本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种即用型多探针杂交玻片及其制备方法和应用。
背景技术：
荧光原位杂交是一种在20世纪80年代放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子遗传技术，以荧光素标记取代放射性同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。fish具有安全、快速、灵敏度高及同时显示多种颜色等优点。
目前在血液学fish的检测中，通常使用的都是常规载玻片，并且探针和载玻片是分开单独使用的，通常需要先使用血液样本制片，再将玻片进行一系列前处理，再滴加探针并使用橡皮胶封片，封片后再进行探针样本共変性以及杂交；目前常见的血液病如白血病的fish检测项目多达数几十种，例如cll(慢性粒细胞白血病)需要检测cmyc基因断裂、p16缺失、e2a断裂、超二倍体检测(cep10/cep17/cep4)、tel/aml1融合、mll断裂、bcr/abl融合以及igh断裂等来评估疾病类型及进程。如果以现有杂交技术在针对需要检测多种探针的疾病时需要重复进行多次检测，费时费力。此外传统的fish实验使用的是传统fish探针需要过夜杂交并且一次性检测多个项目不仅耗时，而且高昂的费用也增加了患者的经济负担。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种即用型多探针杂交玻片及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种即用型多探针杂交玻片试剂盒，由探针附着玻片、各探针、杂交缓冲液和样本附着玻片组成；所述探针附着玻片上包含若干个相互独立的探针附着区，各探针以冻干的形式分别附着在各相互独立的探针附着区上；所述样品附着玻片上包含若干个相互独立的样品附着区，样品附着区与探针附着区一一对应，样品滴加在样品附着区上，当样本附着区与探针附着区贴合时，样品附着区的样品与相对应的探针附着区的探针实现杂交结合。
上述方案中，所述探针附着玻片由探针信息标识区、探针附着区域和杂交玻片接合区组成，所述探针信息标识区上记录了每个独立的探针附着区上对应的探针种类，所述探针附着区域内包含若干个相互独立的探针附着区，探针以冻干的形式附着在探针附着区上，所述杂交玻片接合区的表面附有丙烯酸脂胶水，用于探针附着玻片的包装封膜以及和样本附着玻片的粘结。
上述方案中，所述探针附着区域为一凹槽，凹槽内含若干个相互独立的探针附着小区块，每个独立的探针附着小区块由探针附着区和外围隔离区组成；每个独立的探针附着小区块之间存在隔离小沟。
上述方案中，所述样本附着玻片由样品信息记录区、样品附着区和样品隔离区组成，所述样品信息记录区上记录了样本信息，样品滴加在样品附着区上，所述样品隔离区用于防止样品交叉污染。
上述方案中，所述样品附着区采用亲水材质；所述样品隔离区附有疏水涂层。
上述方案中，所述杂交缓冲液的组分为：10wt％碳酸亚乙酯、30wt％硫酸葡聚糖、1ugrnasea、0.6m氯化钠、10mm柠檬酸缓冲液。
上述方案中，所述探针为fish基因位点探针或fish基因着丝粒/端粒探针。
上述方案中，各探针选自如下组合a或组合b：
组合a：bcr/abl，igh/bcl2，aml/eto；
组合b：pml/rara，bcr/abl，p53，d13s319，1q21，igh/bcl2，cbfb，aml/eto。
上述即用型多探针杂交玻片的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备附着有各探针的探针附着玻片：
a.制备具有上述结构的探针附着玻片；
b.使用去离子水配制赋形剂，所述赋形剂的配方为：左旋糖苷0.5wt％、阿拉伯胶树3wt％、甘露醇1wt％、聚丙烯酸酯0.3wt％；
c.分别配制各探针溶液，将各探针溶液分别与赋形剂混合均匀，分别滴加并均匀涂抹在探针附着玻片上每个独立的探针附着区上；然后将探针附着玻片冻干、封膜，制备得到附着有各探针的探针附着玻片；
(2)制备具有上述结构的样本附着玻片；
(3)配制杂交缓冲液；
(4)由制备所得附着有探针的探针附着玻片、杂交缓冲液和样本附着玻片组成即用型多探针杂交玻片。
上述即用型多探针杂交玻片的应用，具体包括如下步骤：
(1)样本处理：将固定好的外周血细胞分别滴加到样本附着玻片的样品附着区，将样本附着玻片浸入盛有37℃2xssc的容器中老化30min，微波炉高火加热处理3min直至液体沸腾，然后再中低火继续加热处理10min；处理完成后立即将玻片置于-20冰箱摄氏度预冷的梯度酒精中脱水晾干，备用；
(2)探针样本共変性：分别向探针附着玻片上探针附着区滴加杂交缓冲液，并将样本附着玻片倒扣，使样本附着区与探针附着区贴合在一起，贴合后将整个杂交玻片与样本附着玻片一起反转，置于金属浴73℃变性5min，变形完成后将杂交装置置于37℃湿盒杂交1h；
(3)杂交后洗涤：待杂交完成后移去探针附着玻片，将样本附着玻片置于60℃预热的洗液(含0.3m氯化钠、0.03m柠檬酸钠和0.1％tween-20)中洗涤去除未结合探针；洗涤完成后将玻片置于室温蒸馏水中再次洗涤，并室温晾干；
(4)复染及镜检：向晾干的样本附着玻片的样品附着区滴加抗淬灭封片剂，使用盖破片封片并在荧光显微镜下观察杂交结果。
本发明中所述fish基因位点探针的制备方法如下：
(1)从ucscgenomebrowser下载探针所覆盖区域的基因组非重复序列，将获得的探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入oligoarray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到excel表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的探针序列；
(2)使用dna合成仪对步骤(1)所得带有标签序列的探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到探针库；分别合成5’端带有绿色荧光基团的m13通用引物和5’端带有荧光基团的m13通用引物，使用5’端带有荧光基团的m13通用引物对探针库进行扩增标记反应；
(3)步骤(2)所得探针库的扩增标记产物经纯化、稀释后得到荧光标记的探针库。
上述方案中，步骤(1)中所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，tm值85～99℃，gc比40～80％，不含tttt/gggg/aaaa/cccc，探针间最小间隔5bp；步骤(1)所述标签序列的碱基序列如下所示：
5’端标签序列为：tgtaaaacgacggccag(m13上游序列)
3’端标签序列为：ggtcatagctgtttcctg(m13下游序列)。
上述方案中，步骤(2)中所述通用引物序列为：m13-ftgtaaaacgacggccagt；m13-rcaggaaacagctatgacc。
上述方案中，步骤(2)所述扩增标记反应的pcr反应体系如下：
上述方案中，步骤(2)所述扩增标记反应的pcr反应条件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共进行20个循环；72℃10min。
上述fish基因位点探针的制备方法适用于以下所列fish探针的制备，具体包括：alk、bcl2、bcl3、bcl6、bcl10、bcl12、bcr、ccnd1、e2a、egfr、etv6、fip1l1、her2、igh、igk、igl、malt1、mll(all-1、htrx1、hrx)、myc(c-myc)、pax5、pdgfra、pdgfrb、sil、tcf3(e2a、itf1)、tcl1a、tcrad、tcrb、tcrg、tlx1、tlx3(hox11l2、rnx)或top2a、base、brca1、ccnd1、ccne1、dcd、e2f3、n-myc/mycn、cox-2/ptgs2、lrig1、era、htert、mln64/stard3、pgr、snai1、src、top1、tubb1、aib1、dlc-1、edd、pip4k2b/5k、sil、tbx2、c-kit、vegf、vcam-1、tie-1、ts/tyms、psma、psa、pap、p15、p16、bcl1、bcl2、mtor、timp1、esr1、pten、mdm2/cdk4、met、c-met、erb1、fgfr1、igf1r、net、fgfr3、abcb1、tmprss2、brca2、top2b、ercc1、akt1、akt2、akt3、hras、nras、raf1、her3、her4、ent1、rrm1、rrm2、rrm2b、pik3ca、aurk4、aurkb、aurkc、mapt/tau、ttbk1、tubb、vegfr、ccnd3、cdk6、cdk2、cdc2、hdac、esr2、scube2、birc5、fasn、dhfr、tp/ecgf1、tymp、dpyd、tk1、hmgic、abca2、abcb11、abcc1、abcc2、abcc3、abcc4、abcc5、abcg2、mvp、atp7a、atp7b、slc29a1、slc28a1、slc19a1、tubb4、tuba、map4、map7、stmn1、kif5b、hspa5、psmd14、fpgs、gstp1、gpx、gclc、：ablt(9；22)(q34；q11)、prdm16del(1p36.32)del(21q22.12)、runx1/aml1del(1p36.32)del(21q22.12)、cep8、pdgfrb、nup98、fgfr1、ass、etot(8；21)(q22；q22)、aml1t(8；21)(q22；q22)、cbfbetainv(16)(p13q22)t(16；16)(p13；q22)、myh11inv(16)(p13q22)t(16；16)(p13；q22)、af9t(9；11)、pmlt(15；17)(q22；q21)、plzft(11；17)(q23；q21)、numat(11；17)(q13；q21)、npmt(5；17)(q23；q12)、rarαt(15；17)(q22；q21)t(11；17)(q23；q21)t(11；17)(q13；q21)t(5；17)(q23；q21)、evi1t(3；v)(q26；v)。
本发明中所述fish基因着丝粒及端粒探针的制备方法如下：
(1)pcr扩增着丝粒探针或端粒探针的特异性片段；
(2)切口平移法标记上述特异性片段(标记体系为常规缺口平移体)；
(3)使用乙醇醋酸钠法纯化所制备的着丝粒/端粒探针，使用去离子水溶解并将探针浓度稀释为100ng/ul备用。
所述fish基因着丝粒及端粒探针的制备方法适用于如下所列着丝粒/端粒探针的制备，具体地：cep1、cep2、cep3、cep4、cep5、cep6、cep7、cep8、cep9、cep10、cep11、cep12、cep13、cep14、cep15、cep16、cep17、cep18、cep19、cep20、cep21、cep22、cep23、cepx、cepy和端粒。
本发明中，所用探针使用赋形剂组合物溶解后使用移液器涂抹在对应的独立的探针附着区。具体的赋形剂组合物配方为：左旋糖苷0.5％，阿拉伯胶树3％，甘露醇1％，聚丙烯酸酯0.3％，使用去离子水溶解，4℃保存备用。
本发明所述多探针杂交玻片在具体使用时，需在探针附着玻片的每个探针附着区滴加2μl杂交缓冲液，然后将样本附着玻片倒扣在探针附着玻片上，样品和探针结合，将结合后的杂交玻片置于金属浴上73℃变性2min，置于37℃湿盒杂交2h。
本发明的有益效果：
(1)相比于传统的fish实验，本发明可以再一张玻片上同时预置多组探针，并且可以再同一张玻片上完成多种探针的检测，大大简化了传统fish的操作步骤；
(2)与现有的所有技术相比本发明通过独特的设计，并配合特定的杂交缓冲液以及独特的检测方法，减少了探针的使用量降低了探针的使用成本；
(3)本发明所述的即用型多探针杂交玻片具有极高的信噪比、特异性以及样本检出率；
(4)相比于近年来建立的不含重复序列的快速荧光原位杂交探针的制备方法，本发明采用的探针筛选主要依赖程序完成，并且使用的是更为稳定的pcr法扩增和标记探针，并且探针标记率更高更均一，仅在探针5端进行荧光标记所以不影响探针的杂交配对反应；此外本发明不采用容易受环境或操作手法影响的缺口平移反应和随机引物反应来标记探针，所标记的探针长短一致，标记产量高并且增加了批次间的稳定性。
附图说明
图1为本发明所述多探针杂交玻片的探针附着玻片平面图。
图2为本发明所述多探针杂交玻片的探针附着玻片立体结构以及尺寸数据。
图3为本发明所述多探针杂交玻片的样本附着玻片平面图。
其中，1为探针信息标识区，2为探针附着区域，3为杂交玻片接合区，4为探针附着区，5为外围隔离区，6为隔离小沟，7为样品信息记录区，8为样品附着区，9为样品隔离区。
图4为实施例1中chunks.pl程序使用代码图。
图5为实施例1中去除重复序列后cbfb基因断裂检测试剂盒部分探针序列图。
图6为探针制备示意图。
图7为实施例3所述即用型多探针杂交玻片示意图。
图8为本发明检测结果图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
如附图1～3，一种多探针杂交玻片，由探针附着玻片(a)和样本附着玻片(b)两部分构成。所述探针附着玻片(a)由探针信息标识区(1)、探针附着区域(2)和杂交玻片接合区(3)组成，所述探针附着区域(2)为一凹槽，凹槽内含若干个相互独立的探针附着小区块，每个独立的探针附着小区块由探针附着区(4)和外围隔离区(5)组成，每个独立的探针附着小区块之间存在隔离小沟(6)，探针以冻干的形式附着在探针附着区上；所述探针信息标识区(1)上记录了每个独立的探针附着区上对应的探针种类，所述杂交玻片接合区(3)的表面附有丙烯酸脂胶水，用于探针附着玻片的包装封膜以及和样本附着玻片的粘结。
所述样本附着玻片(b)由样品信息记录区(7)、若干个相互独立的样品附着区(8)和样品隔离区(9)组成，样品滴加在样品附着区(8)上，所述样品附着区采用亲水材质，所述样品隔离区附有疏水涂层，所述样品信息记录区上记录了样本信息，样品附着区(8)与探针附着区(4)呈一一对应，当样本附着玻片倒扣于探针附着玻片上时，样品附着区的样品与相对应的探针附着区的探针结合，进而实现杂交。
实施例1fish探针的制备
本实施例展示了cbfb基因断裂快速检测探针的制备过程，具体包括如下步骤：
(1)从ucscgenomebrowser下载cbfb基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中cbfb上游探针覆盖区域为：chr16:66885331-67101057，cbfb下游探针覆盖区域为：chr16:67122220-67337946；所获取的序列保存为fasta格式，基因组中重复序列区域替换为n；
(2)将步骤(1)获得的cbfb基因上游探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl(chunks.pl程序使用代码图见图4)分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入oligoarray软件进行探针设计、探针筛选，探针筛选的条件为：探针长度50bp，tm值85～99℃，gc比40～80％，不含tttt/gggg/aaaa/cccc，探针间最小间隔5bp；然后将筛选出的探针导出到excel表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到带有标签的一系列cbfb基因上游探针序列(图5所示为cbfb基因探针池，由于序列过多不一一展示)；标签序列的碱基序列如下：5’端标签序列为：tgtaaaacgacggccag(m13上游序列)，3’端标签序列为：ggtcatagctgtttcctg(m13下游序列)；
(3)将步骤(1)获得的cbfb基因下游探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl(chunks.pl程序使用代码图见图4)分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入oligoarray软件进行探针设计、探针筛选，探针筛选的条件为：探针长度50bp，tm值85～99℃，gc比40～80％，不含ttttt/gggg/aaaaa/cccc，探针间最小间隔5bp；然后将筛选出的探针导出到excel表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列(碱基序列同上)，得到带有标签的一系列cbfb基因下游探针序列；
(4)使用dna合成仪对步骤(2)所得带有标签序列的cbfb基因上游探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到cbfb基因上游探针库，所述cbfb基因上游探针库包含1109条带有标签序列的cbfb基因上游探针；同理，使用dna合成仪对步骤(3)所得带有标签序列的cbfb基因下游探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到cbfb基因下游探针库，所述cbfb基因下游探针库包含1238条带有标签序列的cbfb基因下游探针；
(5)分别合成5’端带有绿色荧光基团和橘红色荧光基团的m13通用引物，通用引物序列为：m13-ftgtaaaacgacggccagt，m13-rcaggaaacagctatgacc；使用5’端带有绿色荧光基团的m13通用引物对cbfb基因上游探针库进行扩增标记反应；使用5’端带有橘红的荧光基团的m13通用引物对cbfb基因下游探针库进行扩增标记反应；所述扩增标记反应的pcr反应体系如下：
所述扩增标记反应的pcr反应条件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共进行20个循环；72℃10min。
(6)使用乙醇醋酸钠法分别对步骤(5)所得cbfb基因上游探针库的扩增标记产物和cbfb基因下游探针库的扩增标记产物进行纯化，纯化后再经稀释得到：浓度为100ng/ul的荧光标记的cbfb基因上游探针库和浓度为100ng/ul的荧光标记的cbfb基因下游探针库。
实施例2即用型多探针杂交玻片的制备
本实施例发明了一种即用型多探针杂交玻片的制备方法
本实施例中所使用的探针组合分别为：pml/rara、bcr/abl、p53、d13s319、1q21、igh/bcl2、cbfb、aml/eto；每组探针分别配制探针赋形剂，涂抹在对应的探针附着区。(图7)
本实施例中所用杂交玻片按照本发明设计图委托厂商进行制做。
以下为即用型多探针杂交玻片(m-probeslide)的制备过程：
(1)按照图1～图3所示委托厂商制备探针附着玻片和样本附着玻片；
(2)在探针附着玻片的探针附着区进行探针附着；
(2.1)按照配方：左旋糖苷0.5％阿拉伯胶树3％甘露醇1％聚丙烯酸酯0.3％，使用去离子水溶解上述赋形剂组合物，4℃保存备用；
(2.2)配制各探针组合物：探针水溶液终浓度均为100ng/ul；
(2.3)吸取10ul探针组合物与90ul赋形剂组合物，混合均匀，使用移液器吸取5ul混合后的探针赋形剂组合物滴加并均匀涂抹在各探针附着区；
(2.4)将附着有探针赋形剂组合物的探针附着玻片放入冻干机中冻干，使用专用封膜封膜后备用。注意:操作过程应避光
实施例3
即用型多探针杂交玻片的使用方法，包含以下步骤：
本实施例展示了即用型多探针杂交玻片的使用方法和杂交效果。
本实施例所用的即用型多探针杂交玻片包含的探针为：pml/rara、bcr/abl、p53、d13s319、1q21、igh/bcl2、cbfb、aml/eto；
本实施例所检测的样本为卡诺氏固定液固定后的骨髓血淋巴细胞：
(1)样本处理：将固定好的外周血细胞分别滴加到样本附着玻片的对应区域，将样本附着玻片浸入盛有37℃2×ssc的容器中老化30min，老化完成后过70％，85％，100％梯度酒精脱水晾干，备用。
(2)探针样本共変性：分别向杂交玻片的探针附着区滴加2ul杂交缓冲液，并将样本附着玻片倒扣，使样本附着区与探针附着区贴合在一起，贴合后将整个杂交玻片与样本附着玻片一起反转，置于金属浴73℃变性5min，变形完成后将杂交装置置于37℃湿盒杂交1h。
(3)杂交后洗涤：待杂交完成后移去杂交玻片，将玻片置于60℃预热的洗液(含0.3m氯化钠、0.03m柠檬酸钠和0.1％tween-20)中洗涤去除未结合探针。洗涤完成后将玻片置于室温蒸馏水中再次洗涤，并室温晾干。
(4)复染及镜检：向晾干的样本附着玻片对应区域每区域滴加5ul抗淬灭封片剂，使用合适的盖玻片封片并在荧光显微镜下观察杂交结果；结果如图8所示。
从图8可以看出：本发明用于多探针杂交时具有优秀的杂交效果，具有极高的信噪比、特异性以及样本检出率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。