一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂及诱导方法与流程

本发明属于一种细胞培养诱导剂及细胞的诱导方法，具体涉及一种干细胞样记忆性t细胞体外诱导剂及诱导方法。

背景技术：

2005年，zhang等在研究小鼠移植物抗宿主反应疾病(graftversushostdisease，gvhd)模型中发现，一群来源于供体的cd8+t细胞在gvhd发生的过程中持续存在，造成宿主损伤。与初始t细胞或成熟记忆性t细胞相比，这群t细胞具有干细胞的特征，即能够自我更新，在体内能够分化产生中枢性和效应性记忆性cd8+t细胞，并且产生的这些子代细胞表现出记忆性t细胞的特征，能够快速对再次免疫的抗原产生反应并且分化为效应细胞，引起gvhd。研究人员将这群细胞定义为“干细胞样记忆性t细胞”，或称为“tscm细胞”。

tscm细胞具备快速增殖能力，在归巢因子il-15和il-7作用下，能够快速的增殖，cd8+tscm细胞在il-15作用下能快速的分裂，这种分裂方式与干细胞非常类似，增殖的两个子代细胞中，一个子代细胞继续分化为其他细胞类型，另外一个自我复制，依然维持母代细胞的表型，因此虽然经历多代细胞分裂，部分细胞仍然处于静息状态，依然具有产生子代细胞的增值和分化能力。在il-7的刺激下，cd4+tscm细胞具有相似的能力。tscm细胞一方面可分泌具有杀伤能力的细胞因子，如ifn-γ、tnf-α、granzymeb等；另一方面，在遇到抗原刺激时还可迅速分化成为效应t细胞，中央记忆性t细胞以及效应记忆性t细胞，发挥其快速免疫应答的功能。

tscm细胞具有很强的抗肿瘤功能，无论在动物模型和人源化小鼠黑色素瘤模型中均观察到这种现象。研究人员推测tscm细胞的抗肿瘤效应，除了可能由于其具有很强的增殖能力和分化能力，同时也与自身能够产生抗肿瘤的细胞因子如ifn-γ有关。另外，tscm白血病的治疗中也表现出较强的免疫抗肿瘤能力。

这群细胞作为一种具有自我更新能力和多能性潜力的t细胞亚群，在诸多的免疫性疾病中都发挥着重要的作用。

上述研究结果提示tscm细胞具备干细胞的特性，具有很强的增殖和分化能力，体外移植实验表明其具有很强的生存能力，tscm细胞能有效的扩增，并保持长效的记忆t细胞能力，tscm细胞所具备的这些特征解决了临床上移植细胞体外扩增难的问题。其次，tscm细胞很强的生存能力使得植入体内细胞生存时间延长，并且自身能够产生具有抗肿瘤功能的细胞因子。因此人们还可以进一步探索如何利用体外扩增tscm细胞来作为新的过继免疫治疗策略。tscm细胞有可能成为最为有效的act(theadoptivecelltransfer，act)治疗肿瘤的细胞类型。由于tscm细胞在人体中的比例非常低，由此，探索如何能够诱导这种细胞快速扩增的方法就变得尤为重要和迫切。

红桂木凝集素(artocarpuslingnanensislectin，all)是一种性质稳定、凝集活性高的植物凝集素，有研究发现，all能诱导t细胞的活化，能促进人外周血单核细胞来源的树突状细胞的成熟及增殖。基于all在激活t细胞、树突状细胞增殖生长方面的重要作用，联合细胞因子il-2，本研究试图探索all在体外是否可诱导人tscm细胞的扩增，并检测其在tscm细胞诱导生成中的作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种红桂木凝集素联合细胞因子il-2在体外诱导人外周血cd3+t细胞产生人tscm细胞的扩增。

本发明的另一目的是提供一种干细胞样记忆性t细胞体外诱导扩增的方法。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种干细胞样记忆性t细胞体外诱导剂，所述的诱导剂包括红桂木凝集素；

所述的诱导剂还包括细胞因子il-2；

所述的干细胞样记忆性t细胞为cd3+细胞的亚群。

优选的，所述的cd3+细胞的亚群是指在cd3+细胞中选定cd45ra⁺cd45ro^－的细胞亚群，进一步再选出cd62l⁺ccr7⁺的细胞亚群，随后在这个亚群细胞的基础上，选定cd95⁺cd122⁺双阳性细胞。

一种干细胞样记忆性t细胞体外诱导方法，具体步骤为：

（1）将分选获得的cd3+细胞置于添加有流式细胞术用抗体的细胞培养液中培养；

（2）在培养液中加入诱导剂红桂木凝集素和细胞因子il-2进行诱导培养；

（3）诱导培养完成后，分选出cd3+tscm细胞。

优选的，所述的红桂木凝集素的浓度为2.5~10ug/ml，所述的细胞因子il-2的浓度为5~25ng/ml。

优选的，所述的红桂木凝集素的浓度为7.5ug/ml，所述的细胞因子il-2的浓度为12.5ng/ml。

优选的，所述的tscm细胞培养时间在6~8天左右。

优选的，所述的流式细胞术用抗体包括humancd3-apc、fitc、humancd8-apc、humancd8-pacificblue、humancd45ra-pe、humancd45ro-pe-cy5、humancd62l-pe-cy7、humanccr7-fitc、humancd95-pe-cy5和humancd122-pe的一种或多种。

一种红桂木凝集素在制备干细胞样记忆性t细胞体外诱导剂的应用。

一种红桂木凝集素和细胞因子il-2在制备干细胞样记忆性t细胞体外诱导剂的应用。

本发明突出的实质性进步和显著的特点是：

本研究发现了all联合细胞因子il-2可以在体外诱导tscm细胞产生并促使增殖和集落形成，快速诱导cd3+t细胞扩增为tscm，有效提高cd3+tscm的绝对数和形成比例，其诱导效果优于单独使用红桂木凝集素或细胞因子il-2进行扩增的效果。

all联合细胞因子il-2可以在体外诱导tscm细胞产生，具有一定的浓度梯度依赖性，其中最佳的浓度组合是7.5ug/mlall+12.5ng/mlil-2。随着处理时间的延长，能够诱导产生更多的tscm细胞。但是，如果处理时间过长，细胞会出现一定程度的死亡。因此，诱导tscm的最佳时间为6~8天。

本发明提供的all、细胞因子il-2具有安全性高，不存在药物毒性，能为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。

附图说明

图1是构建的流式检测tscm细胞的模板。

图2是all+il-2处理组对tscm细胞扩增结果。

图3是all处理组对tscm细胞扩增结果。

图4是il-2处理组对tscm细胞扩增结果。

图5是不同浓度all，il-2，以及all+il-2组合对tscm细胞增殖率的影响；

其中a1~a4分别为：2.5ug/ml、5ug/ml、7.5ug/ml、10ug/ml的all；

b1~b4分别为：5ng/ml、7.5ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml的il-2；

c1~c16分别为：2.5ug/mlall+5ng/mlil-2、2.5ug/mlall+7.5ng/mlil-2、

2.5ug/mlall+12.5ng/mlil-2、2.5ug/mlall+25ng/mlil-2、5ug/mlall+5ng/mlil-2、

5ug/mlall+7.5ng/mlil-2、5ug/mlall+12.5ng/mlil-2、5ug/mlall+25ng/mlil-2、

7.5ug/mlall+5ng/mlil-2、7.5ug/mlall+7.5ng/mlil-2、7.5ug/mlall+12.5ng/mlil-2、7.5ug/mlall+25ng/mlil-2、10ug/mlall+5ng/mlil-2、10ug/mlall+7.5ng/mlil-2、

10ug/mlall+12.5ng/mlil-2和10ug/mlall+25ng/mlil-2。

图6是不同浓度all、il-2和all+il-2组合对tscm细胞集落生成的影响。

图7不同浓度all、il-2和all+il-2组合对tscm细胞生成比率的影响。

图8培养时间对生成tscm细胞的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

1材料

健康人的外周成分血由南宁市血液中心提供。

2主要试剂和仪器

人外周血淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制天津市灏洋生物制品科技有限公司)，ｒpmi-1640培养基(gibco，美国)，胎牛血清(fbs)(gibco，美国)，青－链霉素双抗(gibco，美国)，生物安全柜，细胞培养箱(thermo)，离心机(eppendorf)，光学倒置生物显微镜(leica)，分析型流式，细胞仪(bd)，流式细胞术用抗体包括humancd3-apc、fitc、humancd8-apc、humancd8-pacificblue、humancd45ra-pe、humancd45ro-pe-cy5、humancd62l-pe-cy7、humanccr7-fitc、humancd95-pe-cy5和humancd122-pe均购自bdpharmingen。

3主要方法

3.1分离人外周血t细胞(peripheralbloodmononuclearcells，pbmcs)的分离2.5ml抗凝人外周成分血，加入等体积的生理盐水稀释，混匀后把稀释后的血贴壁缓缓加入已装有2.5ml人外周淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2500r/min离心25min，离心后，小心吸取悬于液体中间白膜层细胞，转移至15ml离心管中，加入5倍体积的pbs缓冲液洗细胞，1500r/min离心10min，弃上清液。重复清洗细胞1次。用rpmi-1640完全培养基悬浮细胞，37℃5%co2培养箱培养3~4h，转移悬浮细胞至新培养瓶。

3.2构建流式检测tscm细胞的方法：采取4步法来鉴定和分析tscm细胞。首先选定cd3+细胞，然后在cd3+细胞中选定cd45ra⁺cd45ro^－的细胞亚群，进一步再选出cd62l⁺ccr7⁺的细胞亚群，随后在这个亚群细胞的基础上，选定cd95⁺cd122⁺双阳性的细胞；该群细胞就是本研究所要关注的tscm细胞。

3.3刺激因子对生成tscm细胞的影响：在96孔板中设置各处理组。对照组：不加任何刺激。all组：分别加2.5ug/ml、5ug/m、7.5ug/ml、10ug/ml的all。

il-2组：分别加5ng/ml、7.5ng/ml、12.5ng/m、25ng/ml的il-2。

all+il-2联合组：分别加2.5ug/mlall+5ng/mlil-2、2.5ug/mlall+7.5ng/mlil-2、

2.5ug/mlall+12.5ng/mlil-2、2.5ug/mlall+25ng/mlil-2、5ug/mlall+5ng/mlil-2、

5ug/mlall+7.5ng/mlil-2、5ug/mlall+12.5ng/mlil-2、5ug/mlall+25ng/mlil-2、

7.5ug/mlall+5ng/mlil-2、7.5ug/mlall+7.5ng/mlil-2、7.5ug/mlall+12.5ng/mlil-2、7.5ug/mlall+25ng/mlil-2、10ug/mlall+5ng/mlil-2、10ug/mlall+7.5ng/mlil-2、

10ug/mlall+12.5ng/mlil-2、10ug/mlall+25ng/mlil-2，培养0~12天，倒置显微镜下观察细胞的生长，并记录细胞集落。

cck实验每孔加入cck-8溶液10μl，37℃继续培养2小时，用bio-rad酶标仪在450nm处检测吸光度值，计算增殖率。实验重复3次。测吸光度值，计算增殖率；增殖率(%)=(阳性对照组od值－阴性对照组的od值)/阴性对照组的od值×100%。

3.4细胞亚群的检测和分析在细胞培养的第2、4、6、8、10和12天，分别收取细胞标记抗体(humancd3-apc、fitc、humancd8-apc、humancd8-pacificblue、humancd45ra-pe、humancd45ro-pe-cy5、humancd62l-pe-cy7、humanccr7-fitc、humancd95-pe-cy5和humancd122-pe)检测tscm的比例。

4统计学处理

采用spss13.0分析软件进行统计分析，计量资料所有结果统一用均数±标准差(mean±sd)表示。各个实验组与对照组之间采用单因素方差分析进行比较，以p＜0.05为差异有统计学意义。

实施例2

5.结果

5.1构建流式检测tscm细胞的方法

本研究首先构建了一个流式检测tscm细胞的模板，见图1，将刺激后的t细胞进行抗体标记，在分析的过程中，采取4步法来鉴定和分析tscm细胞。首先选定cd3+细胞，然后在cd3+细胞中选定cd45ra⁺cd45ro^－的细胞亚群，进一步再选cd62l⁺ccr7⁺的细胞亚群，随后在这个亚群细胞的基础上，选定cd95⁺cd122⁺双阳性的细胞。该群细胞就是本研究所要关注的tscm细胞。

5.2检测all、il-2对tscm细胞扩增效果的影响

加all和il-2处理的细胞2、4、6、8、10、12天后，细胞生长良好，聚集成团并形成丰富集落；高倍镜下可见细胞染色质疏松、胞质丰富；单独加all处理的细胞，生长良好，能够聚集成集落，但是细胞密度、集落的丰富度不如加all+il-2联合处理的细胞；单独加il-2处理的组能够促使细胞增殖，但是不能形成集落。结果如图2~图4。

5.3不同浓度的all+il-2浓度处理对细胞增殖，集落形成和tscm产生率的影响

处理6天之后，用cck8方法对各处理组促进t细胞的增殖情况进行检测发现，随着all和il-2浓度的增加，细胞的增殖得到显著的促进。单纯all处理t细胞，细胞增殖率随着all的浓度增加而增大，il-2处理组的增殖幅度则较小，all+il-2联合处理组的细胞增殖率均比单纯all处理组、il-2处理组的高，其中7.5ug/mlall+12.5ng/mlil-2处理的细胞增殖率最高。（见图5）

处理6天之后，观察并记录各处理组促进t细胞的集落生成情况时检测发现，单纯all处理t细胞，细胞生成集落的数量随着all的浓度增加而增大，而单纯用il-2处理的细胞集落的生成不明显，all+il-2联合处理组的细胞集落数生成也依赖all的浓度呈现增长。（见图6）

处理6天之后，应用已构建的流式检测tscm细胞的模板对诱导产生的tscm细胞进行检测发现，随着all浓度的增加，tscm细胞的产生比例显著增加促进。单纯all处理t细胞，细胞增殖率随着all的浓度增加而增大，单纯il-2处理组的几乎没有诱导tscm细胞的生成，all+il-2联合处理组诱导产生的tscm细胞比率均比单纯all处理组的高，其中7.5ug/mlall+12.5ng/mlil-2处理诱导产生的tscm细胞比率最高。（见图7）

5.4培养时间对生成tscm细胞的影响

根据all、il-2浓度对t细胞增殖和集落生成的影响，我们选取了对细胞增殖和集落生成均能产生的浓度为7.5ug/mlall+12.5ng/mlil-2的组合来刺激生成tscm细胞。通过分别培养2、4、6、8、10和12天后，用已构建的流式检测tscm细胞的模板对生成tscm的比例进行检测发现，处理后tscm的细胞比例分别为3.04%、7.34%、11.65%、12.52%、8.29%和5.25%，见图8。说明随着培养时间的增长tscm细胞的比例逐渐增高，并且在6~8天左右达到最高，10天之后后tscm的比例则下降。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。