专利名称：胃癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及人血清/血浆中微小核糖核酸分子的分离、定性 和定量分析，同时也涉及胃癌的各种临床指征。具体来说，本发明是一种利用胃癌病人血清 /血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸作为胃癌的检测标记物以及检测该标记物的方法、 相关试剂盒及生物芯片，通过胃癌病人血清/血浆中微小核糖核酸的变化，在体外诊断胃 癌与慢性胰腺炎，判断胃癌发病过程，预测胃癌并发症的发生和胃癌复发的几率、以及胃癌 的预后，并分析药效和疗效。
背景技术：
胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位。在胃的恶 性肿瘤中，腺癌占95%。这也是最常见的消化道恶性肿瘤，乃至名列人类所有恶性肿瘤之前 茅。早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期。我国胃癌死亡率为25. 2/10万(男性32.8/10万，女性17. 0/10万)，占全部恶 性肿瘤死亡的23. 2%,占恶性肿瘤死亡的第一位。胃癌诊断主要依靠X线钡餐造影、胃镜和 活组织病理检查。同时辅助的检测手段还包括癌的免疫学反应、体内特殊化学成分的测定 及酶反应等。血中如血清胃蛋白酶原I及胃蛋白酶原I/II之比；CEA，CA19-9，CA125等癌 胚抗原及单克隆抗体的检测都可以对胃癌的诊断提供参考，但这些检查假阳性与假阴性均 较高，特异性不强。尽管越来越多的疾病标记物已经被发现并应用于临床疾病的普查、诊断和疗效的 监控，但是它们的临床应用效果还存在着明显不足。例如，肿瘤标记物甲胎蛋白，乳酸脱氢 酶，癌胚抗原等已被广泛应用于临床，但是这些疾病标记物还远远不能满足对癌症早期诊 断的需要，其主要原因有两个方面(1)上述疾病标记物的灵敏度和特异性相对较低，它们 的检测结果还不能作为疾病确诊的指标；(2)疾病的早期诊断率应与治疗的效果呈现正相 关，而上述任何一种疾病标记物还难以满足疾病早期诊断的这种要求。以癌症为例，由于存 在着肿瘤分化类别特异性过强、肿瘤整体敏感性较低、送检标本难以反复采取、标本保存要 求条件高等缺陷，同时价格昂贵，因此在现有条件下难以广泛推广应用现有的肿瘤标记物。 而一些传统医学手段，如组织细胞检测存在着其固有的缺陷，取材位置不当、组织细胞标本 材料不足或人为经验不足等都将导致误诊。其它技术例如影像学虽然已被广泛应用于疾病 的检查和诊断，但其在疾病程度的定性上仍存在着很大的局限性。因此目前非常有必要寻 找能够弥补现有标记物的上述缺陷的新型、灵敏并且应用方便的疾病检测标记物。微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链 小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发 育、组织分化、细胞调亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着 紧密的联系。最近的研究发现慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的几种微小核 糖核酸的表达水平均有不同程度的下调(Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM et al. Detection of elevated levels of tumor-associated microRNAs in serum of patients withdiffuse large B—cell lymphoma. Br J Haematol 2008;141:672-675)；分析比较人月市 癌、乳腺癌组织中的微小核糖核酸表达时，发现有若干组织特异性微小核糖核酸的表达水 平相对于正常组织发生了变化(Garofalo M, Quintavalle C, Di Leva G et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene 2008)。也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的 发生和发展，并且与II型糖尿病等代谢性疾病有密切关联(Tryndyak VPiRoss SA，Belmd FA, Pogribny IP. Down-regulation of the microRNAs miR_34a，miR-127，and miR_200b in rat 1 iver during hepatocarcinogenesis induced by a methyl—deficient diet. Mol Carcinog. 2008 Oct 21)。这些实验结果提示微小核糖核酸表达及特异性变化与疾病 发生和发展之间存在着必然联系。由于微小核糖核酸在基因转录后的表达调控中起着超乎想象的重要作用，因此它 与疾病存在以下的关联性首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制 因子以及促进因子都可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸本身先发生了紊乱表 达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或者抑制疾病抑制因子的 微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通 路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次，微小核糖核酸的变化也可能是疾病的结果，这是 因为当疾病(如癌症)发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧 烈扩增，若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。 因此，理论上微小核糖核酸分子完全可以作为一类新的疾病标记物，它的特异性变化必然 与疾病产生发展相关联。同时微小核糖核酸还可以作为潜在的药物作用靶点，通过抑制疾 病过程中上调的微小核糖核酸或过表达下调的微小核糖核酸，将有可能极大地缓解疾病的 发生和发展。国内目前已有以微小核糖核酸作为疾病标记物的相关研究，如中国专利申请 CN100999765A和CN101298630A，它们均选取占恶性肿瘤发病率第4位的结肠癌作为研究对 象，经研究发现，在结肠良性息肉发展成恶性肿瘤期间，一些微小核糖核酸分子都存在着特 异性变化，并据此通过测定微小核糖核酸的特异性变化已经建立起一种更敏感、更精确的 早期确诊结肠癌的方法。然而由于组织标本的取材不容易使这种方法在临床上的广泛应用 受到了限制。
发明内容
为克服上述缺陷，本申请人将研究目光投向较易获得，甚至常规体检中就可以收 集到的血液。由于血液会循环至全身所有组织，并向细胞输送营养并清除废物，因此血液能 够反映出整个机体的生理病理状况，其检测结果对人体健康具有指导意义。已知血清/血 浆中存在着多种蛋白，如总蛋白、白蛋白、球蛋白等，多种脂质，如HDL胆固醇、三甘油脂等， 多种糖质，色素，电解质和无机盐，多种酶，如淀粉酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、胆素脂酶、 醛缩酶等，同时还汇集了来自全身组织器官的多种信号分子，如细胞因子，激素等。目前，对 疾病的诊断仅仅局限于血清/血浆中的上述生化指标，尚无血清/血浆微小核糖核酸的报 道。人们传统观念中认为血清/血浆中没有核糖核酸分子，即使有也会很快被核糖核酸酶 降解为小分子片段而检测不到。但是，由于微小核糖核酸分子是由19至23个核苷酸单元组成，具有结构上的特殊性和相对稳定性，它们极有可能存在于血清/血浆中。本申请发明 人之一张辰宇教授的前期研究已经证实，血清/血浆中稳定地存在微小核糖核酸，且每一 种疾病有其特异性的变化图谱(Chen et al Characterization of microRNAs in serum a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 2008 Oct ；18(10) 997)。为寻找胃癌检测标记物并对其进行准确检测，本发明人基于已有的研究成果，进 行了以下几个方面的研究(1)研究胃癌发病过程中血清/血浆微小核糖核酸的特异性变化；(2)通过用于检测血清/血浆微小核糖核酸的生物芯片和测序技术测定胃癌血清 /血浆微小核糖核酸的变化；(3)将筛选到的在胃癌及正常生理状态下表达差异程度大的一类血清/血浆微小 核糖核酸分子应用于血清/血浆微小核糖核酸检测技术，制备应用于胃癌诊断等领域的生 物芯片和诊断试剂盒。通过上述对血清/血浆微小核糖核酸与胃癌的相关性的研究，申请人提出了以血 清/血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸作为胃癌检测标记物，建立一种体外检测血清/ 血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸的方法，通过检测特定微小核糖核酸的特异性变化来 进行胃癌的早期诊断，疾病鉴定和病程监控，复发及预后、并发症发生的预测，同时可以进 一步进行药效判定、用药指南、个体化治疗、中药有效成份筛选、种群分类等研究。本发明的目的首先是提供一种胃癌检测标记物，所述标记物包括以下在人体血清 /血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体(Mature microRNA)中的任意一种或一 种以上(例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或21 种)，优选任意 两种或两种以上miR-20a, miR_34a，miR-25，miR_27a，mi R-I，miR_92a，miR-223, miR-320, miR-375, miR-151-3p, miR-324-3p, miR-339-3p, miR-423-5p, miR-451, miR-486-5p, miR-629, miR-652, miR-320b, miR-320c, miR-1224 和 miR-1307。上述可作为胃癌检测标记物的微小核糖核酸，优选以下HiiR-I，miR-20a,， miR-27a, miR_34a或miR-423_5p中的任意一种或一种以上。上述血清/血浆可以来源于人体活体、组织、器官和/或尸体。本发明的另一个目的是提供检测上述胃癌检测标记物的方法，通过该方法可以进 一步评价人体胃癌的状态。上述检测方法选自反转录聚合酶链式反应方法(RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶 链式反应方法(Real-time PCR)、Northern印迹杂交方法(Northern blotting)、核糖核 酸酶保护分析方法(RNase protection assay)、Solexa 测序技术(Solexa sequencing technology)或生物芯片方法。上述RT-PCR方法为优选方法，包括以下步骤1)提取受试者的血清/血浆总RNA (例如使用Trizol试剂提取)，通过RNA逆转录 反应得到cDNA样品；或者以受试者的血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA 样品；2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；
3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；4) EB染色后在紫外灯下观察结果。上述Real-time PCR方法为另一优选方法，包括以下步骤1)提取受试者的血清/血浆总RNA (例如使用Trizol试剂提取)，通过RNA逆转 录反应得到cDNA样品；或者以受试者的血清/血浆样本作为缓冲液进行逆转录反应来制备 cDNA样品；2)用微小核糖核酸设计引物；3)加入荧光探针进行PCR反应；4)检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变 化。上述Northern blotting方法包括以下步骤1))提取受试者血清/血浆总RNA(例如使用Trizol试剂提取)；2)进行变性PAGE电泳和膜转移实验；3)制备同位素标记微小核糖核酸探针；4)进行膜杂交反应；5)同位素信号检测，如磷屏扫描检测结果。上述RNase protection assay方法包括如下步骤1)进行反义RNA探针的合成，同位素标记与纯化；2)提取受试者血清/血浆总RNA (例如使用Trizol试剂提取)；3)将提取后的RNA溶解在杂交缓冲液中并加入反义RNA探针进行杂交反应；4)加入RNase消化液进行反应；
5)进行电泳与放射自显影；6)分析结果。上述 Solexa sequencing technology 方法包括如下步骤1)提取受试者血清/血浆总RNA (例如使用Trizol试剂提取)；2)进行PAGE电泳回收17_27nt RNA分子；3)将adaptor prime酶联在小RNA分子的3’与5’端；4)进行RT-PCR反应后并进行测序；5)数据分析与处理。上述生物芯片方法包括如下步骤1)将人体血清/血浆中全部一千多种微小核糖核酸成熟体库点阵并制备生物芯 片；2)提取受试者血清/血浆总RNA (例如使用Trizol试剂提取)；3)通过柱分离来分离微小核糖核酸；4)利用T4RNA连接酶进行微小核糖核酸荧光标记；5)与生物芯片进行杂交反应；6)数据检测与分析。上述方法中所使用的血清/血浆来源于受试者活体、组织、器官和/或尸体。本发明通过上述方法可以分析在胃癌患者血清/血浆中微小核糖核酸的变化趋势及变化量，以及它们与胃癌的相关性。因此，以上检测受试者血清/血浆中21种特定微小 核糖核酸的方法，可以进一步评价人体胃癌的状态，进而可以为人们提供一种预测、诊断、 鉴别和/或评价胃癌的方法，该方法主要通过检测受试者血清/血浆中21种特定微小核糖 核酸即所谓的胃癌检测标记物来实现。本发明又一目的是提供上述胃癌检测标记物在制备、预测、诊断、鉴别和/或评价 胃癌的试剂或工具中的应用，包括制备相应的试剂盒和生物芯片。本发明还提供了一种用于检测胃癌标记物的微小核糖核酸探针组合，也即预测、 诊断和/或评价胃癌的微小核糖核酸探针组合，所述探针组合包括以下核苷酸序列所示的 探针中的任意一种或一种以上(例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19,20或21种)，优选任意两种或两种以上miR-20a, miR_34a，miR—25，miR_27a，mi R-I，miR_92a，miR-223, miR-320, miR-375, miR-151-3p, miR-324-3p, miR-339-3p, miR-423-5p, miR-451, miR-486-5p, miR-629, miR-652, miR-320b, miR-320c, miR-1224 和 miR-1307。
权利要求
一种胃癌检测标记物，其特征在于所述标记物包括以下在人体血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的任意一种或一种以上miR 20a，miR 34a，miR 25，miR 27a，miR 1，miR 92a，miR 223，miR 320，miR 375，miR 151 3p，miR 324 3p，miR 339 3p，miR 423 5p，miR 451，miR 486 5p，miR 629，miR 652，miR 320b，miR 320c，miR 1224和miR 1307。
2.根据权利要求1所述胃癌检测标记物，其特征在于，所述标记物包括以下在人体血 清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的任意两种或两种以上miR-20a, miR-34a, miR-25, miR-27a, miR-1, miR-92a, miR-223, miR-320, miR-375, miR-151-3p, miR-324-3p, miR-339-3p, miR-423-5p, miR-451, miR-486-5p, miR-629, miR-652, miR-320b, miR-320c, miR-1224 和 miR-1307。
3.根据权利要求1或2所述的胃癌检测标记物，其特征在于所述标记物包括以下在人 体血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的任意一种或一种以上miR-1, miR-20a,，miR-27a, miR_34a，禾口 miR-423_5p。
4.根据权利要求1或2所述的胃癌检测标记物，其特征在于所述血清/血浆来源于人 体活体、组织、器官和/或尸体。
5.根据权利要求3所述的胃癌检测标记物，其特征在于所述血清/血浆来源于人体活 体、组织、器官和/或尸体。
6.权利要求1至5任意一项所述标记物的检测方法，其特征在于选自反转录聚合酶链 式反应方法、实时荧光定量聚合酶链式反应方法、Northern印迹杂交方法、核糖核酸酶保护 分析方法、Solexa测序技术或生物芯片方法。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述反转录聚合酶链式反应方法包括 以下步骤1)提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者以受试 者的血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；4)EB染色后在紫外灯下观察结果。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述实时荧光定量聚合酶链式反应方 法包括以下步骤1)提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者以受试 者的血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；2)用微小核糖核酸设计引物；3)加入荧光探针进行PCR反应；4)检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。
9.一种预测、诊断和/或评价胃癌的方法，其特征在于，所述方法包括检测以下人体血 清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的任意一种或一种以上miR-20a, miR-34a, miR-25, miR-27a, miR-1, miR-92a, miR-223, miR-320, miR-375, miR-151-3p, miR-324-3p, miR-339-3p, miR-423-5p, miR-451, miR-486-5p, miR-629, miR-652, miR-320b, miR-320c, miR-1224 和 miR-1307。
10.权利要求1或2或3所述的检测标记物在制备预测、诊断、鉴别和/或评价胃癌的 试剂或工具中的应用。
11.一种用于检测胃癌检测标记物的微小核糖核酸探针组合，其特征在于所述组合包 括以下探针序列中的任意一种或一种以上__
12.根据权利要求11所述的探针组合，其特征在于所述组合包括以下核苷酸序列所示 的探针中的任意一种或一种以上
13.一种用于检测胃癌标记物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测权利要求1 至3中任一项所述标记物的工具。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于所述工具包括权利要求11或12所述 的探针组合。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于所述工具还包括DNA聚合酶和/或脱 氧核糖核苷酸混合物。
16.一种用于检测胃癌检测标记物的生物芯片，其特征在于所述生物芯片包含检测权 利要求1至3任意一项所述的标记物的元件。
17.根据权利要求16所述的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片的元件包括权利要 求11或12所述的探针组合。
全文摘要
本发明涉及一种利用人体血清/血浆中稳定存在的21种特定微小核糖核酸作为胃癌的检测标记物以及检测该标记物的方法、相关试剂盒及生物芯片。能够用于胃癌的诊断与鉴别诊断、疾病并发症的发生和复发的预测、疗效评价，以及药物活性成分的筛选、药效评价等方面，具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于胃癌普查等相关工作，改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高胃癌的临床检出率，成为早期诊断乳腺癌的有效手段。
文档编号C12N15/11GK101988059SQ20101023844
公开日2011年3月23日 申请日期2010年7月28日 优先权日2009年7月30日
发明者刘锐, 巴一, 张辰宇, 曾科, 李海进 申请人:江苏命码生物科技有限公司