维持和抑菌环的观察。

作为本发明的实施方式，根据乳酸菌的培养方法及添加有中和剂的琼脂培养基的层叠方法的不同，可以示例出以下的第1～第3实施方式。

(第1实施方式)

图1为表示第1实施方式的乳酸菌的筛选方法的概略截面图。

本实施方式中，如图1所示，在容器1内使倾注平板培养有乳酸菌和对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基2固化之后，层叠添加有中和剂的中和剂添加琼脂培养基3并使其固化，在此状态下进行规定时间的培养。当伴随着乳酸菌的增殖、倾注平板琼脂培养基2的乳酸浓度升高时，由于倾注平板琼脂培养基2与中和剂添加琼脂培养基3的乳酸浓度的差异，乳酸向中和剂添加琼脂培养基3移动，从而被中和剂中和。由此，保持了与中和剂添加琼脂培养基3的乳酸浓度差，其结果，倾注平板琼脂培养基2的乳酸浓度的上升得到抑制，因而抑制了因ph降低所导致的乳酸菌的增殖阻碍。

(第2实施方式)

图2是表示第2实施方式的乳酸菌的筛选方法的概略截面图。

本实施方式中，如图2所示，在容器1内使添加有中和剂的中和剂添加琼脂培养基4固化之后，使倾注平板培养有乳酸菌和对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基2固化，在此基础上进一步使添加有中和剂的中和剂添加琼脂培养基4固化，在此状态下进行规定时间的培养。即，本实施方式中，以2层中和剂添加琼脂培养基3及4夹持倾注平板琼脂培养基2的状态进行培养。在本实施方式的筛选方法中，当伴随着乳酸菌的增殖、倾注平板琼脂培养基2的乳酸浓度升高时，倾注平板琼脂培养基2内的乳酸也向中和剂添加琼脂培养基3及4移动，从而被中和剂中和。其结果，由于倾注平板琼脂培养基2的乳酸浓度的上升得到抑制，因而抑制了因ph降低所导致的乳酸菌的增殖阻碍。

本实施方式的筛选方法中，由于倾注平板琼脂培养基2被2层的中和剂添加琼脂培养基3及4夹持，因而与第1实施方式相比，乳酸的中和迅速地进行，可以更有效地抑制乳酸浓度(ph降低)。

(第3实施方式)

图3为表示第3实施方式的乳酸菌的筛选方法的概略截面图。

本实施方式中，如图3所示，在容器1内将倾注平板培养有对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基2固化之后，使用细菌涂布棒等将乳酸菌的培养液涂抹在已经固化的倾注平板琼脂培养基2的表面上。利用膜过滤器5将涂抹有乳酸菌培养液的倾注平板琼脂培养基2表面覆盖之后，将添加有中和剂的中和剂添加琼脂培养基3层叠并使其固化，在此状态下进行规定时间的培养。本实施方式的筛选方法中，当伴随着乳酸菌的增殖、倾注平板琼脂培养基2的乳酸浓度升高时，倾注平板琼脂培养基2内的乳酸通过膜过滤器5也向中和剂添加琼脂培养基3移动，从而被中和剂中和。其结果，由于倾注平板琼脂培养基2的乳酸浓度的上升得到抑制，因而抑制了因ph降低所导致的乳酸菌的增殖阻碍。

第1及第2实施方式中，由于在经加热的琼脂培养基上接种乳酸菌，因而有乳酸菌受到热的影响的可能性，但如本实施方式那样，在倾注平板琼脂培养基2上涂抹乳酸菌的方法中，并无乳酸菌受到热的影响的顾虑。另外，如本实施方式那样，当在倾注平板琼脂培养基2上涂抹乳酸菌时，由于培养基上形成集落，因此具有易于观察到所形成的集落的优点。

上述第1～第3实施方式中均优选在培养结束后，在将倾注平板琼脂培养基2上的中和剂添加琼脂培养基3除去后进行观察。中和剂是水不溶性的物质时，由于中和剂添加琼脂培养基3变浑浊，因而通过将其除去，抑菌环的观察变得容易。倾注平板琼脂培养基2中，在没有产生对敏感性菌具有抗菌作用的物质的乳酸菌的集落的部分由于敏感性菌的增殖而发生白浊，产生特定抗菌物质的乳酸菌的集落周围的部分由于敏感性菌无法增殖而不会发生白浊，形成抑菌环。基于该抑菌环的大小，对特定的抗菌物质产生能力高的乳酸菌的集落进行选择。

不对所产生的乳酸进行中和时，当乳酸浓度达到一定以上时，由于ph降低所导致的增殖阻碍，乳酸菌集落的生长停止，抑菌环只能增大至一定大小。因此，不对乳酸进行中和时，无法准确地评价乳酸菌所具有的抗菌物质的产生能力。另外，使用琼脂培养基时，与使用液体培养基时相比，不易添加中和剂。

与其相对，本实施方式中通过在倾注平板琼脂培养基2上层叠中和剂添加琼脂培养基3的简单方法，可以对所产生的乳酸进行中和，因此能够在没有因ph降低所导致的增殖阻碍的状态下对乳酸菌进行培养。其结果，在集落周围形成的抑菌环的大小能够反映乳酸菌本来所具有的抗菌物质的产生能力，从而能够准确地对抗菌物质的生产能力高的乳酸菌进行选择。

上述第1～第3实施方式中，筛选对象的抗菌物质典型地为乳酸菌细菌素，只要是乳酸菌产生的即可，并无特别限定。另外，敏感性菌只要是对筛选对象的抗菌物质具有敏感性即可。作为例子，当筛选具有乳酸链球菌素的产生能力的乳酸菌时，作为敏感性菌可以使用乳酸链球菌素敏感性的保加利亚乳杆菌或滕黄微球菌(micrococcusluteus)。另外，当筛选具有乳酸菌素(gassericin)产生能力的乳酸菌时，作为敏感性菌可以使用乳酸菌素敏感性的保加利亚乳杆菌；当筛选具有乳链球菌素3147(lacticin3147)的产生能力的乳酸菌时，作为敏感性菌可以使用乳链球菌素3147敏感性的酪链球菌(乳酸乳球菌乳脂亚种，lactococcuslactissubsp.cremoris)。

另外，上述第1～第3实施方式中，倾注平板琼脂培养基2的琼脂浓度优选为0.5～2.0％，为了进行层叠时在琼脂发生固化之前、在下层上均匀地扩展，更优选为0.7％～1.0％。另一方面，中和剂添加琼脂培养基3的琼脂浓度优选为1.0～2.5％、更优选为1.5～2.0％、进一步优选为2.0％。中和剂添加琼脂培养基3的琼脂浓度不足1.5％时，固化后的中和剂添加琼脂培养基3的硬度不足，难以在观察集落及抑菌环之前除去中和剂添加琼脂培养基3。另外，当中和剂添加琼脂培养基3的琼脂浓度超过2.5％时，由于乳酸自倾注平板琼脂培养基2的移动速度降低，因而不优选。

另外，上述第1～第3实施方式中，在倾注平板琼脂培养基2上层叠中和剂添加琼脂培养基3时的培养基的温度优选为45～55℃、更优选为50℃。层叠时的中和剂添加琼脂培养基3的温度低于45℃时，由于接近于琼脂的凝固点，因而难以在下层上以均一的厚度进行层叠。另一方面，层叠时的中和剂添加琼脂培养基3的温度超过55℃时，不仅指示菌或受试菌死亡，而且之前固化的倾注平板琼脂培养基2的一部分溶解、与中和剂添加琼脂培养基3融合，从而难以在观察集落及抑菌环之前除去中和剂添加琼脂培养基3。

添加于中和剂添加琼脂培养基3及4的中和剂只要能够将乳酸中和即可，优选为2价以上的金属的碳酸盐且在水中的溶解度为碳酸盐时低、而乳酸盐时高，例如可以优选使用碳酸钙。氢氧化钠等水溶性的中和剂会迅速地扩散到倾注平板琼脂培养基2中、提高倾注平板琼脂培养基2的ph，从而对指示菌和受试菌的生长造成影响，而碳酸钙由于不溶于培养基(水)，因此不会移动至倾注平板琼脂培养基2。因而，作为中和剂使用碳酸钙时，不必担心中和剂会对乳酸菌及敏感性菌造成影响。

其中，上述第1实施方式中是在倾注平板琼脂培养基2上层叠中和剂添加琼脂培养基3，但与其相反，也可在中和剂添加琼脂培养基3上层叠倾注平板琼脂培养基2。

实施例

(实施例1)

为了提高乳酸链球菌素的生产率，首先需要提高乳酸菌自身对所生产的乳酸链球菌素的耐性。因此，将l.lactisme-550株涂布在含有8mg/ml乳酸链球菌素制剂的mrs琼脂培养基上，获得通过自然突变而生长的菌株。进而，获得在含有12mg/ml乳酸链球菌素制剂的mrs琼脂培养基中生长的菌株。接着，按照生存率达到1.0％前后的方式对该耐性株照射紫外线，获得突变株。将该突变株倾注平板培养至接种有2.5％的用mrs培养基进行了前培养的乳酸链球菌素敏感性菌保加利亚乳杆菌(德氏乳杆菌保加利亚亚种，lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)jcm1002^t的mrs琼脂培养基(琼脂浓度为2.0％)15ml，注入到φ90mm×20mm的灭菌皿中使其固化。接着，在经固化的mrs琼脂培养基上层叠加热至50℃、含0.4g碳酸钙的mrs琼脂培养基(琼脂浓度为2.0％)10ml，在30℃下培养24小时。培养后，将含碳酸钙的上层的培养基除去，求出从形成于下层的抑菌环中随机选择的20个抑菌环的平均直径及标准偏差。实施例1中，抑菌环为9.28±1.35mm(平均值±标准偏差)、相对标准偏差为0.15。

(比较例1)

代替含0.4g碳酸钙的mrs琼脂培养基(琼脂浓度为2.0％)，层叠不含碳酸钙的mrs琼脂培养基(琼脂浓度为2.0％)10ml。培养后，求出从形成于培养基上的抑菌环中随机选择的10个抑菌环的平均直径及标准偏差。比较例1中，抑菌环为6.71±1.40mm(平均值±标准偏差)、相对标准偏差为0.21。

(比较例2)

对于不层叠含0.4g碳酸钙的mrs琼脂培养基(琼脂浓度为2.0％)的情况而言，利用与实施例1同样的方法实施培养。培养后，求出从形成于培养基上的抑菌环中随机选择的20个抑菌环的平均直径及标准偏差。比较例1中，抑菌环为5.39±1.72mm(平均值±标准偏差)、相对标准偏差为0.32。

由实施例1和比较例1的结果可知，通过对添加了作为中和剂的碳酸钙的琼脂培养基进行层叠，抑菌环增大。这里，抑菌环的大小表示乳酸链球菌素的产生浓度。另外，由比较例1与比较例2的比较可知，仅层叠mrs琼脂培养基时，由于阻断了空气中的氧的效果，抑菌环多少有些增大，但并没有层叠含碳酸钙的mrs琼脂培养基时那样的效果。实施例1中，利用碳酸钙对乳酸菌所产生的乳酸进行中和，在没有因ph降低所导致的增殖阻碍的状态下乳酸菌生长，因而可知乳酸链球菌素的产生量增加。

另外，实施例1中，与比较例2相比，抑菌环的相对标准偏差减小、不均减少。这说明，以抑菌环的大小为指标的乳酸链球菌素高生产株的筛选精度提高。

由上可知，根据本发明，由于乳酸菌所带来的抗菌物质的产生能力精度良好地反映为抑菌环的大小，因此基于具有妥当性的评价，可以筛选出抗菌物质的产生能力高的乳酸菌。

本发明可用作用于探索抗菌物质产生能力高的乳酸菌的筛选方法，可应用于利用了乳酸菌的抗菌物质的工业生产。

以上，详细地说明了本发明，但所述说明在所有方面都不过是本发明的示例，并非是为了限定其范围。其当然可以在不脱离本发明范围的情况下进行各种改良或变形。