与结直肠癌相关的分子标记物、抑制剂、试剂盒和药剂的制作方法

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，具体涉及与结直肠癌相关的分子标记物、抑制剂、试剂盒和药剂。

背景技术：

结直肠癌(colorectalcarcinoma，crc)是消化系统常见的恶性肿瘤。在世界范围内结直肠癌的发病率排名第三位，仅次于肺癌和乳腺癌，每年全球有约120万名患者被确诊为结直肠癌，超过60万名患者直接或间接死于结直肠癌，在恶性肿瘤死亡原因中位居第二位。在中国近多年来由于生活方式和饮食习惯的变化，结直肠癌发病率上升趋势十分明显，每年发病率的平均增幅是4.2％，远高于欧美发达国家2％的发病率，因而日益引起人们对结直肠癌防治工作的关注。对于一般的中晚期结直肠癌患者来说，目前化疗是减缓疾病进展、延长生存期的重要治疗手段，但临床上经常遇到的问题是大部分患者开始对化疗药物治疗有效，而随着病程的进展会对一种或多种化疗药物产生耐药，最终导致化疗失败以及疾病复发。目前，肿瘤细胞对多种化疗药物治疗产生抵抗即肿瘤多药耐药，是结直肠癌治疗的一大难题。

新的化疗药物和治疗方案不断被推出，然而至今仍未能解决肿瘤耐药这一难题。在临床实践中，许多肿瘤的初次化疗一般可取得较好的结果，然而此后却难免要复发，且复发后的治疗效果往往更差，其主要原因就是残存的肿瘤细胞包括干细胞已经对化疗药物产生了耐药性，即对治疗的敏感性降低。因此对肿瘤耐药机制和新型治疗方法的研究，对于克服抗癌治疗面临的困境是极为重要的，本领域有必要不断探索克服肿瘤耐药性的新途径，来改善临床上肿瘤治疗效果。

肿瘤对化疗药物的耐受性是肿瘤治疗的主要障碍，也是临床效果不佳甚至最终走向失败的根本原因。肿瘤干细胞与肿瘤多种耐药密切相关。近年来的研究指出，肿瘤中的干细胞样的细胞群体对维持肿瘤异质性以及化疗耐药发挥了重要作用。肿瘤干细胞(cancerstemcell，csc)是具有干细胞性质的癌细胞，具有强大的自我更新以及具有多细胞分化等能力；虽然在肿瘤中这群干细胞样性质的癌细胞数量十分稀少，但是却具有非常强大的成瘤能力，对传统化疗和放疗均高度耐受。由于肿瘤干细胞的特性通常并非只针对单种化疗药物耐药，而是产生多种耐药。因此肿瘤干细胞是结直肠癌多种耐药治疗过程中的重要靶点之一，由此开展结直肠癌肿瘤干细胞和耐药机制的相关研究将有助于个体肿瘤药物敏感性的预测，对结直肠癌的个体化治疗具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供一种与结直肠癌相关的分子标记物、抑制剂、试剂盒和药剂。

根据第一方面，一种实施例中提供一种与结直肠癌相关的分子标记物，该分子标记物是sox1基因或其表达的蛋白，上述sox1基因在结直肠癌中表达上调。

进一步地，上述分子标记物是sox1基因的mrna。

进一步地，上述分子标记物是sox1基因表达的蛋白。

根据第二方面，一种实施例中提供一种sox1基因的表达抑制剂在制备抑制结直肠癌发生和/或发展的药物中的应用。

进一步地，上述sox1基因的表达抑制剂选自sox1基因的反义链中sirna。

进一步地，上述sirna的序列如下：

gcatgatgatggagaccga(seqidno：3)。

根据第三方面，一种实施例中提供一种结直肠癌的检测试剂盒，该试剂盒包括能够定量检测sox1基因的表达量的试剂。

进一步地，上述试剂至少包括实时荧光定量检测sox1基因的引物序列；上述引物序列如下：

正向引物：5'-cacaactcggagatcagcaa-3'(seqidno：1)；

反向引物：5'-gtaatccgggtgttccttca-3'(seqidno：2)。

根据第四方面，一种实施例中提供一种治疗结直肠癌的药剂，该药剂中含有抑制sox1基因表达的试剂。

进一步地，上述试剂包括sox1基因的反义链sirna；上述sirna的序列如下：

gcatgatgatggagaccga(seqidno：3)。

本发明在结直肠癌的肿瘤细胞中发现了sox1基因高表达，这提示sox1基因具有成为肿瘤辅助诊断标记物的潜能。还发现sox1基因高表达与结直肠癌患者年总生存率及无病生存率显著负相关，sox1基因高表达明确指示较差的生存预后，这提示sox1基因具有成为结直肠癌患者生存预后指标的潜能。体内和体外的功能性研究分析表明，sox1基因能够促进结直肠癌细胞的恶性发展。此外，抑制sox1基因的表达能够抑制肿瘤干细胞特性和增强其对化疗药物的敏感性。并且，抑制sox1基因的表达可抑制肿瘤干细胞相关生物标志物的表达。

附图说明

图1为本发明试验例中结直肠癌耐药基因的筛选结果，其中a示出了tcga结直肠癌耐药与非耐药病人组织基因表达谱差异基因火山图；b示出了sox1的mrna在结直肠癌耐药的患者中显著高表达；

图2为本发明试验例中sox1在结直肠癌组织中表达显著性升高的结果图；

图3为本发明试验例中sox1的表达水平与患者的生存预后负相关的结果图；

图4为本发明试验例中在体内sox1增强细胞对药物的抵抗的结果图；

图5为本发明试验例中sox1的细胞生物学功能试验结果图，其中a示出了高表达sox1增强药物的耐药性；b示出了sox1高表达的细胞形成的球囊体积较大数目较多；c示出了sox1高表达的细胞中侧群细胞的比例较高。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本发明相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本发明的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

本发明提出了一种用于检测并治疗结直肠癌的分子技术，尤其是高灵敏度地检测肿瘤中基因耐药sox1的表达及其在监控结直肠癌患者对化疗药物抗耐药性等。通过对结直肠癌组织样本中的基因的表达量与正常结直肠癌组织中的基因的表达量进行对比，当样本中基因的表达量高于正常基因的表达量时，提示该样本为结直肠癌样本。也可以通过对样本结直肠癌组织进行免疫组化测定，当样本结直肠癌组织的染色指数过高时，表明该样本结直肠癌组织中高表达。

本发明包括如下方面的研究方案：

(1)sox1在体外系统影响肿瘤耐药的生物学验证

利用tcga结直肠癌高通量基因测序表达谱(mrnahigh-throughputsequencing)，结合相应患者多种临床药物有效性的资料分析，筛选出与耐药相关的差异表达基因。利用大型癌症公共数据库中高通量测序基因表达谱芯片，进行统计分析，发现sox1在耐药的病人中显著高表达，并在动物模型验证了过表达sox1能够增强肿瘤在体内耐药的能力。同时前期的体外实验发现过表达sox1能增强肿瘤干细胞的特性，进而增强肿瘤细胞的抗凋亡能力，引起细胞耐药。

为深入了解sox1结直肠癌中的生物学功能，在sox1高表达的细胞模型中，需要通过实时荧光定量pcr，流式细胞术和蛋白免疫印迹检测肿瘤干细胞标志物的mrna和蛋白表达水平。

(2)在动物体内，sox1对肿瘤细胞的成瘤能力的影响

前期的体外实验表明sox1使细胞自我更新能力增强，进一步研究其在动物体内的成瘤能力，验证其是否具备增强肿瘤干细胞特性的能力。

利用活体成像系统，在裸鼠皮下在接种相同细胞数量(5000个，1000个，100个)的sox1高表达和对照细胞6周后观察形成肿瘤的数量。最后解剖裸鼠，并将原位肿瘤取出，通过h&e染色检测，免疫组化法和免疫印迹法，分析肿瘤中sox1与干细胞相关表面标志物和因子的表达相关性。

(3)在低表达sox1的细胞模型中验证上述生物学功能结果

在前述研究的基础上，我们在sox1低表达的细胞中加以全面验证。

首先，在裸鼠体内模型中，将sox1低表达及对照空载体细胞接种皮下形成肿瘤后对其进行用药处理，观察其耐药反应，从反面验证sox1在体内对结直肠癌耐药的影响。

其次，在sox1低表达的细胞模型中，通过药物敏感性实验和ic50检测实验验证sox1对细胞药物敏感性的影响，同时检测其对细胞凋亡的作用。进一步，在sox1低表达的细胞中采用球囊形成实验，侧群细胞检测技术，流式细胞术和体内成瘤实验来验证sox1对肿瘤干细胞特性的影响。

(4)sox1通过wnt信号通路和stat3信号通路维持肿瘤干细胞

sox1在结直肠癌中调控的信号通路时却发现单独抑制了wnt信号通路，sox1在结直肠癌中引起的生物学功能并没有完全抑制，因此我们进一步从中发现了sox1过表达会使stat3双报告基因荧光素酶的活性明显增强，上述证据提示sox1还可能通过stat3信号通路来维持肿瘤干细胞。

因此我们需要通过免疫荧光或核浆蛋白分离检测sox1对stat3蛋白在细胞内分布的影响，实时定量检测stat3信号通路特异的直接下游基因的表达来反映信号通路的转录活性，从而证实sox1对该信号通路的作用。

此外，sox1作为发育过程中重要的转录因子与干细胞的特性密切相关。因此我们将进一步利用染色质免疫共沉淀技术(chromatinimmunoprecipitation)来分析转录因子sox1全基因组水平上直接转录调控的下游基因，分析sox1对干细胞相关因子的转录调控作用。我们还将在sox1高表达和低表达的细胞模型中，通过荧光素酶酶活性检测法，进一步验证sox1是否可直接结合在上述靶基因的启动子上，以及通过功能回补实验确定上述靶基因对sox1引起的生物学效应的作用。

为了更加清楚地说明本发明，下面结合试验例对本发明进行进一步的说明，步骤中的条件为最优条件是说明性的，具体保护范围应该以权利要求为准。

试验例1筛选结直肠癌中与耐药相关的基因

从大型癌症公共数据库tcga下载结直肠癌的高通量测序芯片表达谱数据(mrnahigh-throughputsequencing)，分别分析5-氟胞嘧啶(5-fluorouracil)、亚叶酸(folinicacid)、奥沙利铂(oxaliplatin)耐药与非耐药病人的差异表达基因，我们发现sox1基因在结直肠癌耐药的患者中显著性高表达。

如图1所示，结直肠癌耐药基因的筛选结果显示：a.tcga结直肠癌耐药与非耐药病人组织基因表达谱差异基因火山图，其中紫色点(右侧)指示耐药病人高表达的基因，绿色点(左侧)指示的是耐药病人低表达的基因。b.sox1的mrna在结直肠癌耐药的患者中显著高表达，rsem值代表基因在rna-seq中的读值和表达水平，蓝色点(左侧)代表对药物敏感的病人癌组织中sox1的表达水平，红色点(右侧)代表药物耐受病人癌组织sox1的表达水平。

试验例2sox1在结直肠癌组织中表达显著性上调

tcga癌症公共数据库中，分析了380例结直肠癌的肿瘤组织和50例结直肠癌的癌旁非癌组织，发现肿瘤组织中sox1的mrna表达水平显著高于癌旁组织。

如图2所示，sox1在结直肠癌组织中表达显著性升高，其中rsem值代表基因在rna-seq中的读值和表达水平，蓝色点(左侧)代表sox1在癌旁非癌组织中的表达值，红色点(右侧)代表结肠癌组织中sox1的表达值。

试验例3sox1的基因表达水平与患者的生存预后相关

利用tcga中363例结直肠癌有基因表达谱数据和相应生存预后资料的临床资料分析发现，sox1高表达的患者生存预后明显差于sox1低表达的患者，差异具有统计学意义。

如图3所示，sox1的表达水平与患者的生存预后负相关。k-m生存曲线分析根据sox1的表达水平高低按中位数分为两组，红色线(下侧)代表sox1高表达组，绿色线(上侧)代表sox1低表达患者组。

试验例4在体内过表达sox1可增强结直肠癌细胞对药物的抵抗能力

选取结直肠癌的细胞系lovo进行动物体内实验，观察sox1对结直肠癌耐药的影响。

如图4所示，在体内sox1增强了细胞对药物的抵抗。将结直肠癌细胞系接种裸鼠皮下，形成500mm³的肿瘤后，加入上述药物处理，2次/周，30天后处死动物取出肿瘤测量大小，标尺为1cm。我们发现进行药物治疗后，lovo-vector细胞形成的肿瘤对药物敏感，体积出现消减，而lovo-sox1细胞形成的肿瘤则表现出对药物抵抗，肿瘤体积增大。

试验例5在体外sox1通过维持肿瘤干细胞，而增强细胞对药物的抗凋亡能力

药物敏感性实验表明过表达sox1后细胞对药物的敏感性下降。同时，球囊形成实验和侧群细胞分离实验表明sox1能够增强结直肠癌细胞系的自我更新能力，增加侧群细胞比例。

如图5所示，sox1的细胞生物学功能。a：克隆形成实验在平板中接种相同数量的细胞，在24h后加入相应药物处理，继续培养24h固定染色，结果显示高表达sox1增强了药物的耐药性。b：lovo细胞在无血清培养基悬浮培养的球囊，结果显示sox1高表达的细胞形成的球囊体积较大数目较多。c：sox1高表达的细胞中侧群细胞的比例较高，图中黑色框为设定的阈门，以及相应阈门内的细胞比例为侧群细胞比例。

基于以上试验结果，本发明实施例提供以下方面：

(1)sox1基因在结直肠癌中的诊断、治疗和预后的应用：本发明发现sox1基因在结直肠癌病人中高表达，与病人的生存率低显著相关。体内、外实验研究发现，sox1基因高表达能够促进恶性结直肠癌发展，而抑制sox1基因的表达能够抑制干细胞特性并增强其对化疗药物的敏感性。可见，sox1基因的表达抑制剂是肿瘤干细胞的重要抑制物。本发明首次发现检测结直肠癌病人中sox1基因的表达，可以作为辅助诊断和/或预后判断的指标。因此，本发明为结直肠癌疾病提供了新的诊断、治疗方法和药物筛选分子。

(2)sox1基因作为结直肠癌检测靶点的应用：本发明提供一种结直肠癌的检测试剂盒，含有实时荧光定量检测sox1基因表达的引物序列。引物序列包括：正向引物：5'-cacaactcggagatcagcaa-3'(seqidno：1)；反向引物：5'-gtaatccgggtgttccttca-3'(seqidno：2)。sox1基因作为结直肠癌预后靶点的应用，本发明提供一种结直肠癌的预后诊断试剂盒，含有能够定量检测sox1基因表达量的试剂，该试剂含有实时荧光定量检测sox1基因表达的引物序列。

(3)治疗结直肠癌的药剂，该药剂中含有抑制sox1基因表达的试剂，选自sox1基因的反义链中的sirna，优选地，sirna的序列为：gcatgatgatggagaccga(seqidno：3)。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

sequencelisting

<110>中山大学附属第八医院（深圳福田）

<120>与结直肠癌相关的分子标记物、抑制剂、试剂盒和药剂

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