本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种恒温环介导试验检测志贺氏菌的引物组。
背景技术：
：志贺氏菌（shigella）是一种在世界范围内广泛流行的人畜共患病的病原菌，主要引起人和动物急性肠炎。志贺氏菌是发达国家最常见的腹泻病病原菌之一，是受到高度关注的人畜共患病病原，国际兽疫组织（oie）规定实验猴贸易必检项目。我国志贺氏菌检验当前采用的方法是传统分离培养-生化鉴定法，志贺氏菌培养过程中大量杂菌会把目的菌落覆盖，较难找出典型菌落,所以该方法检出率低，工作强度大，检出率低。随着新技术的出现，有必要开发出一套准确快速的检测方法，辅助或代替现行的志贺氏菌检测方法，以适应技术进步新要求。环介导等温扩增（lamp）技术优点是一是设备简单，只需要水浴锅温育即可，不需要复杂或贵重仪器。二是快速高效，核酸扩增在l小时内即可完成。三是特异性高，要求4种特异性引物，引物不匹配不能进行核酸扩增。四是高灵敏度，荧光pcr的灵敏度相当，比pcr高10～100倍。五是成本低廉，特别适合现场检疫和基层单位如防疫站检疫或养殖场检疫。lamp技术的核心要素是引物，引物的优劣决定着各种形式lamp试验性能，lamp引物共有内引物对和外引物对4条，设计要求较高，要求引物组对靶dna扩增性能好，对志贺氏菌特异性反应，还要求4条引物之间或自身不能发生退火情况发生，否则容易产生假阳性。但扩增效率高、特异性强、无假阳性lamp引物的设计成功率不高，需要从大量的引物中去测试，最后选择出符合要求的引物组。所以志贺氏菌lamp引物组是经过实践检验的科研成果，对志贺氏菌检验有较高的应用价值。技术实现要素：本发明要解决的技术问题在于克服现有lamp技术引物设计中存在的引物通用性和特异性不足的缺陷，充分利用目前公共数据资源中丰富的微生物基因组序列信息以及相应的序列分析工具，设计用于特异性识别志贺氏菌的引物组，并在此基础上形成高灵敏度、高特异性检测试剂盒。本发明基于genbank数据库中的微生物基因组数据资源（截至2013年8月5日数据）进行志贺氏菌lamp引物的设计，提供了一种快速恒温扩增检测志贺氏菌的方法、引物组及试剂盒。本发明的一个目的在于提供2组引物，各含1对上下游内引物和1对上下游外引物，引物dna序列信息如下：引物组a：上游外引物f3_a：5’-gaagagcatgccaacacct-3’(seqidno：1)；下游外引物b3_a：5’-tcctcacagctctcagtgg-3’(seqidno：2)；上游内引物fip_a：5’-cggaatccggaggtattgcgt-tttccgcgttccttgacc-3’(seqidno：3)；下游内引物bip_a：5’-cgctgcatggctggaaaaactc-gcagcaacagcgaaagact-3’(seqidno：4)；引物组b：上游外引物f3_b：5’-ggtcatttgctgtcactcc-3’(seqidno：5)；下游外引物b3_b：5’-ctgggcagggaaatgttc-3’(seqidno：6)；上游内引物fip_b：5’-gctcgcagagaaacttcagct-cgacacgccatagaaacg-3’(seqidno：7)；下游内引物bip_b：5’-tggtctggaaggccaggtag-cattgcccgggataaagtc-3’(seqidno：8)。本发明的另一个目的在于，提供一种检测志贺氏菌的试剂盒，包括能检测志贺氏菌的基因组特异碱基序列的环介导恒温扩增试验引物组，还包括bstdna聚合酶缓冲液、bstdna聚合酶、dntps、mgso4和betaine；本发明的另一个目的在于，提供了一种志贺氏菌的方法，包括以下步骤：（1）提取待测菌的基因组dna；（2）以提取的基因组dna为模板，使用本发明的引物组进行环介导恒温扩增；（3）对扩增产物进行检测，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在志贺氏菌；其中，所述lamp扩增的反应程序为：（1）90~98℃热水浴0.5~3min；（2）50℃水浴反应0.5~3min;（3）63℃水浴反应0.5~2h；（4）80℃水浴终止反应1~8min；进一步的，所述lamp扩增反应体系中mgso4的终浓度为2.5~5mm/l，dntps的终浓度为1mm~4mm/l，f3和b3引物的终浓度为0.05μm/l~0.5μm/l，fip和bip引物的终浓度为0.5~1μm/l，bstdna聚合酶的终浓度为0.2~2u/μl，betaine的终浓度为0.5~3m/l；进一步的，所述lamp扩增反应体系中mgso4的终浓度为3.2mm/l，dntps的终浓度为1.4mm/l，f3和b3引物的终浓度为0.08μm/l，fip和bip引物的终浓度为0.64μm/l，bstdna聚合酶的终浓度为0.32u/μl，betaine的终浓度为0.8m/l。本发明快速检测志贺氏菌的方法包括但不限于，电泳检测、浊度检测或显色检测等。所述电泳检测优选为凝胶电泳检测法，电泳检测结果中，如电泳图呈特征性梯状条带，则待测样品呈志贺氏菌阳性，含有志贺氏菌；如电泳图不呈特征性梯状条带，则待测样品呈志贺氏菌阴性。所述浊度检测，是肉眼观察或浊度仪检测浊度，检测管出现明显浑浊，则待测样品呈志贺氏菌阳性，含有志贺氏菌；如未见浑浊，则待测样品为志贺氏菌阴性。也可以经离心后肉眼观察反应管底是否有沉淀，若反应管底有沉淀，则待测样品呈志贺氏菌阳性，含有志贺氏菌；如反应管底没有沉淀，则待测样品呈志贺氏菌阴性。所述显色检测，是在反应管中加入显色剂，包括但不限定羟基萘酚兰，反应后颜色为蓝紫色，则待测样品为志贺氏菌阴性；如反应颜色为蓝绿色，则待测样品为志贺氏菌阳性。本发明的有益效果为：本发明为食品安全检测技术、疾病诊断、动物检疫等领域提供了一种简单快速灵敏的检测志贺氏菌的引物组，具有较大意义。本发明引物组可应用于各种形式的环介导恒温扩增检测志贺氏菌dna试验，引物组具有灵敏度高、特异性强等优点，可获得103cfu/ml（相当于6cfu/反应）的敏感度，引物组仅对志贺氏菌dna反应，对常见肠道细菌无反应。操作简便、可重复性强，具有很好的实用性等优点。采用本发明的引物组检测志贺氏菌，具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。附图说明图1、引物组a、b扩增产物酶切物电泳图，泳道1是dna分子量标准，泳道2、3分别是引物组a、b扩增产物酶切物，泳道4是空白对照。图2、引物组a扩增产物酶切基因片段基因测序图。图3、引物组b扩增产物酶切基因片段基因测序图。图4、lamp扩增目的基因的琼脂糖凝胶电泳图，泳道m是dna分子量标准、泳道1~7是志贺氏菌的浓度梯度稀释液，其浓度分别为107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml、101cfu/ml、泳道n为阴性对照；图5、lamp反应产物沉淀图，从左到右管中志贺氏菌浓度分别为107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml、10cfu/ml、管8为阴性对照；图6、lamp扩增产物显色图，从左到右管中志贺氏菌浓度分别为107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml、10cfu/ml、管8为阴性对照；图7、pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，泳道m是dna分子标准、1～7志贺氏菌浓度分别为107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml、泳道n为阴性对照；图8、荧光定量pcr扩增曲线图，1~5曲线分别是107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml，最低检出限是103cfu/ml；图9、lamp产物显色图，从左到右管中志贺氏菌浓度分别为107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml、10cfu/ml、阴性对照；图10、1~24管分别为痢疾志贺菌，福氏志贺菌，鲍氏志贺菌，宋内氏志贺菌，伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌，大肠艾希氏菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌，空肠弯曲杆菌，溶血性链球菌，粪链球菌，李斯特氏菌，粪肠球菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，铜绿假单胞菌，产气夹膜梭菌，阪崎肠杆菌，奇异变形杆菌,腊样芽胞杆菌，绿脓杆菌，副溶血性弧菌，肺炎克雷伯氏菌，ntc：阴性对照。具体实施方式结合以下具体实施例和附图。对本发明进一步详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。应当指出的是，对本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施本发明的过程、条件、试剂、试验方法等，除以下专门提及的内容外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。实施例1引物组扩增产物电泳和序列测定根据引物扩增的序列，选取alui/asci内酶切位点，对扩增产物进行酶切，琼脂糖凝胶电泳目标回收目标dna，送生物技术公司测序，验证扩增是否特异。酶切体系如下，各10μl体系alui酶0.5μlasci酶0.5μl10×mbuffer1.0μllamp扩增产物5.0ulddh2o3.0μl37℃酶切6h，2%琼脂糖凝胶电泳,电压4v/cm，约1小时后溴酚兰指示剂接近胶边缘时停止电泳，取出胶片在凝胶成像系统中观察并拍照记录。将目标dna条带回收，送生物公司测定基因序列。脂糖凝胶电泳结果见图1。测序结果见图2和图3。结果表明基因长度与酶切长度相符，酶切物序列与基因库志贺氏菌ipah基因（lc111516.1）符合率是100%。以上结果表明，所设计的引物组能准确地扩增志贺氏菌基因。实施例2：本实施例用来说明本发明引物组对不同形式lamp和4个志贺菌群检测的通用性，所述不同形式lamp检测包括电泳法lamp、沉淀法lamp和显色法lamp，所述的4个志贺菌群是痢疾志贺菌，福氏志贺菌，鲍氏志贺菌，宋内氏志贺菌，其步骤如下：（1）志贺氏菌浓度配制用于检测的志贺氏菌来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心的痢疾志贺氏菌，编号为atcc51252。将36℃培养过夜的志贺氏菌纯培养物12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用0.9%生理盐水洗涤离心1次，沉淀物用ddh2o重悬，用麦氏浊度法标定细菌浓度，即1mcf≈3×108cfu/ml。分别稀释成106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml、101cfu/ml、100cfu/ml细菌浓度梯度。（2）基因组dna的提取取各浓度梯度志贺氏菌液隔水煮沸15min，12000rpm离心10min，取上清即为细菌dna，冷冻备用。（3）以提取的各浓度的志贺氏菌基因组dna为模板，采用本发明的试剂盒，并按表1中所述条件配制反应体系，取7个反应管，向反应管中分别加入除bst酶和矿物油外的试剂，以ddh2o为阴性对照；混匀后将反应管置于95℃热水浴1min，立即转入50℃水浴反应1min。打开反应管，加入bst酶，混匀，再加入100μl矿物油覆盖液面，盖好管盖。移至63℃水浴反应1.5h，反应完毕移至80℃水浴，2min后终止反应。（4）通过电泳检测、浊度检测和显色检测，进行扩增结果确认。所述电泳检测是指取用4μl扩增产物，用2.5%的琼脂糖凝胶进行检测，检测结果见表2和图4，浊度法lamp用目测沉淀检测结果（图5），显色法lamp根据由着色变化来检测结果（图6）。表明本发明的引物组及反应体系能够很好的对志贺氏菌特异性片段进行扩增并适用于多种检测方法。表1快速检测志贺氏菌的lamp的试剂盒及其主要成分试剂体积终浓度bstdna聚合酶缓冲液（10×）2.5μl1×bstdna聚合酶（8u/μl）1μl0.32u/μldntps（10mm）3.5μl1.4mm/lmgso40.8μl3.2mm/lbetaine（5m）4μl0.8m/lf3（20μm）0.1μl0.08μm/lb3（20μm）0.1μl0.08μm/lfip（20μm）0.8μl0.64μm/lbip（20μm）0.8μl0.64μm/ltotaldna2μlddh2o9.4μl矿物油100ul表2实施例1中本发明引物组对不同形式lamp检测的通用性检测结果引物组电泳法lamp沉淀法lamp显色法lamp引物组a阳性电泳图呈现特征性阶梯条带，最低能检测103cfu/ml，阴性对照无扩增条带。阳性管反应液变混浊，离心后有沉淀，最低能检103cfu/ml。阴性对照未见沉淀。阳性管显示蓝绿色，最低能检测103cfu/ml。阴性对照仍为蓝紫色。引物组b结果同上结果同上结果同上注：所述电泳法lamp是指通过琼脂糖凝胶电泳来检测扩增产物，阳性结果电泳图呈现特征性阶梯条带，阴性对照无扩增条带。所述沉淀法lamp用目测浊度观察检测结果，阳性管反应液变混浊，离心后有沉淀，阴性对照未见沉淀。所述显色法lamp用目测着色变化来观察检测结果，其反应体系在表1的基础上加入羟基萘酚兰，终浓度为120μm。实施例3-6志贺氏菌反应体系和检测方法志贺氏菌的浓度梯度稀释及基因组dna的提取步骤如实施例2中的步骤（1）、（2），反应体系见表3，其中，实施例3和4的引物采用引物组a，实施例5和6的引物采用引物组b，并通过浊度检测进行扩增结果确认。由表3可以看出，本发明引物组、检测方法及反应体系能够很好的对志贺氏菌特异性片段进行扩增并得到检测结果。表3实施例2~5各反应体系、反应条件及反应结果实施例7：本实施例用来比较本发明引物组环介导恒温试验与pcr和荧光pcr的灵敏度志贺氏菌的稀释方法、dna提取方法及反应体系同实施例1，将各稀释度的志贺氏菌dna分别加入pcr和荧光pcr和显色lamp反应体系，显色lamp应用引物组a，反应体系和反应条件参照实施例1方法进行。所述pcr反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环。反应体系如下：pcr预混液12.5ul，上、下游引物各1ul，dna模板2ul，补去离子水至25ul。所述上游引物序列为：（5‘-tgttcagtctcacgcatcacc-3’）（seqidno：9）；所述下游引物序列为：（5‘-gctggcagaagagcagaaatatg-3’）（seqidno：10）；pcr扩增序列如下：（5‘-gctggcagaagagcagaaatatgagatgctggagaatgagtaccctcagagggtggctgaccggctgaaagcatcaggtctgagcggtgatgcggatgcggagagggaagccggtgcacaggtgatgcgtgagactgaaca-3’）（seqidno：11）所述荧光定量pcr反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火、延伸34s，共40个循环。所述反应体系如下：荧光定量pcr预混液10μl，20μm/l的上游引物p1、下游引物p2各1μl，taqman探针1μl，模板dna2μl，ddh2o5μl。所述上游引物p1序列为：（5‘-agcgaaagactgctgtcgaag-3’）（seqidno：12）；所述下游引物p2序列为：（5‘-cttgaccgcctttccgata-3’）（seqidno：13）；所述探针序列为：（5‘-aacaggtcgctgcatggctggaa-3’）（seqidno：14）。荧光pcr扩增序列如下：5agcgaaagactgctgtcgaagctccgcagaggcactgagtttttccagccatgcagcgacctgttcacggaatccggaggtattgcgtgcagagacggtatcggaaaggcggtcaag-3’（seqidno：15）pcr检测结果如图7所示，荧光定量pcr检测结果如图8所示，pcr扩增的灵敏度是104cfu/ml（相当于60菌/反应），显色lamp结果见图9，荧光定量pcr和显色lamp的灵敏度都是103cfu/ml（相当于6菌/反应），显色lamp与荧光定量pcr灵敏度相当，比pcr高10倍。实施例8：本实施例用来说明志贺氏菌引物组环介导恒温试验的特异性。收集试验方法：收集痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌和其它肠道常见菌19株，将这些菌株与志贺氏菌菌株分别进行培养，参照实施1方法进行细菌浓度配制和提取细菌dna，并参照实施例2的反应体系和条件，选用引物组a进行显色lamp扩增。检测结果见图10，结果显示仅有志贺氏菌菌株扩增反应后的产物呈现为蓝绿色，为阳性结果。而其他非志贺氏菌菌株及阴性对照扩增反应后的产物均呈现为蓝紫色，为阴性结果。本发明引物组具有良好的志贺氏菌菌株特异性，即只有志贺氏菌菌株扩增阳性，其他非志贺氏菌菌株为阴性。表5本发明引物组的特异性试验所用菌株及检测结果菌株编号拉丁名称中文名称扩增结果1shigelladysenteriae痢疾志贺菌+2shigellaflexneri福氏志贺菌+3shigellabogdii鲍氏志贺菌+4shigellasonnei宋内氏志贺菌+5salmonellatyphi伤寒沙门氏菌-6salmonellaenteritidis肠炎沙门氏菌-7escherichoiacoliepeco26:k60大肠艾希氏菌-8yersiniaenterocolitica小肠结肠炎耶尔森氏菌-9campylobacterjejuni空肠弯曲杆菌-10streptococcushemolytic溶血性链球菌-11粪链球菌-12listeriamonocytogenes李斯特氏菌-13enterococcusfaecalis粪肠球菌-14staphylococcusaureus金黄色葡萄球菌-15staphylococcusepidermidis表皮葡萄球菌-16pseudomonasaeruginosa铜绿假单胞菌-17clostridiumperfringens产气夹膜梭菌-18cronobactersakazakii阪崎肠杆菌-19proteusmirabilis奇异变形杆菌-20bacilluscercus腊样芽胞杆菌-21pseudomonasaeruginosa绿脓杆菌-22vibrioparahaemolyticus副溶血性弧菌-23klebsiellapeneumoniae肺炎克雷伯氏菌-24ntc阴性对照-2、“+”为阳性结果，“-”为阴性结果。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。序列表<110>温和心<120>检测志贺氏氏菌环介导恒温扩增试验引物组及其应用<160>15<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gaagagcatgccaacacct19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tcctcacagctctcagtgg19<210>3<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cggaatccggaggtattgcgttttccgcgttccttgacc39<210>4<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgctgcatggctggaaaaactcgcagcaacagcgaaagact41<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ggtcatttgctgtcactcc19<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ctgggcagggaaatgttc18<210>7<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gctcgcagagaaacttcagctcgacacgccatagaaacg39<210>8<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tggtctggaaggccaggtagcattgcccgggataaagtc39<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tgttcagtctcacgcatcacc21<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gctggcagaagagcagaaatatg23<210>11<211>141<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gctggcagaagagcagaaatatgagatgctggagaatgagtaccctcagagggtggctga60ccggctgaaagcatcaggtctgagcggtgatgcggatgcggagagggaagccggtgcaca120ggtgatgcgtgagactgaaca141<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12agcgaaagactgctgtcgaag21<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13cttgaccgcctttccgata19<210>14<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14aacaggtcgctgcatggctggaa23<210>15<211>117<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15agcgaaagactgctgtcgaagctccgcagaggcactgagtttttccagccatgcagcgac60ctgttcacggaatccggaggtattgcgtgcagagacggtatcggaaaggcggtcaag117当前第1页12