一种可拮抗hnRNPU蛋白RNA结合活性的多肽HIP‑20及其应用的制作方法

本发明涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种可拮抗hnrnpu蛋白rna结合活性的多肽及其应用。

背景技术：

众所周知，肿瘤是世界范围内的医学难题，给人类健康带来极大的危害。常规的肿瘤治疗药物往往组织特异性差，在杀伤肿瘤的同时对正常组织带来损伤，造成很大的副作用，给肿瘤患者带来极大的痛苦。因此，特异性高、疗效显著的肿瘤靶向性多肽药物的研发引起了人们的极大兴趣。

肿瘤靶向多肽是指能够靶向肿瘤发生、发展相关的特定分子的一类活性多肽,是目前认为最理想的肿瘤靶向性治疗手段。相对于传统化疗药物，肿瘤靶向性多肽具有以下优势：1.良好的组织穿透性，极易进入肿瘤细胞发挥杀伤作用；2.生物活性高，特异性强，免疫原性低和毒性反应相对较弱；3.血浆清除速度快，在体内不易产生蓄积；4.与其他药物的相互作用较少，与体内靶标的亲和性较高；5.易于化学合成。因此，近年来许多学者努力寻找靶向肿瘤特异性分子的短肽，以达到靶向肿瘤的目的。

核不均一核糖核蛋白(hnrnps)是一组rna结合蛋白，参与肿瘤发生、病毒感染、细胞凋亡等多种病理生理过程。其中，hnrnpu是分子量最大的磷酸化蛋白质，在基因的转录、定位和表达特别是性染色体的表观失活过程中发挥重要作用。hnrnpu多以dna/rna蛋白复合物形式参与细胞功能调节，且其支架结合区能够增强转录因子的功能，调控基因的转录。越来越多的研究证实：hnrnpu蛋白在多种肿瘤中高表达，并通过与体内非编码rna的结合参与肝癌、肺癌的侵袭转移。尽管已经有许多新型抗肿瘤多肽的报道，其中部分已进入临床试验，但是，针对hnrnpu蛋白的抗肿瘤多肽尚无报道。

因此，需要构建一种既能靶向肿瘤细胞，又能高效入胞的新型多肽。

技术实现要素：

为解决以上问题，发明人深入研究了hnrnpu蛋白的作用机制，发现hnrnpu通过其rgg结构域与长链非编码rna(loc101927219)相互结合从而促进下游癌基因或者阻遏抑癌基因的转录。阻断hnrnpu蛋白rgg结构域与lncrna之间的相互作用，能有效阻遏肿瘤进展。

基于该研究，本发明提供了一种可拮抗hnrnpu蛋白rna结合活性的多肽，其氨基酸序列如seqidno:1所示。实验证明，该多肽可竞争性拮抗促癌基因hnrnpu与lncrna的结合，并在细胞水平表现出明显的肿瘤抑制作用。

本发明还提供了上述可拮抗hnrnpu蛋白rna结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤多肽，其包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如seqidno:1所示。

优选地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如seqidno:2所示。

优选地，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的n端。

本发明还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的优点在于，本发明的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接hnrnpu的rna结合活性肽段后，在细胞水平可观察到明显的肿瘤抑制效应。本发明的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

附图说明

图1为对照肽和hip-20处理hela细胞和sh-sy5y细胞48小时后的荧光显微镜照片；

图2为用不同浓度的hip-20或对照肽处理细胞mtt比色统计图；

图3为20μmol/l的hip-20或对照肽处理细胞不同时间的mtt比色统计图；

图4为软琼脂集落形成实验照片；

图5为根据图4计算的细胞克隆数的统计图；

图6为transwell细胞侵袭实验照片；

图7为根据图6计算的肿瘤细胞的迁移数目的统计图；

图8为肿瘤细胞的血管形成活性抑制实验照片；

图9为肿瘤细胞的相对血管形成活性统计图；

图10为peptidepulldown实验照片；

图11为rna免疫共沉淀实验(rip)照片。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.抗肿瘤多肽的合成

通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽，其包括一个肿瘤细胞杀伤结构域和一个穿膜结构域，其中肿瘤细胞杀伤结构域序列如seqidno:1所示，穿膜结构域序列如seqidno:2所示，连接于肿瘤细胞杀伤结构域的n端，所得到的序列为：氨基酸序列为ygrkkrrqrrr-nmrggnfrggapgnrggynk(seqidno:3)，命名为hip-20。为了研究方便，我们在抗肿瘤多肽的c端连接异硫氰酸荧光素标记fitc。

合成从c端到n端进行，步骤如下：

a.称取n当量树脂放入反应器，加入dcm(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽掉dcm，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的diea(二异丙基乙胺)、适量的dmf(二甲基甲酰胺)、dcm(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，氮气鼓泡反应60分钟。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用dmf、meoh洗净；

b.往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量)，2n当量hbtu(1-羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐)及diea、氮气鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测；

c.依步骤b的方式依次加入序列中不同的氨基酸并进行各种修饰；

d.将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10ml/克的比例)的切割液(组成是95％tfa、2％乙二硫醇、2％三异丙基硅烷、1％水)，震荡，滤掉树脂；

得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物；

多肽纯化：反相hplc法纯化粗品，多肽通过疏水作用连接到柱填料上，渐次降低离子强度进行洗脱。采用紫外分光光度法测定多肽紫外吸收来定量。

2.hip-20的穿膜与细胞定位检测

分别采用人神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y和人宫颈癌细胞系hela进行实验。取对数生长期的细胞，种植在24孔板内的盖玻片上，每孔约8000-10000个细胞。以10％胎牛血清、高糖dmem培养基培养，并加入20μmol/l的多肽，维持48小时。弃去上清，加入4％多聚甲醛300μl/孔，室温固定细胞20分钟，弃去多聚甲醛，1×pbs清洗两次，每次5分钟。加入dapi溶液300μl/孔，室温染细胞核5分钟，1×pbs充分洗涤5次，每次5分钟。然后以胞膜染料2μmol/l浓度200μl/孔，室温染细胞膜5-10分钟，染膜过程中保持震荡，随后1×pbs充分洗涤5次，每次5分钟。纯甘油封片，将盖玻片固定于载玻片上。采用激光共聚焦显微镜检测带有荧光基团的多肽在细胞内的定位，拍照并保存。

结果如图1所示，该多肽在加入细胞培养体系48小时之后，能有效进入肿瘤细胞，并显示极强的胞核定位。而对照肽仅能部分进入细胞浆，极少量分布在细胞核。可见该多肽能够有效进入肿瘤细胞并定位于胞核内。

3.mtt比色法分析检测hip-20对肿瘤细胞生长的抑制作用

分别使用人神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y进行mtt细胞活力比色实验。在96孔细胞培养板中，每孔种植5000个细胞，每个样品设定8个复孔。12小时后，加入hip-20及对照肽。首先给予0.05、0.5、5、50μmol/l多肽检测ic50。其次根据ic50对应药物浓度，根据ic50给予多肽及其对照多肽浓度分别为5、10、20、40μmol/l；最后给予20μmol/l特定浓度多肽及对照肽作用时间分别为为12、24、48、72小时。

到达标定时间后，弃去上清，用1×pbs清洗样品孔3次，每次5分钟。再向样品孔中加入100μl二甲基亚砜(dmso)溶液。将培养板静置于37℃，10分钟。取出后轻轻混匀孔内样品。用酶标仪检测570nm吸光度。收集数据，计算并统计。

结果如图2和3所示，与对照多肽相比，hip-20多肽处理的肿瘤细胞的活力显著降低，且该作用呈时间和剂量依赖性，说明该新型多肽可有效降低肿瘤细胞的细胞活力；其效果在20μmol/l浓度48小时时较为明显。而对照肽并不表现出明显的抑制生长效应。

4.软琼脂集落形成实验检测hip-20对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用

取对数生长期的sh-sy5y和hela细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数。六孔板每孔细胞数控制在1000个。用蒸馏水分别制备出1.2％和0.7％两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。将多肽按照20μmol/l浓度加入培养基中，再按1:1比例使1.2％的琼脂糖和2×1640培养基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取3ml混合液注入六孔板，冷却凝固，可作底层琼脂置co2温箱中备用。按1:1比例让0.7％的琼脂糖和2×dmem培养基在无菌试管中相混以后制备2ml上层胶，再向管中加入0.2ml的细胞悬液，充分混匀，注入底层平皿中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃、5％co2温箱中培养21-28天，待其形成细胞集落。向培养完成的六孔板中加入0.5％mtt溶液，4℃染色2-3小时，取出观察照相。计数细胞集落形成数目。

结果如图4和5所示，与对照组多肽相比，浓度20μmol/l的hip-20多肽处理的肿瘤细胞的克隆集落形成显著降低，说明该新型多肽可有效抑制肿瘤细胞的增殖能力。

5.transwell实验检测hip-20对肿瘤细胞迁移活性的影响

在24孔培养板中放置corning公司transwell小室(货号：3422)，向底层加入含15％胎牛血清的完全培养基。并向培养基中加入20μmol/l浓度的对照肽和hip-20。用无血清培养基制备单细胞悬液，计数后，以200μl无血清培养基中8000-20000个细胞的浓度向transwell上室中加入200μl细胞悬液。并向上室内加入与下室相同浓度的多肽。5％co2、37℃培养24小时。取出小室放入4％多聚甲醛中固定20分钟，再放入0.5％结晶紫染色液中，室温染色2小时。用棉签轻轻去除上室中未穿过多孔膜的细胞，在倒置显微镜下对多孔膜进行照相计数。

结果如图6和7所示，与对照组多肽相比，hip-20处理的肿瘤细胞的迁移数目明显降低，说明该新型多肽可有效抑制肿瘤细胞的迁移能力。

6.hip-20对肿瘤细胞血管生成活性的抑制的检测

肿瘤细胞血管生成活性，可以通过检测sh-sy5y和hela细胞在细胞外基质胶中的生长及血管形成状态来进行检测；具体实施方式如下，sh-sy5y和hela细胞以70-80％密度铺板于12孔板，每孔加入1ml培养基，再加入20μmol/l浓度的多肽和对照肽；在37℃、5％co2环境培养48小时，收集培养孔内的上清液，标记好冻存在-80℃备用；从-20℃取出基质胶，在冰水浴中复温至融解状态。取48孔细胞培养板，每孔加入100μl基质胶至孔底，水平放置于37℃培养箱30分钟，待基质胶凝固；制备huvec单细胞悬液，计数后，向48孔板每孔加入8000-10000个细胞，再加入收集的对照多肽和hip-20处理组sh-sy5y和hela细胞培养上清100μl；在37℃、5％co2环境培养6-8小时，在倒置显微镜下动态实时观察huvec小管形成状态，适时拍照。

结果如图8和9所示，与对照肽相比，浓度20μmol/l的多肽能显著抑制肿瘤细胞血管生成。

7.hip-20抑制肿瘤的作用机制

采用rnapull-down和rip检测来探讨hip-20抑制肿瘤的作用机制。

采用hela检测多肽对lncrna与hnrnpu蛋白相互作用的抑制效应。向10cm培养皿中培养的细胞加入不同浓度的多肽(0、5、10、20μmol/l)，同时另设20μmol/l对照多肽组，处理48小时；0.25％胰蛋白酶消化，收集细胞，1×pbs洗涤，去除上清；用ripa裂解液1ml充分裂解细胞团块，将裂解液分为两等份，取50μl作为input组冻存于-80℃，余下450μl作为rip组，加入30μl预混匀磁珠和1μglncrna探针，另一组加入hnrnpu蛋白抗体以及琼脂糖珠，置于4℃冰箱以10rpm旋转混匀过夜；取出过夜混匀的试管，3000rpm离心1分钟，弃上清，加入1ml1×pbs重悬珠子，3000rpm离心1分钟，小心吸去上清，反复4-5次，将未结合珠子的部分清洗弃去。最后一次洗涤后，小心去除上清，加入40μlpbs重悬珠子；加入10μl5×sdspageloadingbuffer，混匀后95℃水浴10分钟，解离珠子上的蛋白和rna；将洗脱的核酸成分用特异性引物进行pcr扩增。

制备12％sds-page胶，电泳后按照分子量切取hnrnpu蛋白(120kda)的条带，转膜封闭，相应抗体孵育后曝光。根据条带的明暗判读不同浓度的多肽对lncrna与hnrnpu蛋白相互作用的抑制效果。制备1.5％琼脂糖凝胶，去同等体积的pcr产物进行电泳鉴定，根据电泳条带亮度进行半定量比较。

结果如图10和11所示，采用westernblot检测，input组显示每组蛋白上样量相等，rnapull-down组显示随着hop-20浓度的提高，以lncrna探针结合的hnrnpu蛋白逐渐减少，说明hip-20多肽能抑制lncrna与hnrnpu蛋白的相互结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120>一种可拮抗hnrnpu蛋白rna结合活性的多肽hip-20及其应用

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

asnmetargglyglyasnpheargglyglyalaproglyasnarggly

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glytyrasnlys

20

<210>2

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