本申请是申请人于2012年12月19日提交的题为“表达载体组织、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途”的中国专利申请201280062794.3的分案申请。本文报道新的表达载体组织，用于产生生产细胞系的新方法，如新的转染或选择方法，以及这些表达载体和生产细胞系在重组产生目的多肽中的用途。
背景技术：
：基因的转录水平可以对其表达水平具有强烈影响，并因此决定了细胞的生产力。它主要受三种载体元件影响：启动子、polya信号序列和(如果存在)转录终止子。编码抗体重链的核酸通常包含在蛋白质成熟时去除的前导序列(信号序列)(约57bp/19aa)、可变区vh(约350bp/115aa)和恒定区ch(约990bp/330aa)。编码抗体轻链的核酸通常由在蛋白质成熟时去除的前导序列(约66bp/22aa)、可变区vk或vl(约350bp/115aa)和恒定区ck或cl(约321bp/107aa)组成。在真核细胞中重组产生抗体涉及产生表达系统(见mccafferty,j.等,(编辑),antibodyengineering,apracticalapproach,irlpress(1997))。为了发展抗体表达系统，产生包含轻链编码核酸的表达盒，该轻链编码核酸侧翼是启动子和多腺苷酸化(polya)区。同样，产生包含重链编码核酸的重链表达盒，该重链编码核酸侧翼是启动子和polya区。可以在包含重链和轻链表达盒二者的单个载体中将重链表达盒组合入轻链表达盒，或者可以整合入两个分开的载体。us7,053,202中报道了免疫球蛋白dna盒分子、单体(monobody)构建体、产生方法及其使用方法。在us5,168,062中，报道了含有人巨细胞病毒立即早期启动子调节dna序列的转移载体和微生物。us5,225,348中报道了含有人多肽链延伸因子-1α的启动子区的dna片段、其碱基序列及含有高度适用于具有高表达能力的广范围宿主细胞的dna片段的表达质粒。在us5,266,491中，报道了含有sv40复制起点及具有人多肽链延伸因子-1α基因的启动子区的dna片段的表达质粒。us5,122,458中报道了重组dna化合物和诸如tpa的多肽的表达。在us7,422,874中，报道了用于动物细胞的表达载体。kim,d.等报道了通过操作转录终止区改进的哺乳动物细胞表达系统(biotechnol.prog.19(2003)1620-1622)。chappell,s.a.等(proc.natl.acad.sci.usa97(2000)1536-1541报道了细胞mrna的9-nt区段可以作为内部核糖体进入位点(ires)发挥作用，且在存在于连接的多拷贝中时极大地增强ires活性。corish,p.和tyler-smith,c.报道了减弱绿色荧光蛋白在哺乳动物细胞中的半衰期(prot.eng.12(1999)1035-1040)。primig,m.等(gene215(1998)181-189)报道了设计用于在转染的哺乳动物细胞中分离和分析增强子元件的新的gfpneo载体。ng,s.k.等报道了将不稳定序列应用于选择标记来改进cho-dg44细胞中的重组蛋白质生产力(metabol.eng.9(2007)304-316)。sannapietro,p.报道了抗体fab片段和全免疫球蛋白在哺乳动物细胞中的表达(meth.mol.biol.178(2002)389-395)。higuchi,k.等(j.immunol.meth.202(1997)193-204)报道了用于抗乙型肝炎表面抗原的人抗体的可变区的基因克隆的细胞展示文库。kim,d.报道了通过操作转录终止区改进的哺乳动物表达系统(biotechnol.progress19(2003)1620-1622)。costa,r.a.等(eur.j.pharmaceut.biopharmaceut.74(2010)127-138)报道了用于单克隆抗体产生的细胞工程的指导。kim,d.w.等报道了用人延伸因子1α启动子作为通用和有效的表达系统(gene91(1990)217-223)。buchman,a.r.等(mol.cell.biol.8(1988)4395-4405)报道了依赖内含子和不依赖内含子的基因表达的比较。wang,f.等报道了哺乳动物细胞中的抗体表达(在therapeuticmonoclonalantibodies–frombenchtoclinic,wiley(2009)557-572页中)。li等(j.immunol.meth.318(2007)113-124)报道了用于重组igg抗体的哺乳动物表达的不同载体设计的比较性研究。ho,s.c.l.等报道了用于增强高单克隆抗体表达cho细胞系的产生的ires介导的三顺反子载体(j.biotechnol.157(2011)130-139)。hotta,a.等(j.biosci.bioeng.98(2004)298-303)报道了通过重组动物细胞产生抗-cd2嵌合抗体。lee,j-c.等报道了肠道病毒71内部内糖体进入位点介导的高效蛋白质表达(biotechnol.bioeng.90(2005)656-662)。在wo2008/142124中，报道了avian细胞中的重组蛋白质产生。发明概述已发现，对于抗体的重组产生，与相反的顺序(lc-hc(5’-3’))相比，重链表达盒放置在轻链表达盒前面(hc-lc(5’-3’))提供更好的表达结果。此外，已发现，与第一抗体链前面的双向位置(sm(3’-5’)-hc-lc(5’-3’))相比，选择标记放置在两个抗体链表达盒后面提供更好的表达结果(hc-lc-sm(5’-3’))。已发现，对于稳定转染，1)抗体重链、2)抗体轻链和3)选择标记的成行排列是最佳的。虽然hef1α启动子在稳定库中明显优于hcmv启动子，但我们已看见对单克隆水平的明显相反的作用。在此，人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子(hcmv)产生了具有最高的生产力克隆。此外，其性能可以进一步通过将它与bghpolya信号和人胃泌素基因(hgt)的终止子序列组合来改善，其提高生产力和表达稳定性二者。已发现，如果1)启动子是人巨细胞病毒启动子(hcmv)，polya信号序列是牛生长激素polya信号序列(bghpolya)，且终止子序列是人胃泌素基因转录终止子序列(hgt)，或2)启动子是人延伸因子1α启动子(ef1α)，polya信号序列是牛生长激素polya信号序列(bghpolya)，且终止子序列缺乏，则包含各含有启动子、结构基因和polya信号序列及可选的终止子序列的抗体重链表达盒和抗体轻链表达盒的表达载体的使用导致转染后更高数目的产生/分泌抗体的细胞克隆。通过使用上述表达载体，可以在转染后获得更高数目的产生/分泌抗体的细胞，从而减少了鉴定适合用于大规模重组抗体产生的高产细胞所需的努力。本文报道的一个方面是表达载体，其包含：-抗体轻链表达盒，-抗体重链表达盒，和-选择标记表达盒，其中该表达盒单向排列，和其中该表达盒按抗体重链表达盒、抗体轻链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列。在一个实施方案中，该抗体轻链表达盒和/或该抗体重链表达盒和/或该选择标记表达盒相互独立地包含选自人延伸因子1α启动子、人cmv启动子和sv40启动子的启动子。在一个实施方案中，一个、两个或全部三个表达盒包含人延伸因子1α启动子。在一个实施方案中，该抗体轻链表达盒和/或该抗体重链表达盒和/或该选择标记盒相互独立地包含人延伸因子1α启动子。在一个实施方案中，该表达盒不包含终止子序列，即该表达盒不含终止子序列。在一个实施方案中，该终止子序列是人胃泌素基因转录终止子序列(hgt)。在一个实施方案中，一个、两个或全部三个表达盒包含人cmv启动子。在一个实施方案中，该抗体轻链表达盒和/或该抗体重链表达盒和/或该选择标记盒相互独立地包含人cmv启动子。在一个实施方案中，一个、两个或全部三个表达盒包含牛生长激素polya信号序列。在一个实施方案中，该抗体轻链表达盒和/或该抗体重链表达盒和/或该选择标记盒相互独立地包含牛生长激素polya信号序列。在一个实施方案中，该抗体轻链表达盒和/或该抗体重链表达盒和/或该选择标记盒相互独立地包含选自牛生长激素polya信号序列和sv40polya信号序列的polya信号序列。在一个实施方案中，一个、两个或全部三个表达盒在该polya信号序列后面包含人胃泌素终止子序列，条件是该表达盒不包含人延伸因子1α启动子。在一个实施方案中，该抗体轻链表达盒和/或该抗体重链表达盒和/或该选择标记盒相互独立地在该polya信号序列后面包含人胃泌素终止子序列。在一个实施方案中，该抗体轻链表达盒和/或该抗体重链表达盒和/或该选择标记盒相互独立地按5’至3’方向包含牛生长激素polya信号序列和人胃泌素终止子序列，条件是该表达盒不包含人延伸因子1α启动子。在一个实施方案中，一个、两个或全部三个表达盒的启动子包含内含子a。在一个实施方案中，一个、两个或全部三个表达盒包含sv40polya信号序列。在一个实施方案中，一个、两个或全部三个表达盒包含sv40启动子。在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cdna。本文报道的一个方面是本文报道的表达载体在重组产生抗体中的用途。本文报道的一个方面是本文报道的表达载体在产生稳定细胞系中的用途。本文报道的一个方面是本文报道的表达载体在产生生产细胞系中的用途。本文报道的一个方面是本文报道的表达载体在产生稳定细胞系中的用途，所述表达载体包含至少一个含有人延伸因子1α启动子的表达盒。本文报道的一个方面是本文报道的表达载体在产生生产细胞系中的用途，所述表达载体包含至少一个含有人延伸因子1α启动子的表达盒。本文报道的一个方面是本文报道的表达载体在重组产生抗体中的用途，所述表达载体包含至少一个含有人延伸因子1α启动子的表达盒。本文报道的一个方面是本文报道的表达载体在产生生产细胞系中的用途，所述表达载体包含至少一个含有人cmv启动子的表达盒。本文报道的一个方面是本文报道的表达载体在产生稳定细胞系中的用途，所述表达载体包含至少一个含有人cmv启动子的表达盒。本文报道的一个方面是本文报道的表达载体在产生抗体中的用途，所述表达载体包含至少一个含有人cmv启动子的表达盒。本文报道的一个方面是用表达载体转染真核细胞的方法，其特征在于转染之前，通过在原核复制起点中切割来线性化表达载体。在一个实施方案中，原核复制起点在一个抗体轻链表达盒和一个抗体重链表达盒之间。本文报道的一个方面是本文报道的方法在产生用于重组生产抗体的真核细胞中的用途。本文报道的一个方面是选择包含抗体编码核酸的真核细胞的方法，其特征在于在第一次转染约24小时后向培养基中加入选择剂。本文报道的一个方面是本文报道的方法在产生用于重组生产抗体的真核细胞中的用途。本文报道的一个方面是本文报道的方法选择的细胞在产生用于重组生产抗体中的用途。本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：-培养包含本文报道的表达质粒的真核细胞，和-从该真核细胞或培养基回收该抗体。本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：-培养真核细胞，所述真核细胞通过用表达载体转染获得，所述表达载体在转染之前，通过在原核复制起点中切割已线性化，和-从该真核细胞或培养基回收该抗体。本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：-培养真核细胞，所述真核细胞通过在转染约24小时后向培养基中加入选择剂选择出来，和-从该真核细胞或培养基回收该抗体。本文报道的一个方面是用表达载体转染真核细胞的方法，所述真核细胞具有包含原核核酸序列和真核核酸序列的表达载体，其特征在于在用表达载体转染真核细胞之前，从该表达载体除去所述原核核酸序列。本文报道的一个方面是不包含原核核酸序列的线性化表达载体转染真核细胞的用途。本文报道的一个方面是仅包含真核核酸序列的线性化表达载体在产生用于重组生产抗体的真核细胞中的用途。在本文报道的所有方面的一个实施方案中，该抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，该双特异性抗体具有特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位的第一结合特异性或结合部位，且该双特异性抗体具有特异性结合第二抗原或抗原上的第二表位的第二结合特异性或结合部位。在一个实施方案中，该表达载体包含：-按5’至3’方向包含启动子、编码第一抗体轻链的核酸、polya信号序列和可选的终止子序列的第一表达盒，-按5’至3’方向包含启动子、编码第二抗体轻链的核酸、polya信号序列和可选的终止子序列的第二表达盒，-按5’至3’方向包含启动子、编码第一抗体重链的核酸、polya信号序列和可选的终止子序列的第三表达盒，-按5’至3’方向包含启动子、编码第二抗体重链的核酸、polya信号序列和可选的终止子序列的第四表达盒，或-按5’至3’方向包含启动子、编码抗体轻链的核酸、polya信号序列和可选的终止子序列的第一表达盒，-按5’至3’方向包含启动子、编码第一抗体重链的核酸、polya信号序列和可选的终止子序列的第二表达盒，和-按5’至3’方向包含启动子、编码第二抗体重链的核酸、polya信号序列和可选的终止子序列的第三表达盒，由此该抗体轻链是两条抗体重链的共同轻链。在本文报道的所有方面的一个实施方案中，该表达载体包含：-抗体轻链表达盒，-第一抗体重链表达盒，-第二抗体重链表达盒，和-选择标记表达盒，其中该抗体重链表达盒的至少一个、该抗体轻链表达盒和该选择标记表达盒单向排列，且其中该单向表达盒按抗体重链表达盒、抗体轻链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列。在本文报道的所有方面的一个实施方案中，该表达载体包含：-第一抗体轻链表达盒，-第二抗体轻链表达盒，-第一抗体重链表达盒，-第二抗体重链表达盒，和-选择标记表达盒，其中该抗体重链表达盒之一、该抗体轻链表达盒之一和该选择标记表达盒单向排列，且其中该单向表达盒按抗体重链表达盒、抗体轻链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列。在一个实施方案中，该抗体重链表达盒之一编码包含臼突变的抗体重链。在一个实施方案中，该抗体重链表达盒之一编码包含杵突变的抗体重链。在一个实施方案中，该抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体重链ch1结构域的抗体轻链，和/或该抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体轻链cl结构域的抗体轻链。在一个实施方案中，该抗体重链表达盒之一编码包含抗体轻链恒定结构域(cl)作为第一恒定结构域的抗体重链，和/或该抗体重链表达盒之一编码包含抗体重链ch1结构域作为第一恒定结构域的抗体重链。在一个实施方案中，hcmv启动子具有序列seqidno:01。该hcmv启动子不含内含子a和5’utr。在一个实施方案中，hcmv启动子具有序列seqidno:02。该hcmv启动子不含内含子a和5’utr。在一个实施方案中，hcmv启动子具有序列seqidno:03。该全长hcmv启动子含有内含子a。在一个实施方案中，人延生因子1α具有序列seqidno:04。该hef1α启动子不含内含子a。在一个实施方案中，人延生因子1α具有序列seqidno:05。该hef1α启动子含有内含子a。在一个实施方案中，人延生因子1α具有序列seqidno:06.该短hef1α启动子含有内含子a和5’utr。在一个实施方案中，大鼠cmv启动子具有序列seqidno:07。在一个实施方案中，sv40polya信号序列具有序列seqidno:08。在一个实施方案中，牛生长激素polya信号序列具有序列seqidno:09。在一个实施方案中，人胃泌素转录终止子具有序列seqidno:10。在一个实施方案中，sv40启动子具有序列seqidno:11。在一个实施方案中，鸟氨酸脱羧酶的pest序列由序列seqidno:12编码。在一个实施方案中，gf序列由序列seqidno:13编码。在一个实施方案中，新霉素选择标记具有序列seqidno:14。在一个实施方案中，gfp-pest-neo融合多肽由序列seqidno:15编码。在一个实施方案中，emcv-ires具有序列seqidno:16。在一个实施方案中，ev71-ires具有序列seqidno:17。发明详述i.一般方面如本领域技术人员已知，重组dna技术的使用使得能够产生核酸和/或多肽的许多衍生物。这类衍生物可以例如通过取代、改变、交换、缺失或插入来在单个或几个位置中修饰。该修饰或衍生化可以例如借助位点定向诱变来进行。本领域技术人员可以容易地进行这类修饰(见例如sambrook,j.等,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,newyork,usa(1999))。重组技术的使用使得本领域技术人员能够用一种或多种异源核酸转化多种宿主细胞。虽然不同细胞的转录和翻译(即表达)机器使用相同的元件，但除了别的之外，隶属于不同物种的细胞可以具有不同的所谓密码子选择。由此相同的多肽(就氨基酸序列而言)可以由一种或多种不同的核酸编码。另外，由于遗传密码的简并性，不同的核酸可以编码相同的多肽。重组dna技术的使用使得能够产生核酸和/或多肽的许多衍生物。这类衍生物可以例如通过取代、改变、交换、缺失或插入来在单个或几个位置中修饰。该修饰或衍生化可以例如借助位点定向诱变来进行。本领域技术人员可以容易地进行这类修饰(见例如sambrook,j.等,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,newyork,usa(1999)；hames,b.d.和higgins,s.j.,nucleicacidhybridization–apracticalapproach,irlpress,oxford,england(1985))。重组技术的使用使得能够用一种或多种异源核酸转化多种宿主细胞。虽然不同细胞的转录和翻译(即表达)机器使用相同的元件，但除了别的之外，隶属于不同物种的细胞可以具有不同的所谓密码子选择。由此相同的多肽(就氨基酸序列而言)可以由一种或多种不同的核酸编码。另外，由于遗传密码的简并性，不同的核酸可以编码相同的多肽。定义“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(hvr)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这类改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示希望的抗原结合活性。“抗体片段”指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的部分，该部分结合该完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab'、fab’-sh、f(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；及从抗体片段形成的多特异性抗体。术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中部分重链和/或轻链衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种。抗体的“种类”指它的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要种类的抗体：iga、igd、ige、igg和igm，这些中的几种可以进一步划分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。本文所用的术语“表达”指发生在细胞内的转录和/或翻译过程。可以根据存在于细胞中的相应mrna的量来测定目的核酸序列在该细胞中的转录水平。例如，从目的序列转录的mrna可以通过rt-pcr或通过northern杂交来定量(见sambrook等,1999,上文)。目的核酸编码的多肽可以通过多种方法来定量，例如通过elisa，通过测定该多肽的生物学活性，或通过利用独立于这种活性的测定，如使用识别并结合该多肽的免疫球蛋白的western印迹或放射免疫测定(见sambrook等,1999,上文)。“表达盒”指包含在细胞中表达至少所含的核酸所必需的诸如启动子和聚腺苷酸化位点的调节元件的构建体。“表达载体”是提供在宿主细胞中表达所包含的一个或多个结构基因所需的全部元件的核酸。通常，表达质粒包含：例如用于大肠杆菌(e.coli)的原核质粒繁殖单位，其包含复制起点和选择标记；真核选择标记；及用于表达一个或多个目的结构基因的一个或多个表达盒，其各包含启动子、结构基因和包括聚腺苷酸化信号的转录终止子。通常将基因表达置于启动子的控制下，并将这种结构基因称为与该启动子“有效连接”。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则该调节元件和该核心启动子有效连接。本文的术语“fc区”用来定义免疫球蛋白重链的c端区域，其包含至少部分恒定区。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。在一个实施方案中，人igg重链fc区从cys226或从pro230延伸至重链的羧基端。但是，fc区的c端赖氨酸(lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号按照kabat,e.a.等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991),nihpublication91-3242中所述的eu编号系统，也称为eu指数。“fc区”是众所周知的术语，根据抗体重链的木瓜蛋白酶切割定义。在一个实施方案中，本文报道的复合物可以包含人fc区或衍生自人来源的fc区作为抗体重链铰链区多肽。在另一实施方案中，该fc区是igg4亚类的人抗体的fc区，或igg1、igg2或igg3亚类的人抗体的fc区，其以这样的方式修饰，使得没有fcγ受体(例如fcγriiia)结合和/或没有c1q结合可被检测到。在一个实施方案中，该fc区是人fc区，且尤其是来自人igg4亚类或来自人igg1亚类的突变fc区。在一个实施方案中，该fc区来自具有突变l234a和l235a的人igg1亚类。igg4显示减少的fcγ受体(fcγriiia)结合，但其他igg亚类的抗体显示强结合。但是，pro238、asp265、asp270、asn297(fc糖类的丧失)、pro329、leu234、leu235、gly236、gly237、ile253、ser254、lys288、thr307、gln311、asn434或/和his435是在改变时也提供减少的fcγ受体结合的残基(shields,r.l.等,j.biol.chem.276(2001)6591-6604；lund,j.等,fasebj.9(1995)115-119；morgan,a.等,immunology86(1995)319-324；ep0307434)。在一个实施方案中，本文报道的一个方面中待表达的抗体是关于igg4亚类或igg1或igg2亚类的fcγ受体结合，在l234、l235和/或d265中具有突变，和/或包含pva236突变。在一个实施方案中，该突变是s228p、l234a、l235a、l235e和/或pva236(pva236表示用pva取代igg1的从氨基酸位置233至236的氨基酸序列ellg(以单字母氨基酸密码给出)或igg4的eflg)。在一个实施方案中，该突变是igg4的s228p及igg1的l234a和l235a。抗体的fc区直接涉及adcc(依赖抗体的细胞毒性)和cdc(依赖补体的细胞毒性)。不结合fcγ受体和/或补体因子c1q的复合物不引出抗体依赖性细胞毒作用(adcc)和/或依赖补体的细胞毒性(cdc)。杵修饰表示抗体ch3结构域中的突变t366w(kabat编号)。臼修饰表示抗体ch3结构域中的突变t366s、l368a和y407v。除杵和臼修饰外，一个ch3结构域中可以存在突变s354c，另一个ch3结构域中可以存在突变y349c。“构架区”或“fr”指高变区(hvr)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的fr一般由四个fr结构域组成：fr1、fr2、fr3和fr4。因此，hvr和fr序列一般按以下顺序出现在vh(或vl)中：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有包含本文定义的fc区的重链的抗体。“基因”表示核酸，其是例如染色体上或质粒上可以影响肽、多肽或蛋白质的表达的区段。除编码区(即结构基因)外，基因包含其他功能性元件来例如信号序列、一个或多个启动子、内含子和/或终止子。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已将外源核酸引入其中的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括最初转化的细胞及从其衍生的后代，而不考虑传代数。后代的核酸含量可以并非与亲本细胞完全相同，但可以包含突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能和生物学活性的突变体后代。“人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生或衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“人源化”抗体指包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个且通常为两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部hvr(例如cdr)对应于非人抗体的那些，全部或基本上全部fr对应于人抗体的那些。人源化抗体可以可选地包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已进行了人源化的抗体。本文所用的术语“高变区”或“hvr”指抗体可变结构域的在序列上高变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的区域中的每一个。通常，天然四链抗体包含六个hvr；三个在vh中(h1、h2、h3)，三个在vl中(l1、l2、l3)。hvr一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(cdr)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基26-32(l1)、50-52(l2)、91-96(l3)、26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)(chothia,c.和lesk,a.m.,j.mol.biol.196(1987)901-917)。示例性cdr(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)存在于l1的氨基酸残基24-34、l2的氨基酸残基50-56、l3的氨基酸残基89-97、h1的氨基酸残基31-35b、h2的氨基酸残基50-65和h3的氨基酸残基95-102(kabat,e.a.等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991),nihpublication91-3242)。除vh中的cdr1外，cdr一般包含形成高变环的氨基酸残基。cdr还包含“特异性决定残基”或“sdr”，其是接触抗原的残基。sdr包含在cdr的称为缩短的cdr或a-cdr的区域内。示例性a-cdr(a-cdr-l1、a-cdr-l2、a-cdr-l3、a-cdr-h1、a-cdr-h2和a-cdr-h3)存在于l1的氨基酸残基31-34、l2的氨基酸残基50-55、l3的氨基酸残基89-96、h1的氨基酸残基31-35b、h2的氨基酸残基50-58和h3的氨基酸残基95-102(almagro,j.c.和fransson,j.,front.biosci.13(2008)1619-1633)。除非另有说明，本文按照kabat等,上文编号可变结构域中的hvr残基和其他残基(例如fr残基)。“内部核糖体进入位点”或“ires”描述这样的序列，其在功能上促进独立于ires的基因5'的翻译起始，并允许在动物细胞内从单个转录物翻译两个顺反子(可读框)。ires提供独立的核糖体进入位点用于翻译刚好处于其下游(下游在本文中可与3’互换使用)的可读框。不像细菌mrna(其可以是多顺反子，即编码从mrna顺次翻译的几种不同多肽)，动物细胞的大多数mrna是单顺反子，仅编码一种蛋白质的合成。对于真核细胞中的多顺反子转录物，翻译将从最靠近5’的翻译起始位点起始，在第一终止密码子处终止，转录物将从核糖体释放，导致仅翻译mrna中的第一编码多肽。在真核细胞中，具有与转录物中的第二或后续可读框有效连接的ires的多顺反子转录物允许连顺次翻译该下游可读框来产生由同一转录物编码的两种或多种多肽。之前已描述了ires元件在载体构建中的用途，见例如pelletier,j.等,nature334(1988)320-325；jang,s.k.等,j.virol.63(1989)1651-1660；davies,m.v.等,j.virol.66(1992)1924-1932；adam,m.a.等,j.virol.65(1991)4985-4990；morgan,r.a.等nucl.acidsres.20(1992)1293-1299；sugimoto,y等,biotechnology12(1994)694-698；ramesh,n.等,nucl.acidsres.24(1996)2697-2700；和mosser,d.d.等,biotechniques22(1997)150-152)。本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即除了例如包含天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂期间出现的可能的变体抗体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该群体的单种抗体相同和/或结合相同的表位。与通常包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体抗抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆”指抗体获自基本上同质的抗体群体的特征，而不解释为需要通过任意具体的方法来产生抗体。例如，待按照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，其包括但不限于杂交瘤法、重组dna法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述用于制备单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。本文所用的“核酸”指由单核苷酸(也称为碱基)a、c、g和t(或rna中的u)组成的聚合物分子，例如dna、rna或其修饰。此多核苷酸分子可以是天然存在的多核苷酸分子或合成的多核苷酸分子或一种或多种天然存在的多核苷酸分子与一种或多种合成的多核苷酸分子的组合。此定义还涵盖其中改变(例如通过诱变)、缺失或加入了一个或多个核苷酸的天然存在的多核苷酸分子。核酸可以是分离的，或整合入另一核酸(例如表达盒)、质粒或宿主细胞的染色体中。核酸同样表征为其由单核苷酸组成的核酸序列。对本领域技术人员而言，将例如多肽的氨基酸序列转化为编码此氨基酸序列的相应核酸序列的流程和方法众所周知。因此，核酸表征为其由单核苷酸组成的核酸序列，并同样表征为由此编码的多肽的氨基酸序列。本文所用的“核酸”也指编码可以重组产生的多肽的天然存在或部分或完全非天然存在的核酸。核酸可以由分离的或通过化学手段合成的dna片段建成。核酸可以整合入另一核酸，例如表达质粒或真核宿主细胞的基因组/染色体中。质粒包括穿梭质粒和表达质粒。通常，该质粒还将包含原核繁殖单位，该原核繁殖单位含有原核生物中的质粒的分别用于复制和选择的复制起点(例如cole1复制起点)和选择标记(例如氨苄青霉素或四环素抗性基因)。“有效连接的”指两种或多种成分的并列，其中所述成分处于允许它们以其预期方式发挥作用的关系中。例如，如果启动子和/或增强子顺式作用来控制或调节所连接的序列的转录，则它与编码序列有效连接。通常，但并非必然，“有效连接的”dna序列是相邻的，且在有必要连接两个蛋白质编码区(如分泌前导序列和多肽)时是相邻和符合(可读)框的。但是，虽然有效连接的启动子通常位于编码序列的上游，但它冰粉必然与该编码序列相邻。增强子无需是相邻的。如果增强子增加编码序列的转录，则该增强子与该编码序列有效连接。有效连接的增强子可以位于编码序列上游、编码序列内或编码序列下游，且距启动子相当的距离。如果聚腺苷酸化位点位于编码序列的下游端，使得转录通过该编码序列进入该聚腺苷酸化序列，则它与该编码序列有效连接。如果翻译终止密码子位于编码序列的下游端(3’端)，使得翻译通过该编码序列行进至该终止密码子并在此处终止，则它与该外显子核酸序列有效连接。通过本领域已知重组方法来实现连接，例如，使用pcr方法和/或通过方便的限制位点处的连接。如果不存在方便的限制位点，则按照常规实施使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。“多顺反子转录单位”是其中一个以上的结构基因处于同一启动子的控制下的转录单位。本申请内所用的术语“聚腺苷酸化信号(polya信号)”指用来诱导特定核酸序列区段的初级转录物的切割和聚腺苷酸化的核酸序列。包含聚腺苷酸化信号的3’非翻译区可以选自含有衍生自sv40、牛生长激素(bgh)基因、免疫球蛋白基因和胸苷激酶基因(tk，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶聚腺苷酸化信号)的聚腺苷酸化信号的3’非翻译区。“启动子”指控制与它有效连接的基因/结构基因或核酸序列的转录的多核苷酸序列。启动子包含用于rna聚合酶结合和转录起始的信号。所使用的启动子将在考虑在其中表达所选择的序列的宿主细胞的细胞类型中具有功能。包括来自多种不同来源的组成型、诱导型和阻抑型启动子的大量启动子为本领域公知(并在诸如genbank的数据库中标识)，且可作为克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸内获得(例如从诸如atcc的保藏机构以及其他商业或个人来源)。“启动子”包含指导结构基因转录的核苷酸序列。通常，启动子定位在基因的5’非编码或非翻译区中，靠近结构基因的转录起始位点。启动子内在起始转录中发挥作用的序列元件常表征为共有核苷酸序列。这些启动子元件包括rna聚合酶结合位点、tata序列、caat序列、分化特异性元件(dse；mcgehee,r.e.等,mol.endocrinol.7(1993)551)、环amp应答元件(cres)、血清应答元件(sre；treisman,r.,seminarsincancerbiol.1(1990)47)、糖皮质激素应答元件(gre)及其他诸如cre/atf(o'reilly,m.a.等,j.biol.chem.267(1992)19938)、ap2(ye,j.等,j.biol.chem.269(1994)25728)、sp1、camp应答元件结合蛋白(creb；loeken,m.r.,geneexpr.3(1993)253)和八核苷酸因子(一般见watson等,(编辑),molecularbiologyofthegene,第4版(thebenjamin/cummingspublishingcompany,inc.(1987))及lemaigre,f.p.和rousseau,g.g.,biochem.j.303(1994)1-14)的转录因子的结合位点。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应诱导剂而提高。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调节。还已知阻抑型启动子。例如，c-fos启动子在生长激素结合其在细胞表面上的受体时特异性激活。可以通过由例如cmv启动子及随后的两个tet操纵基因位点组成的人工杂合启动子来达到受四环素(tet)调节的表达。tet阻抑物与两个tet操纵基因位点结合，并阻断转录。加入诱导物四环素时，tet阻抑物从tet操纵基因位点释放，转录继续(gossen,m.和bujard,h.,pnas89(1992)5547-5551)。对于包括金属硫蛋白和热休克启动子的其他诱导型启动子，见例如sambrook等(上文)和gossen等,curr.opin.biotech.5(1994)516-520。在已鉴定为用于高水平表达的强启动子的真核启动子有sv40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-i启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、中国仓鼠延伸因子1α(chef-1，见例如us5,888,809)、人ef-1α、泛素和人巨细胞病毒立即早期启动子(cmvie)。“启动子”可以是组成型或诱导型。增强子(即作用于启动子来增加转录的顺式作用dna元件)可以有必要与启动子结合发挥作用来提高单独用启动子所获得的表达水平，且可以作为转录调节元件包括。通常，含有启动子的多核苷酸区段也将包括增强子序列(例如cmv或sv40)。本申请内所用的术语“稳定转化的”、“稳定转染的”或“稳定的”指外源核酸可遗传地和稳定地整合入宿主细胞基因组/染色体。在选择性生长条件下(即在一种或多种选择标记的存在下)细胞选择过程之后获得稳定转染的细胞。“结构基因”指不含信号序列的基因区域，即编码区。术语“转录终止子”指向rna聚合酶发出终止mrna合成的信号的长度为50-750个碱基对的dna序列。尤其是在使用强启动子时，在表达盒的3’端用非常有效(强)的终止子来防止rna聚合酶通读是明智的。无效的转录终止子可以导致操纵子样mrna的形成，其可以是不希望的(例如质粒编码的)基因表达的原因。在本发明的范围内，可以用基本上本领域已知的转染方法中的任一种来获得转染的细胞。例如，可以借助电穿孔或显微注射来将核酸引入细胞。备选地，可以使用诸如fugene6(rochediagnosticsgmbh,德国)、x-tremegene(rochediagnosticsgmbh,德国)和lipofectamine(invitrogencorp.,美国)的脂转染试剂。还备选地，可以通过基于反转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒的适当的病毒载体系统来将核酸引入细胞(singer,o.,proc.natl.acad.sci.usa101(2004)5313-5314)。本申请内所用的术语“瞬时转染”指其中引入细胞的核酸不整合入该细胞的基因组或染色体dna的方法。它实际上作为染色体外元件(例如作为附加体)维持在细胞中。附加体的核酸的转录过程不受影响，且例如产生由附加体的核酸编码的蛋白质。瞬时转染产生“瞬时转染的”细胞。术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的涉及该抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为vh和vl)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(fr)和三个高变区(hvr)(见例如kindt,t.j.等,kubyimmunology,第6版,w.h.freemanandco.,n.y.(2007),第91页)。单个vh或vl结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别用来自结合该抗原的抗体的vh或vl结构域筛选互补的vl或vh结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体(见例如portolano,s.等,j.immunol.150(1993)880-887；clackson,t.等,nature352(1991)624-628)。本文所用的术语“载体”指能够繁殖与它连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体，以及掺入它所引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。抗体本文提供的方法和组合物用于产生重组单克隆抗体。抗体可以具有多种结构，如但不限于单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、单价抗体、多价抗体(例如二价抗体)。在某些实施方案中，该抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于fab、fab’、fab’-sh、f(ab’)2、fv和scfv片段即下文所述的其他片段。某些抗体片段的综述见hudson,p.j.等,nat.med.9(2003)129-134。scfv片段的综述见例如plueckthun,a.,in:thepharmacologyofmonoclonalantibodies,113卷,rosenburg和moore(编辑),springer-verlag,newyork(1994),第269-315页；还见wo1993/16185、us5,571,894和us5,587,458。包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的fab和f(ab')2片段的讨论见美国专利号us5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合部位的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的(见例如ep0404097；wo1993/01161；hudson,p.j.等,nat.med.9(2003)129-134；和holliger,p.等,proc.natl.acad.sci.usa90(1993)6444-6448)。三抗体和四抗体还描述于hudson,p.j.等,nat.med.9(2003)129-134中。单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(domantis,inc.,waltham,ma；见例如us6,248,516b1)。可以通过包括但不限于本文所述的完整抗体的蛋白酶解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生的多种技术来制备抗体片段。在某些实施方案中，该抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如us4,816,567；和morrison,s.l.等,proc.natl.acad.sci.usa81(1984)6851-6855中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、或非人灵长类(如猴)的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“种类转换”抗体，其中种类或亚类已从亲本抗体的种类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，人源化非人抗体来降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中hvr，例如cdr(或其部分)衍生自非人抗体，fr(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体还将可选地包含至少部分人恒定区。在一些实施方案中，用对应的来自非人抗体(例如从其衍生hvr残基的抗体)的残基取代人源化抗体中的一些fr残基，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体和制备它们的方法综述于例如almagro,j.c.和fransson,j.,front.biosci.13(2008)1619-1633中，并进一步描述于例如riechmann,i.等,nature332(1988)323-329；queen,c.等,proc.natl.acad.sci.usa86(1989)10029-10033；us5,821,337、us7,527,791、us6,982,321和us7,087,409；kashmiri,s.v.等,methods36(2005)25-34(描述sdr(a-cdr)移植)；padlan,e.a.,mol.immunol.28(1991)489-498(描述“重修表面”)；dall’acqua,w.f.等,methods36(2005)43-60(描述“fr改组”)；osbourn,j.等,methods36(2005)61-68；和klimka,a.等,br.j.cancer83(2000)252-260(描述fr改组的“指导选择”途径)中。可以用来进行人源化的人构架区包括但不限于：用“最适”法选择的构架区(见例如sims,m.j.等,j.immunol.151(1993)2296-2308)；衍生自具体亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的构架区(见例如carter,p.等,proc.natl.acad.sci.usa89(1992)4285-4289；和presta,l.g.等,j.immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(见例如almagro,j.c.和fransson,j.,front.biosci.13(2008)1619-1633)；和衍生自筛选fr文库的构架区(见例如baca,m.等,j.biol.chem.272(1997)10678-10684和rosok,m.j.等,j.biol.chem.271(1996922611-22618)。在某些实施方案中，该抗体是人抗体。可以用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体通常描述于vandijk,m.a.和vandewinkel,j.g.,curr.opin.pharmacol.5(2001)368-374及lonberg,n.,curr.opin.immunol.20(2008)450-459中。可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，该转基因动物已修饰为响应抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合入动物的染色体。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已失活。用于从转基因动物获得人抗体的方法的综述见lonberg,n.,nat.biotech.23(2005)1117-1125，还见例如描述xenomousetm技术的us6,075,181和us6,150,584；描述技术的us5,770,429；描述k-m技术的us7,041,870；描述技术的us2007/0061900。可以例如通过与不同的人恒定区组合来进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区。还可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(见例如kozbor,d.,j.immunol.133(1984)3001-3005；brodeur,b.r.等,monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,marceldekker,inc.,newyork(1987),51-63页；及boerner,p.等,j.immunol.147(1991)86-95)。通过人b细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于li,j.等,proc.natl.acad.sci.usa103(2006)3557-3562中。其他方法包括描述于例如us7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人igm抗体)和ni,j.,xiandaimianyixue26(2006)265-268(描述人-人杂交瘤)中。人杂交瘤技术(三元杂交瘤技术)也描述于vollmers,h.p.和brandlein,s.,histologyandhistopathology20(2005)927-937及vollmers,h.p.和brandlein,s.,methodsandfindingsinexperimentalandclinicalpharmacology27(2005)185-191中。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将这类可变结构域序列与希望的人恒定区组合。下文描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。可以针对具有一种或多种希望的活性的抗体筛选组合文库来分离抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体文库并针对具有希望的结合特征的抗体筛选这类文库的多种方法。这类方法综述于例如hoogenboom,h.r.等,methodsinmolecularbiology178(2001)1-37中，并进一步描述于例如mccafferty,j.等,nature348(1990)552-554；clackson,t.等,nature352(1991)624-628；marks,j.d.等,j.mol.biol.222(1992)581-597；marks,j.d.和bradbury,a.,methodsinmolecularbiology248(2003)161-175；sidhu,s.s.等,j.mol.biol.338(2004)299-310；lee,c.v.等,j.mol.biol.340(2004)1073-1093；fellouse,f.a.,proc.natl.acad.sci.usa101(2004)12467-12472；及lee,c.v.等,j.immunol.methods284(2004)119-132中。在某些噬菌展示方法中，分别通过聚合酶链反应(pcr)克隆vh和vl基因的库，并在噬菌体文库中随机组合，然后按winter,g.等,ann.rev.immunol.12(1994)433-455中所述针对结合抗原的噬菌体筛选该文库。噬菌体通常作为单链fv(scfv)片段或作为fab片段展示抗体片段。来自免疫的来源的文库提供抗免疫原的高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。备选地，可以按griffiths,a.d.等,emboj.12(1993)725-734所述克隆(例如从人)首次用于实验的库来提供抗广范围的非自身以及自身抗原的抗体的单一来源而无需任何免疫。最后，还可以按hoogenboom,h.r.和winter,g.,j.mol.biol.227(1992)381-388所述，通过从干细胞克隆未重排v基因区段，并用包含随机序列的pcr引物来编码高度可变的cdr3区并实现体外重排来合成制备首次用于实验的文库。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如us5,750,373、us2005/0079574、us2005/0119455、us2005/0266000、us2007/0117126、us2007/0160598、us2007/0237764、us2007/0292936和us2009/0002360。本文将分离自人抗体文库的抗体或抗体片段视为人抗体或人抗体片段。在某些实施方案中，该抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同部位具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，该结合特异性中的一种针对第一抗原，另一种针对不同的第二抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与同一抗原的两个不同表位结合。还可以用双特异性抗体来将细胞毒性剂定位至表达该抗原的细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见milstein,c.和cuello,a.c.,nature305(1983)537-540；wo93/08829；及traunecker,a.等,emboj.10(1991)3655-3659)和“杵入臼”改造(见例如us5,731,168)。还可以通过以下来制备多特异性抗体：用于制备抗体fc-异二聚体分子的工程静电引导作用(wo2009/089004)；交联两种或多种抗体或片段(见例如us4,676,980和brennan,m.等,science229(1985)81-83)；用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(见例如kostelny,s.a.等,j.immunol.148(1992)1547-1553)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如holliger,p.等,proc.natl.acad.sci.usa90(1993)6444-6448)；使用单链fv(scfv)二聚体(见例如gruber,m.等,j.immunol.152(1994)5368-5374)；按例如tutt,a.等,j.immunol.147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。本文还包括具有三个或多个功能性抗原结合部位的改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如us2006/0025576)。该抗体可以是含有与第一抗原以及另一不同抗原结合的抗原结合部位的“双重作用fab”或“daf”(见例如us2008/0069820)。该抗体或片段还可以是wo2009/080251、wo2009/080252、wo2009/080253、wo2009/080254、wo2010/112193、wo2010/115589、wo2010/136172、wo2010/145792或wo2010/145793中所述的多特异性抗体。方法在某些实施方案中，用本文提供的方法来改变(即提高或降低)抗体糖基化的程度。在抗体包含fc区时，可以改变附着于fc区的糖类。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双触角寡糖，其一般通过n连接附着于fc区的ch2结构域的asn297(见例如wright,a.和morrison,s.l.,tibtech15(1997)26-32)。寡糖可以包括多种糖类，例如甘露糖、n-乙酰葡糖胺(glcnac)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中附着于glcnac的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明的抗体中的寡糖的修饰来产生具有某些改善的特性的抗体变体。在一个实施方案中，所提供的方法导致产生具有缺乏附着(直接或间接)于fc区的岩藻糖的糖类结构的抗体。例如，这种抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。相对于通过例如wo2008/077546中所述的maldi-tof质谱法测量的附着于asn297的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，计算asn297处的糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量。asn297指定位在fc区中的约297位(fc区残基的kabateu编号)的天冬酰胺残基；但是，由于抗体中小的序列变异，asn297也可以定位在297位上游或下游约±3氨基酸，即在294位和300位之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的adcc功能(见例如us2003/0157108；us2004/0093621)。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体的出版物的实例包括：us2003/0157108；wo2000/61739；wo2001/29246；us2003/0115614；us2002/0164328；us2004/0093621；us2004/0132140；us2004/0110704；us2004/0110282；us2004/0109865；wo2003/085119；wo2003/084570；wo2005/035586；wo2005/035778；wo2005/053742；wo2002/031140；okazaki,a.等,j.mol.biol.336(2004)1239-1249；yamane-ohnuki,n.等,biotech.bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的lec13cho细胞(ripka,j.等,arch.biochem.biophys.249(1986)533-545；us2003/0157108；及wo2004/056312，尤其是在实施例11中)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因fut8敲除的cho细胞(见例如yamane-ohnuki,n.等,biotech.bioeng.87(2004)614-622；kanda,y.等,biotechnol.bioeng.94(2006)680-688；andwo2003/085107)。在某些实施方案中，所提供的方法可以用来产生具有二等分寡糖的抗体，例如其中附着于抗体fc区的双触角寡糖被glcnac二等分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的adcc功能。这类抗体变体的实例描述于例如wo2003/011878、us6,602,684和us2005/0123546中。还可以产生在附着于fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的cdc功能。这类变体描述于例如wo1997/30087、wo1998/58964和wo1999/22764中。可以用例如us4,816,567中所述的重组方法和组合物产生抗体。核酸可以编码包含抗体的vl的氨基酸序列和/或包含抗体的vh的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含以下(或已用以下转化)：(1)包含编码含有抗体的vl的氨基酸序列和含有抗体的vh的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码含有抗体的vl的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体的vh的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴样细胞(例如y0、ns0、sp2/0)。在一个实施方案中，提供制备抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养上文提供的含有编码抗体的核酸的宿主细胞，并可选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。为了重组产生抗体，分离编码抗体的核酸，并插入一个或多个载体用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这种核酸。适合用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，尤其是在不需要糖基化和fc效应子功能时，可以在细菌中产生抗体。抗体片段和多肽在细菌中的表达见例如us5,648,237、us5,789,199和us5,840,523；还见charlton,k.a.,in:methodsinmolecularbiology,248卷,lo,b.k.c.(编辑),humanapress,totowa,nj(2003),245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。表达后，可以从可溶级分中的细菌糊分离抗体，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适合用于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株(见gerngross,t.u.,nat.biotech.22(2004)1409-1414；和li,h.等,nat.biotech.24(2006)210-215)。适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使用，尤其是用于转染草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞的杆状病毒毒株。植物细胞培养物也可以用作宿主(见例如us5,959,177、us6,040,498、us6,420,548、us7,125,978和us6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的plantibodiestm技术))。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用驯化为悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是sv40转化的猴肾cv1细胞系(cos-7)；人胚肾细胞系(描述于例如graham,f.l.等,j.genvirol.36(1977)59-74中的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠支持细胞(描述于例如mather,j.p.,biol.reprod.23(1980)243-252中的tm4细胞)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck)；buffalo大鼠肝细胞(brl3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hepg2)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562)；描述于例如mather,j.p.等,annalsn.y.acad.sci.383(1982)44-68中的tri细胞；mrc5细胞；及fs4细胞。其他有用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr阴性(dhfr-)cho细胞(urlaub,g.等,proc.natl.acad.sci.usa77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤细胞系，如y0、ns0和sp2/0。适合用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如yazaki,p.和wu,a.m.,methodsinmolecularbiology,248卷,lo,b.k.c.(编辑),humanapress,totowa,nj(2004),255-268页。ii.本发明的具体方面已发现，取决于载体组织，表达载体的性能因稳定转染中载体的设计而不同。已发现，不受限于此理论，为了实现稳定转染的载体组织，几点可以有用：1)宿主基因组中整合的载体拷贝之间的转录干扰现象，其取决于各载体设计并对各载体设计特异，且不存在于瞬时系统中；2)选择方法和选择严格性的影响，其取决于各载体组织，且在稳定系统中发挥重要作用；及3)最佳的lc与hc多肽的比值。但是，已发现，对于稳定转染，lc和hc的双向表达比成行组织hc-lc-sm更差。不受限于此理论：1)lc、hc和sm的表达盒的趋同组织可减少整合的载体拷贝之间的转录干扰现象；2)hc在lc的上游明显便于对稳定转染而言最佳(更佳)的lc:hc多肽比；及3)选择标记的下游放置明显提高了选择的严格性。此外，发现产生igg的细胞的百分比和细胞系的生产力提高。对于在抗体表达盒上游双向包含选择标记的载体，虽然选择的严格性明显提高，但提高选择压力的浓度未提高稳定库或克隆的生产力(数据未显示)。已发现，hef1α启动子产生大量产生良好的克隆及非常少量的非产生或低产生克隆。但是，hef1α启动子的最好的单克隆在补料分批分析中的产物效价低于hcmv启动子的克隆。但hcmv启动子的排序靠前的克隆的总数相对低，它们的鉴定通常需要高筛选努力。已发现，在稳定转染中，对于含有hcmv启动子的载体，在与sv40或bghpolya信号组合时，hgt的使用显著提高生产力。但是，对于含有hef1α启动子的载体，在与bghpolya信号组合时，它对产物效价的影响可忽略。因此，已发现，hgt对载体性能的影响依赖于所使用的启动子。用于充分控制的大规模发酵中的最终评价的适当克隆的选择通常基于摇瓶中的分批或补料分批分析。已发现，一些表达载体或元件的性能和排序在分批和补料分批分析之间存在差异。在分批分析中而不是在补料分批分析中，对于含有hcmv启动子的载体，用bghpolya信号取代sv40提高了生产力。在分批分析中而不是在补料分批分析中，hgt对克隆的产物效价无显著影响。在分批和补料分批之间载体性能的绝对差异不完全不同。选择标记的放置或启动子(hef1α或hcmv启动子)不同的载体之间的差异在分批分析中中度显著，但在补料分批分析中强烈显现。表达水平和比产生速率在补料分批模式中比在分批模式中高。已发现大多数克隆的补料分批分析和2l发酵的性能的良好相关，不仅在绝对产物效价的水平上，还在不同载体和克隆之间的排序上。已发现，与在抗体表达盒上游双向放置选择标记相比，选择标记的下游放置轻微减少了生产力丢失。不受限于理论，这可能是由于提高的选择严格性，因此更高的mrna水平或改善的lc:hcmrna或多肽比。两种因素都可导致对生产力变化的更高耐受性。与sv40polya信号相比，bghpolya信号显著降低克隆中抗体表达的稳定性。但是，在bghpolya信号下游插入hgt明显提高了表达的稳定性。hgt对稳定性的积极作用在缺乏选择压力的情况下最明显。稳定库的稳定性分析揭示，在用hcmv产生时，细胞快速丧失生产力，但在用hef1α启动子产生时则不然。令人惊奇地，对于含有hef1α启动子的载体，hgt降低克隆的生产力，但轻微提高它们的稳定性。只有少部分克隆在选择过程之后显著产生抗体。但是，组织中的载体修饰和/或元件的修饰显著提高产生igg的克隆与不产生igg的克隆的比值。不同的载体组织及因此决定选择严格性的选择标记的不同表达水平也明显影响产生igg的细胞的百分比。基于筛选过程的数据的统计模拟证明，一些表达载体还具有显著减少筛选过程中的工作量的潜能。这一事实对生物制药公司的成本具有主要影响。表达盒组织针对其生产力测试了抗体的轻链和重链和/或选择标记的位置不同的四种不同载体(详见图1)。在瞬时转染中和稳定库的分批分析中测试了载体p5137、p5156、p5158和p5159。还在稳定单克隆的分批分析中测试了载体p5137和p5156。将载体p5137、p5156、p5158和p5159瞬时转染入cho-k1细胞，并在转染后第5天通过elisa测定生产力(图2)。已发现，对于瞬时转染，与相反的顺序相比，将重链放置在抗体轻链的前面提供了更好的表达结果。因此，可以获得更高的生产力：载体p5137-11.6μg/ml；载体p5156-7.1μg/ml；载体p5159-8.0μg/ml；载体p5158-4.2μg/ml。已发现，与在第一抗体链前面双向放置相比，选择标记放置在两条抗体链之后提供了更好的表达结果。因此，可以获得更高的生产力。通过核转染将载体p5137、p5156、p5158和p5159转染入cho-k1细胞，并选择稳定库。在分批分析中测定该稳定库的生产力。已发现，与在第一抗体链前面的双向放置(3`-5`方向)相比，选择标记放置在两条抗体链之后(按5`-3`方向)提供了更好的表达结果。因此，可以获得更高的生产力：载体p5156-18.0μg/ml；载体p5158-9.1μg/ml；载体p5137-15.6μg/ml；载体p5159-5.7μg/ml(图3)。通过核转染将载体p5137和p5156转染入cho-k1细胞。选择稳定转染的细胞，并在分批分析中分析了最好的15个克隆的生产力。分别用载体p5137和载体p5156产生的最好的15个克隆的平均生产力：载体p5137为159μg/ml，载体p5156为141μg/ml。每种载体最好的15个克隆在分批分析中的生产力分布非常相似。克隆在分批分析中的生产力从约50μg/ml至300μg/ml变动(一个例外：用载体p5137产生的最好的克隆达到了>450μg/ml的生产力)。在瞬时转染和稳定库的分批分析二者中，选择标记放置在两条抗体链之后(按5`-3`方向)产生显著高于选择标记双向3`-5`放置在第一抗体链前面的生产力。已发现，在瞬时转染中，与相反的顺序相比，抗体重链放置在抗体轻链前面(都按5`-3`方向)提供更好的表达。已发现，抗体轻链和重链的位置/顺序对于稳定库和单克隆的生产力没有显著影响。已确保已表达稍微过量的轻链。因此，安排抗体链表达盒的顺序来满足这个需要。已发现，抗体链表达盒(任何顺序)在选择标记表达盒之前/之后(均按5`-3`方向)是尤其适合的。如果两个基因直接一个接着另一个表达，通常第二个基因以较低的速率表达。rna聚合酶在第二转录单位的通读对于启动子在第二转录单位的转录起始具有不利影响。在载体px6068中，抗体轻链和重链的表达盒双向排列(图4)。为了防止启动子竞争或干扰(由于两个启动子过于接近的无效(inefficient)转录起始，即，启动子接近转录因子和rna聚合酶的空间位阻降低转录机器的资源可用性)，驱动抗体轻链和重链表达的两个短hcmv启动子位置上分开(通过puc复制起点)。载体p5068和px6068通过核转染瞬时转染cho-k1细胞。与表达载体p5068相比，载体px6068瞬时转染显示增加的生产力：载体px6068为9.0μg/ml，载体p5068为4.5μg/ml(图5)。已发现，与轻链和重链背靠背放置相比，瞬时转染中抗体轻链和重链的双向和分开放置提供提高的抗体表达。载体p5068和px6068通过核转染瞬时转染进cho-k1细胞，选择稳定库。在分批分析中测定稳定库的生产力。稳定库的分批分析显示载体p5068和px6068在稳定库中的生产力类似：载体p5068为12.5μg/ml，载体px6068为12.5μg/ml(图5)。转染方案为了稳定转染，通过用酶在表达载体骨架上切割的限制性消化来线性化载体。对于在于px6068的情况，两个可能的限制性位点是可能的：1.轻链转录单位和选择标记之间(sgrai)；2.轻链和重链的hcmv启动子之间的puc起点中(bsshii)。通过sgrai或bsshii限制性消化来线性化的载体px6068通过核转染，转染进cho-k1细胞，选择稳定库。稳定库的生产力在分批分析中测定。已发现，表达载体中线性化位点的位置明显对于载体在稳定库的分批分析中的生产力具有影响。与限制酶sgrai线性化的载体px6068产生的稳定库相比，限制酶bsshii线性化的载体px6068产生的库显示更高的生产力：第一次实验：限制酶bsshii线性化的载体px6068为6.4μg/ml，限制酶sgrai线性化的载体px6068为2.8μg/ml；第二次实验：限制酶bsshii线性化的载体px6068为12.5μg/ml，限制酶sgrai线性化的载体px6068为9.6μg/ml(见图6)。选择压力开始的时间点转染后不同的时间点施加选择压力，例如对于稳定细胞克隆的产生，在0小时、4小时、8小时、24小时和48小时。已发现，转染后24小时加入选择压力，选择剂的浓度独立导致培养物上清中最高的抗体滴度(见图7)。载体骨架对于细胞系性能的影响表达载体一般在转染进入真核细胞之前线性化。另外，表达载体包含在原核细胞中扩增表达载体所需的原核序列。已发现，在转染进真核细胞之前从线性化表达载体去掉原核元件导致：-减少产生稳定细胞克隆需要的选择时间(图8a)，-增加库(图8b)和单克隆(图8c)的生产力，-加速恢复(图8d)，和-改善细胞生长(图8e)。载体元件和表达盒方向已将几种不同的转录相关遗传元件及其组合与参考遗传元件组合相比较。根据比较性瞬时实验，获得了以下结果(见下表，双向载体组织，sm(3`’-5’`)-lc_hc(5’-3’)))。将不同的启动子与bghpolya信号和hgt转录终止子组合(见下表)。所使用的启动子已发现，可以用本文报道的载体元件/元件组合来达到提高的表达(生产力)：人cmv启动子：xu等,j.control.release,81(2002)155-163.xia等,prot.expr.purif.45(2006)115-124.大鼠cmv启动子：xia等,prot.expr.purif.45(2006)115-124.人ef1α启动子：teschendorf等,anticancerres.22(2002)3325-3330.li等,j.immunol.methods318(2007)113-124.mpsv启动子：xia等,prot.expr.purif.45(2006)115-124.artelt等,gene68(1988)213-219.stocking等,proc.natl.acad.sci.usa82(1985)5746-5750.lin等,gene147(1994)287-292.mpsv-cmv杂合启动子：liu等,anal.biochem.246(1996)150-152.通过用ires连接的表达盒来表达选择标记，可以提供高选择性和高严格性的选择方法：-对抗体表达的选择压力导致高选择性-抗体和选择标记的连接表达导致高选择性-已发现，具有弱活性的ires元件的使用导致高严格性，即高抗体产生和低选择标记产生-通过ires元件连接抗体和选择标记的表达-鉴定确实或多或少地改变igg表达的具有弱活性的ires元件(emcv/gtx)-用融合蛋白作为选择标记和筛选标记-双功能gfp-新霉素融合蛋白-鸟氨酸脱羧酶的pest序列是强蛋白水解信号序列，赋予蛋白质减小的半衰期-融合蛋白的ires连接表达导致高选择性-蛋白水解信号序列的短半衰期导致高严格性-由于融合蛋白的弱表达和短半衰期，需要强表达-通过facs快速鉴定高产者(高gfp表达克隆的分选提供了高产者的选择)选择标记通过ires元件与抗体重链连接gfp-neo融合蛋白通过不同的ires元件与抗体重链连接gtxev71elf4gemcvgfp表达：++++-+抗体表达：---+gtx-ires：komuro等,emboj.12(1993)1387-1401.emcv-ires：mountford等,proc.natl.acad.sci.usa91(1991)4303-4307.ev71-ires：lee等,biotechnol.bioeng.90(2005)656-662.elf4g-ires：wong等,genether.9(2002)337-344.gtx(合成的)-ires：chappell等,proc.natl.acad.sci.usa97(2000)1536-1541.已发现，通过ev71-ires元件，可以用轻链表达盒与重链表达盒的连接达到提高的表达(生产力)：与载体组织组合的载体元件在瞬时转染中、在稳定库中及一些在单克隆水平，在cho-k1宿主细胞系中测试了以下载体。载体组织启动子polya信号转录终止子px9001sm(3′-5`)-lc-hchcmvsv40polya不存在px9002lc-hc-smhcmvsv40polya不存在px9003lc-hc-smhef1αsv40polya不存在px9004lc-hc-smhcmvbghpolya不存在px9005lc-hc-smhcmvbghpolyahgtpx9006lc-hc-smhef1αbghpolya不存在px9007lc-hc-smhef1αbghpolyahgtpx9010lc(3′-5′)-hc-smhef1αbghpolya不存在px9011lc(3′-5′)-hc-smhcmvsv40polyahgt已将几种转录相关遗传元件及其组合与参考载体(px9001，载体组织sm(3’-5’方向)-lc-hc(5’-3’方向))相比较。根据比较性实验，与参考载体(px9001，双向载体组织sm(3’-5’)-lc-hc(5’-3’))相比，针对轻链和重链(轻链表达盒在重链表达盒上游)及选择标记的表达盒处于相同方向的单向载体组织获得了以下结果(见下表)。核转染入cho-k1细胞后测试了不同载体在瞬时转染中的性能(见图9)。与使用hcmv启动子相比，取决于所使用的polya信号序列，包含人延伸因子1α启动子(hef1α)(基于载体组织lc-hc-sm)的载体分别具有提高了约+34％(px9003对px9002；sv40polya信号序列)和+30％(px9006对px9004；bghpolya信号序列)的生产力。向bghpolya信号序列加入人胃泌素终止子(hgt)对包含hcmv的启动子的生产力具有积极作用(px9005对px9004；+13％)。基于抗体的轻链和重链的双向表达的表达载体显示改善的性能。取决于所使用的启动子(hef1α或hcmv)和所使用的polya信号序列(sv40或bghpolya信号序列)，与对照载体px9001相比，产物效价提高约2.7至3.4倍。已发现，在载体组织lc-hc-sm(+50％；比较px9006和px9002)中，而不是在载体组织lc(3`-5`)-hc-sm(-28％；比较px9010和px9011)中，人延伸因子1α启动子和bghpolya信号序列的使用对生产力具有积极作用。为了比较表达载体px9002和载体px9003-9007的生产力，通过核转染将载体转染入cho-k1细胞，并选择稳定库。在分批分析中分析了库的生产力(见图10)。稳定库的分批分析显示，来自用包含人延伸因子1α启动子的载体(px9003、px9006、px9007)转染的库的抗体效价比用包含短的hcmv启动子的参考载体(载体px9002)转染的细胞的抗体效价高约7-8倍(载体px9003、px9006和px9007的97.5μg/ml、112.5μg/ml和95.6μg/ml与载体px9002的14.0μg/ml相比较)。通过核转染将载体px9001、px9002和px9004至px9007转染入cho-k1细胞，通过经典筛选方法鉴定出最好的单克隆。在分批分析中分析了每种载体的最好的36个克隆的生产力，并在补料分批分析中测试了分批分析中最好的15个克隆。用载体px9001产生的最好的36个单克隆在分批分析中的平均生产力为356μg/ml。与对照载体px9001相比，用载体px9002或用载体px9004和9005(还包含bghpolya信号(单独或与hgt组合)代替sv40polya信号)产生的克隆显示生产力分别提高37％(px9002)、61％(px9004)至53％(px9005)。载体px9006和px9007的克隆显示生产力分别提高约19％和7％。在补料分批实验中，在超过14天的补料分批分析中测试了用每种载体获得的在分批分析中最好的15个克隆。(用载体px9001产生的)最好的15个内部(inhouse)单克隆在补料分批分析中的平均生产力为1345μg/ml。与对照载体px9001相比，用载体px9002或用载体px9004和px9005(还包含bghpolya信号序列(单独或与hgt组合)代替sv40polya信号序列)产生的克隆显示生产力分别提高80％(px9002)、58％(px9004)至92％(px9005)。除平均生产力提高(见上文)外，排序靠前的克隆的性能也强烈改善。就前5个克隆的生产力而言，与对照载体px9001相比，载体px9002、px9004和px9005显示约64％(px9002)、50％(px9004)和88％(px9005)的提高。在下文中，直接比较了每种不同载体的产生细胞或非产生细胞的百分比。用载体px9001产生的14.2％的克隆产生抗体，在其余抗性克隆中，抗体表达沉默或克隆具有其他缺陷。载体px9002的载体组织几乎使产生细胞的百分比倍增(至26.0％)。还包含bghpolya信号序列单独取代单独(载体px9004)或与hgt组合(载体px9005)的sv40polya信号序列的载体显示产生细胞的百分比(分比为39％和43％)提高约3倍。用人延伸因子1α启动子取代hcmv启动子使产生细胞的数目提高了至多5倍(选择方法后获得的超过70％的克隆确实产生抗体)。在存在和缺乏潮霉素b的情况下培养通过用载体px9001-9007转染获得的15个最好的克隆(基于补料分批结果)15代(＝约60世代)。将15代后克隆在分批分析中的产物效价与稳定性测试开始时克隆在分批分析中的产物效价相比较。在存在选择压力的情况下，15代后，每种载体的15个克隆之间产物效价的变化从载体px9007的-14.7％至载体px9002的+0.2％变动。在缺乏选择压力的情况下，产物效价的降低从载体px9004的25.5％至载体px9005的5.9％变动。满足所定义的稳定性标准(如在存在和缺乏选择标记的情况下，与起始点(g0)的值相比，分批分析中的产物效价>80％)的克隆的数目从4个至10个变动。同样在存在和缺乏选择压力/选择标记的情况下，载体px9005、px9007和px9002产生最高数目的稳定克隆(px9005：10个；px9007：7个；px9002：6个)。因此，已发现，尤其是在缺乏选择压力的情况下，载体px9005的组织显示对稳定性和增加稳定克隆数目的积极作用。已发现，与不含转录终止子(hgt)的sv40polya相比，bghpolya和hgt的组合独立于所使用的启动子地明显提高稳定克隆的生产力。瞬时转染-人延伸因子1α启动子(含有内含子a)的使用提供了增强的生产力(在lc-hc-sm组织中)-与sv40polya信号序列的使用相比，牛生长激素polya信号序列的使用提供了增强的生产力-向bghpolya信号序列加入hgt在包含hcmv启动子的载体中导致提高的生产力-载体组织lc(3`-5′)-hc-sm导致改善的表达稳定库-用包含hef1α启动子的载体产生的库在分批分析中显示增强的生产力-用包含hef1α启动子的载体产生的克隆显示减少的低产克隆数-用包含hef1α启动子的载体产生的克隆显示更高的igg表达稳定性单克隆-选择标记位于下游的载体组织(lc-hc-sm)对单克隆的生产力具有积极作用-用包含bghpolya信号序列和hgt的载体产生的克隆具有更高的生产力和稳定性提供以下实施例、附图和序列来辅助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中显示。应理解，可以在所示方法中进行修改而不背离本发明的精神。序列seqidno:01不含内含子a的短的cmv启动子seqidno:02含有5’utr的不含内含子a的短的人cmv启动子seqidno:03含有内含子a的全长人cmv启动子seqidno:04不含内含子a的全长人ef1α启动子seqidno:05含有内含子a的全长人ef1α启动子seqidno:06含有5’utr的含有内含子a的短的人ef1α启动子seqidno:07含有内含子a的全长大鼠cmv启动子seqidno:08sv40polya信号序列seqidno:09bghpolya信号序列seqidno:10hgt终止子序列seqidno:11sv40启动子seqidno:12鸟氨酸脱羧酶的pest序列seqidno:13编码gfp的核酸序列seqidno:14新霉素选择标记seqidno:15gfp-pest-neo融合蛋白编码核酸seqidno:16emcv-iresseqidno:17ev71-ires附图简述图1.在瞬时转染中、在稳定库中和在单克隆水平上测试的不同载体设计的示例图。载体p5158、p5137、p5156和p5159分别在轻链(lc)和重链(hc)的位置上不同，和/或在选择标记(sm)的位置上不同。图2.载体p5137、p5156、p5158、和p5159在瞬时转染的cho-k1细胞中的生产力。所显示的是在转染后第5天通过elisa测量的每种载体的八个独立转染的平均生产力。图3.用载体p5137、p5156、p5158和p5159产生的稳定库在分批分析中的生产力。所显示的是每种载体的三个库在第7天的平均生产力。图4.表达载体p5068的载体设计和载体px6068的载体设计的示例图。指出lc(轻链)、hc(重链)、sm(选择标记(通过sv40启动子驱动))和ori(复制起点)。图5.载体p5068和px6068在瞬时转染的cho-k1细胞中的生产力。所显示的是在转染后第7天通过elisa测量的每种载体的八个独立转染的平均生产力。图6.用通过限制酶sgrai或通过限制酶bsshii线性化的载体px6068产生的稳定库的生产力。所显示的是每种载体的两个库在分批分析中第7天的平均生产力。图7.稳定细胞库的igg滴度对于转染后选择开始的时间点的依赖性。图8.(a)产生稳定细胞系的选择时间；(b)库的生产力；(c)单克隆的生产(d)活细胞密度恢复的时间过程；(e)培养后第4、7和10天的活细胞密度；载体制备物a—线性化的整个载体，载体制备物b—切下的原核载体元件，载体制备物c—切掉的原核载体元件。图9.使用核转染，载体px9001-px9011在瞬时转染中的生产力：所显示的是转染后第6天每种载体的八个独立转染的平均生产力；数值归一化至参考px9001的数值(设为100％)。图10.载体px9001-px9007产生的稳定库在分批分析中第10天的产物滴度的概述。所显示的是每种载体二(px9001和px9002)至三个独立转染的平均值。实施例表达载体p5068和p5069表达质粒p5068和p5069包含用于表达wo2005/100402中报道的抗-p-选择蛋白抗体的表达盒(保留外显子-内含子组织的基因组组织表达盒)。分别将抗-p-选择蛋白humab轻链和重链编码基因装入哺乳动物细胞表达载体。从而连接编码抗-p-选择蛋白humab轻链可变区(vl)和人κ轻链恒定区(cl)的基因区段，正如抗-p-选择蛋白humab重链可变区(vh)和人γl重链恒定区或人γ4重链恒定区(ch1-铰合部-ch2-ch3)的基因区段一样。关于可以从其推断密码子选择的人轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在kabat,e.a.等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991),nihpublicationno91-3242中提供。抗-p-选择蛋白humabκ轻链的转录单位由以下元件组成：-来自人巨细胞病毒(hcmv)的立即早期增强子和启动子，-合成的包括kozak序列的5'-ut，-包括信号序列内含子的鼠免疫球蛋白重链信号序列，-克隆的抗-p-选择蛋白humab可变轻链cdna，在5’端放置了唯一bsmi限制位点，在3’端放置了剪接供体位点和唯一的noti限制位点的，-基因组人κ基因恒定区，包括内含子2小鼠ig-κ增强子(picard,d.和schaffner,w.nature307(1984)80-82)，和-人免疫球蛋白κ聚腺苷酸化(“polya”)信号序列抗-p-选择蛋白humabγl重链的转录单位由以下元件组成：-来自人巨细胞病毒(hcmv)的立即早期增强子和启动子，-合成的包括kozak序列的5'-ut，-包括信号序列内含子的修饰的鼠免疫球蛋白重链信号序列，-克隆的抗-p-选择蛋白humab可变重链cdna，在5’端放置了唯一bsmi限制位点，在3’端放置了剪接供体位点和唯一的noti限制位点的，-基因组人γl重链基因恒定区，包括小鼠igμ增强子(neuberger,m.s.,emboj.2(1983)1373-1378)，和-人γl免疫球蛋白聚腺苷酸化(“polya”)信号序列。除抗-p-选择蛋白humabκ轻链或γ1重链表达盒外，这些质粒还包含：-潮霉素抗性基因，-eb病毒(ebv)的复制起点orip，-来自载体puc18的复制起点，其允许此质粒在大肠杆菌中复制，和-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。重组dna技术用sambrook等,1999(上文)中所述的标准克隆技术进行克隆。所有分子生物学试剂均为市售(除非另有说明)，且按照厂家的说明使用。核酸合成不同遗传元件的dna由geneartag,regensburg合成。核酸序列测定通过在sequiserve(sequiservegmbh,德国)进行的双链测序来测定dna序列。dna和蛋白质序列分析及序列数据管理用vectorntiadvancesuite9.0版进行序列创建、作图、分析、注释和说明。细胞培养技术cho-k1细胞培养在补充了1xht补充物(invitrogencorp.,目录号11067-030)的cd-cho培养基(invitrogencorp.,目录号10743-011)中。为了选择稳定转染的cho-k1库/细胞系，加入400至800μg/mlg418或200至400μg/ml潮霉素(rochediagnosticsgmbh,rocheappliedsciences,德国,目录号843555)。所有细胞系都在120至140转/分钟的恒定搅拌下维持在37℃、5％co2的增湿培养箱中。每3至4天将细胞分入新鲜培养基。用caseytt或cedexhires细胞计数仪(rocheinnovatesag,bielefeld)测定培养物的密度和活率。通过amaxa核转染技术(lonzagmbh,德国)进行细胞的转染。此外，按例如bonifacino,j.s.等,(编辑),currentprotocolsincellbiology,johnwileyandsons,inc.(2000)中所述应用标准细胞培养技术。细胞计数和细胞活率测定a)电场细胞技术系统(casy)technologytt型细胞计数仪(rocheinnovatisag,bielefeld)用电流进行细胞计数。用脉冲面积分析(pulseareaanalysis)来从细胞通过低压电场中的测量孔时产生的信号获得信息。细胞膜的结构完整性是细胞活率的度。因此活率(viability)的测定无需诸如台盼蓝的染料。b)自动台盼蓝排阻法(cedex)用cedexhires系统(rocheinnovatisag,bielefeld)来在库选择期间测定细胞活率，并进行自动细胞计数。台盼蓝是不能通过完整细胞膜进入细胞的染料。仅染色具有损伤的细胞膜的那些细胞，并标记为死亡。染色过程、细胞计数和结果的图形分析由cedex系统通过数字图像识别自动进行。其他测量参数是细胞大小、形态和聚集率。使用多重进样器，连续测量至多20个样品。质粒制备及用于精确比较转染中的质粒的质量检验诸如dna的量和质量的几种因素强烈影响转染效率和从而影响生产力。为了确保每种载体等同的起始条件，在转染前集中检验了所有载体的dna量和质量。-表达载体的同时制备按照厂家的说明通过highspeedmaxi质粒分离试剂盒(qiagengmbh,hilden)同时制备所有载体。-酚/氯仿纯化和乙醇沉淀通过酚/氯仿纯化同时纯化所有载体。将各500μg线性化的质粒dna与200μltris缓冲的50％(v/v)酚、48％(v/v)氯仿、2％(v/v)异戊醇溶液混合，13,000转/分钟离心1分钟。然后将上层水相转入新管，并与200μl96％(v/v)氯仿、4％(v/v)异戊醇混合，13,000转/分钟离心1分钟。再次将上相转入新管，并与1/10(总体积)的3m醋酸钠(ph5.2)和2.5倍(总体积)的100％乙醇混合。混合并在室温孵育反应5分钟后，13,000转/分钟离心混合物5分钟来沉淀dna。弃上清，用900μl70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，并在室温孵育5分钟。按最大速度进行最后的离心步骤5分钟后，弃上清，干燥沉淀，并重悬在无菌水中。-dna测定用biophotometer(eppendorf；hamburg)测定每种载体的dna量。dna测量总是通过1:20稀释在trisph8.0中来重复进行三次。-琼脂糖凝胶在0.8％琼脂糖凝胶上检验了每种质粒的dna质量。测定了dna降解、载体构象和dna浓度。用显示相当的数量和质量(凝胶上无dna降解、相似的超螺旋(ccc)形式、相似的dna量)的载体进行瞬时转染和稳定转染。瞬时转染按照厂家的说明通过amaxa96孔穿梭系统(lonzagmbh,德国)来将所有载体转染入cho-k1细胞。每种载体重复转染8次。按照1μg参考表达质粒(p5068或p5069)将转染载体的dna量归一化至等摩尔量/拷贝数。为了测定生产力，在转染后第4至7天通过一步法通用elisa(dianova)分析了无细胞的细胞培养物上清的igg效价。amaxa96孔穿梭系统：通过850转/分钟离心5分钟来沉淀培养在细胞培养瓶中的cho-k1细胞，并重悬在培养基中。将环状质粒按1μg参考表达载体p5068或p5069的等摩尔浓度铺板在96孔核转染板中。然后按每孔4x105细胞的浓度将细胞加入平板。通过amaxa程序dn-137进行转染。转染后孵育细胞10分钟，然后转入包含200μl培养基的96孔平底孵育板。然后静置培养细胞。在转染后第4至6天，用一步法通用elisa测定igg水平。稳定转染和重组cho细胞系的产生按照厂家的说明通过核转染技术(amaxabiosystems,lonzacologneag)进行稳定转染。转染前，通过限制酶sgrai线性化转染质粒。每种质粒转染两次或三次。每次转染使用5x106细胞和1.2pmol线性化质粒。(nucleofectorkitt,amaxa程序a33)。对于转染，将细胞重悬在nucleofector溶液t中，并分装入2ml管。加入质粒后，通过施加脉冲来进行转染。然后将细胞转入包含预热的4ml新鲜培养基和4ml条件培养基的t25组织培养瓶中。转染后24小时通过加入250μg/ml潮霉素b来施加选择压力。稳定库的产生通过amaxa核转染技术将载体转染入cho-k1细胞，并用潮霉素b或g418作为选择剂来选择稳定库。每个转染进行三次。为了产生稳定库，通过用sgrai限制消化来均一地线性化所有质粒。用amaxa的nucleofectorkitt进行稳定转染，每种质粒转染三次。按以下建立稳定库：每次转染使用5x106细胞和1.2pmol线性化质粒。将细胞重悬在溶液t中，并分装入2ml管。加入质粒后，通过施加脉冲来进行转染(amaxa程序a33)。在包含预热的4ml新鲜培养基和4ml条件培养基的t25组织培养瓶中静置培养所转染的细胞库。转染后24小时，施加选择压力：800转/分钟离心细胞5分钟，重悬在3ml含有300μg/ml潮霉素b的培养基中。转染后3天将细胞转入平底6孔板。然后培养细胞两周，直至细胞活率降至最低并再次升高至99％以上。经常用cedexhires系统(innovatis,bielefeld)测定细胞数目和活率。培养期间，通过离心去除细胞碎片，并总是将细胞重悬在3ml新鲜培养基中。用caliper机器人系统产生稳定克隆按上文所述将载体转染入cho-k1细胞。转染48小时后，施加选择压力(潮霉素b或g418)，并用自动化高通量克隆分离系统(sciclonealh3000工作站，caliperlifesciencesgmbh,mainz)将细胞按每孔350至700个细胞的浓度接种在384孔平底板上。10至14天后，用基于elisa的超高通量筛选(elsiauhts)针对igg水平筛选384孔板。从初步的筛选选择最好的产生克隆，并转入平底96孔板。3至6天后，在第二轮中针对igg水平筛选细胞。再次选择最好的产生克隆，并手动转入平底24孔板。再一个基于elisa的筛选步骤之后，选择最好的克隆，并转入平底6孔板。通过prota测量来测定6孔板中的igg水平，以鉴定最终的最好克隆，用于摇动的6孔板中的分批培养。库/单克隆的分批分析为了检测生产力和稳定性的差异，用casey细胞计数仪计数克隆/库的细胞数，并按3x105细胞/ml的浓度和3.0ml的总体积均一地接种入平底6孔板。所有分批培养物均培养12天，并在第4、7、9、11或12天针对人igg水平筛选细胞培养物上清。igg定量通过使用一步法通用elisa来测定瞬时实验中及筛选形式(384孔至24孔)中的igg效价。通过蛋白ahplc来测定稳定库和稳定单克隆在分批实验中的生产力。一步法通用elisa用一步法通用elisa(dianova)来测定来自细胞培养物上清的人igg水平。使用稀释缓冲液(pbs+5％(w/v)rpla1)，用抗-p-选择蛋白抗体(f.hoffmann-larocheag,basle,瑞士)的0.3125-20ng/ml范围的系列稀释物制备标准曲线。向链霉抗生物素蛋白包被的96孔mtp(streptawell,rochediagnosticsgmbh)中加入95μl含有0.5μg/ml生物素化f(ab’)2-抗-人fc抗体(jacksonlaboratories)和0.1μg/ml过氧化物酶缀合的f(ab’)2-抗-人fcγ抗体(jacksonlaboratories；suffolk)的抗体混合物。向平板中加入5μl1:20.000稀释的细胞培养物上清，并孵育1小时。用200μl洗涤缓冲液(pbs+0.05％(v/v)tween20)洗涤抗体包被的平板三次。向平板中加入100μlabts(rochediagnosticsgmbh,mannheim,德国)，并用492nm的参考波长在405nm测量吸光度。prota测量与一步法通用elisa组合，用基于hplc的层析通过蛋白a来测定分批分析的igg效价。facs用荧光激活细胞分选来测定稳定或瞬时转染的细胞的转染效率(根据表达gfp的细胞)或gfp表达水平。通常，用facscalibur流式细胞仪(bdbiosciences,sandiego,ca)测量每个克隆或库的5x106个细胞。用前向和侧向散射数据来测定细胞大小、活率和细胞形态。序列表<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司（f.hoffmann-larocheag）<120>表达载体组织、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途<130>30790wo<150>ep11195363.4<151>2011-12-22<160>17<170>patentin版本3.5<210>1<211>608<212>dna<213>人巨细胞病毒<400>1gttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcata60gcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc120ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatag180ggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtac240atcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg300cctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacg360tattagtcatcgctattagcatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggat420agcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgt480tttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgc540aaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctccgtttagtgaac600gtcagatc608<210>2<211>696<212>dna<213>人巨细胞病毒<400>2gttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcata60gcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc120ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatag180ggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtac240atcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg300cctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacg360tattagtcatcgctattagcatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggat420agcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgt480tttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgc540aaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctccgtttagtgaac600gtcagatctagctctgggagaggagcccagcactagaagtcggcggtgtttccattcggt660gatcagcactgaacacagaggaagcttgccgccacc696<210>3<211>2125<212>dna<213>人巨细胞病毒<400>3ctgcagtgaataataaaatgtgtgtttgtccgaaatacgcgttttgagatttctgtcgcc60gactaaattcatgtcgcgcgatagtggtgtttatcgccgatagagatggcgatattggaa120aaatcgatatttgaaaatatggcatattgaaaatgtcgccgatgtgagtttctgtgtaac180tgatatcgccatttttccaaaagtgatttttgggcatacgcgatatctggcgatagcgct240tatatcgtttacgggggatggcgatagacgactttggtgacttgggcgattctgtgtgtc300gcaaatatcgcagtttcgatataggtgacagacgatatgaggctatatcgccgatagagg360cgacatcaagctggcacatggccaatgcatatcgatctatacattgaatcaatattggcc420attagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggccattgca480tacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgcc540atgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttca600tagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgacc660gcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaat720agggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagt780acatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcc840cgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatcta900cgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtgg960atagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagttt1020gttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgac1080gcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaa1140ccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccggga1200ccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagag1260tgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcttatgcatgcta1320tactgtttttggcttggggtctatacacccccgcttcctcatgttataggtgatggtata1380gcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactcccctattggtgacgata1440ctttccattactaatccataacatggctctttgccacaactctctttattggctatatgc1500caatacactgtccttcagagactgacacggactctgtatttttacaggatggggtctcat1560ttattatttacaaattcacatatacaacaccaccgtccccagtgcccgcagtttttatta1620aacataacgtgggatctccacgcgaatctcgggtacgtgttccggacatgggctcttctc1680cggtagcggcggagcttctacatccgagccctgctcccatgcctccagcgactcatggtc1740gctcggcagctccttgctcctaacagtggaggccagacttaggcacagcacgatgcccac1800caccaccagtgtgccgcacaaggccgtggcggtagggtatgtgtctgaaaatgagctcgg1860ggagcgggcttgcaccgctgacgcatttggaagacttaaggcagcggcagaagaagatgc1920aggcagctgagttgttgtgttctgataagagtcagaggtaactcccgttgcggtgctgtt1980aacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagaca2040taatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtcc2100ttgacacggtttaaacgccgccacc2125<210>4<211>575<212>dna<213>人（homosapiens）<400>4cccgggctgggctgagacccgcagaggaagacgctctagggatttgtcccggactagcga60gatggcaaggctgaggacgggaggctgattgagaggcgaaggtacaccctaatctcaata120caacctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcg180gcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaa240aaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtag300aacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtg360gagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacag420tccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcg480gggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggag540aaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgtt575<210>5<211>1571<212>dna<213>人<400>5cccgggctgggctgagacccgcagaggaagacgctctagggatttgtcccggactagcga60gatggcaaggctgaggacgggaggctgattgagaggcgaaggtacaccctaatctcaata120caacctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcg180gcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaa240aaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtag300aacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtg360gagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacag420tccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcg480gggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggag540aaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgcca600gaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcc660cttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgag720cttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcct780cgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcac840cttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacct900gctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacact960ggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgt1020tcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagct1080ggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggca1140aggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgct1200gcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccaca1260caaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgg1320gcgccgtccaggcacctcgattagttctcgatcttttggagtacgtcgtctttaggttgg1380ggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttagg1440ccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttgg1500ttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtggtttaa1560acgccgccacc1571<210>6<211>1653<212>dna<213>人工序列<220><223>含有内含子a和最佳5'utr的人延伸因子-1α启动子<400>6cccgggctgggctgagacccgcagaggaagacgctctagggatttgtcccggactagcga60gatggcaaggctgaggacgggaggctgattgagaggcgaaggtacaccctaatctcaata120caacctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcg180gcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaa240aaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtag300aacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtg360gagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacag420tccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcg480gggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggag540aaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgcca600gaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcc660cttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgag720cttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcct780cgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcac840cttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacct900gctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacact960ggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgt1020tcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagct1080ggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggca1140aggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgct1200gcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccaca1260caaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgg1320gcgccgtccaggcacctcgattagttctcgatcttttggagtacgtcgtctttaggttgg1380ggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttagg1440ccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttgg1500ttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtga1560ggaattagctctgggagaggagcccagcactagaagtcggcggtgtttccattcggtgat1620cagcactgaacacagaggaagcttgccgccacc1653<210>7<211>2473<212>dna<213>褐家鼠（rattusnorvegicus）<400>7gatatttttatggaaattttaaaaaattctggtaagctatttaaaaaaatgaactttatt60atgaaactattgcccttttctctaaaaaacaacacaatttcacggaatatcctatgatta120attatgaccttttagccagttcccatattaagaatgagttatagatgactctctttaaaa180aattattcgatttaaaccatctgttttaaagcacagcatttgtgaataatgtgaagaact240tagaagtataatctactccaaggtctgatgtatttttcaaggccacgttaaagtgtatgc300ttgtaacagagtgcttacattcaagccaaatgttaatataacaatcctgaattcgtacat360aatgtgaataagacactcaactctatttaaatccagatctaaatagttacttttatctaa420atgtcaccatctgtttctacttagaataataaacttcttaaaggtcacgtatcgggctga480ttataaatcattataattataacaaaacagatgatttgtttaaaggtcacatcccgttcc540gtggtctttttagtcgaaataactattaatcttcattatgtttctgagaaagtttaaata600tcacgatttccacccataacagtcattatgagtcagtgggagtcatactgaatcagggta660ttttaactggaaattttttgaaaaacatgagtttttcttaaggtcaacatctggtcttat720aaacagaactgagatttatggccggtaattaccactggacgatttcccgggaaatcgcta780tgggaacggcccgttttgcaacttctttgaccaaaatatatcgagttaagcaacttttaa840ggccaagtcactatgactatgccaaataaagcaactattaaggtcatttcactatggaaa900cacccaattcagcaacattgtaagccaaatctccatagaaacctcataagtcagccaaaa960gtcaacgacctaccatctgtttctgcttatttctctaattttaattgcagactttgtcat1020tttatgttcctcttattctgagaatacgtgacgcccgctcgttaaggacaccgaaactgc1080ataagagtcacgttgactcagatgacctcgacatctggtctggtttttctgccaattttt1140cgtctaaactgtggaaaatccccacagatgacctacaaaactccgatttctattggacga1200tgaccgtcagacgtaggtataaatctcctaacgccgttcgggcagtcacagtcttcggat1260cggacgccgtggaacgcagttctcagcgaagaaggacaccgcccgactccagaagacacc1320gctgcccgaagaagagaagacttcatcggtaagagacccagcttctcctccccggagctt1380cggccacgccgctccacacccgggaaccgaggcttcggagcccgatacccggacagaagc1440ttctccccggccgctccacatcagggagccttgaccggcgagcctgctatccgggtagag1500actgtcctgcggccgcttcagcagctccacgatcgacgactgtgaccgttgagcccgccg1560tttaggcagaggctccgcttcaactaccctaccgacacattcgcggttcttcctccagaa1620catcttaccctctactcggccactctacaaggaccggtaagcaatttttatatactagac1680ttaaatgtttctatgatcattatgtggtgatggttctgtgtatgaagagagctaggtgga1740ggctatctttcgcttcggtgatggaacactactcttacaatggcggctctaatgacggtt1800ttctcaacatcggtggcggctctaattacggttctctcaacatcggtggtggtcttcgca1860tgcgagctctagattttttttatctgtaaaataagattgaagatggttgactgtgtatca1920attctttttcataggcatcagatcttgtcaaccgttattaatctttaggatcagatgaac1980ttgcgagctcgatatctagaatagaatccccgtgactgctaagatcatctccgttcatac2040accagatgttacaggccacggctaccattatgaatccaaacatgaacagaattgccagaa2100tggtgctcaatggttgtatccatctcgctggtctattttctctcaccgacgagaccccaa2160catcgagagttccgtttatttcatgagtcgaccttttagttcgtgatttattttctgtgt2220taagaaaatcagtgagatcaattattgtcagtctatacgattacaataatgtctgaatta2280tcgacgtgcataagatcgtctcacccggcgcagattccaacagatctttgtcgccatgcc2340ttccgttagaaaggtagtatagtaatatgataccagcaatgcacagaatcgaacatttga2400taacaattttgttgatgtcgtatatctgttaaaaattaataaatatattacagtcagttt2460aaacgccgccacc2473<210>8<211>129<212>dna<213>猿猴病毒40<400>8aacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcaca60aataaagcatttttttcaccattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatctta120tcatgtctg129<210>9<211>225<212>dna<213>黄牛（bostaurus）<400>9ctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccc60tggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtc120tgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggatt180gggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg225<210>10<211>73<212>dna<213>人<400>10caggataatatatggtagggttcatagccagagtaacctttttttttaatttttatttta60ttttatttttgag73<210>11<211>288<212>dna<213>猿猴病毒40<400>11agtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagca60tgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaa120ctccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcag180aggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggag240gcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcg288<210>12<211>81<212>dna<213>人<400>12catggcttcccgccggaggtggaggagcaggatgatggcacgctgcccatgtcttgtgcc60caggagagcgggatggaccgt81<210>13<211>798<212>dna<213>人工序列<220><223>绿色荧光蛋白编码核酸<400>13atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctac120ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacc180ctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag240cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttc300ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctg360gtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcac420aagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaac480ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgcc540gaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccac600tacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtcc720ggactcagatctcgagctcaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccggga780tccaccggatctagatga798<210>14<211>795<212>dna<213>人工序列<220><223>新霉素选择标记<400>14atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattc60ggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtca120gcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactg180caggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtg240ctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcag300gatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg360cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgc420atcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaa480gagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgac540ggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaat600ggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggac660atagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttc720ctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttctt780gacgagttcttctga795<210>15<211>1677<212>dna<213>人工序列<220><223>gfp-pest-neo融合多肽编码核酸<400>15atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctac120ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacc180ctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag240cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttc300ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctg360gtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcac420aagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaac480ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgcc540gaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccac600tacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtcc720ggactcagatctcgagctcaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccggga780tccaccggatctagacatggcttcccgccggaggtggaggagcaggatgatggcacgctg840cccatgtcttgtgcccaggagagcgggatggaccgtagtttaaacattgaacaagatgga900ttgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaa960cagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggtt1020ctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcgg1080ctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaa1140gcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcac1200cttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgctt1260gatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtact1320cggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcg1380ccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtg1440acccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattc1500atcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgt1560gatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatc1620gccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga1677<210>16<211>583<212>dna<213>脑心肌炎病毒<400>16ggcgcgcccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataa60ggccggtgtgcgtttgtctatatgtgattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtg120agggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctc180gccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttct240tgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgac300aggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccc360cagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgta420ttcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctgggg480cctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccg540aaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatggatcc583<210>17<211>655<212>dna<213>肠道病毒71<400>17ggcgcgcccccgaagtaacttagaagctgtaaatcaacgatcaatagcaggtgtggcaca60ccagtcataccttgatcaagcacttctgtttccccggactgagtatcaataggctgctcg120cgcggctgaaggagaaaacgttcgttacccgaccaactacttcgagaagcttagtaccac180catgaacgaggcagggtgtttcgctcagcacaaccccagtgtagatcaggctgatgagtc240actgcaacccccatgggcgaccatggcagtggctgcgttggcggcctgcccatggagaaa300tccatgggacgctctaattctgacatggtgtgaagagcctattgagctagctggtagtcc360tccggcccctgaatgcggctaatcctaactgcggagcacatgctcacaaaccagtgggtg420gtgtgtcgtaacgggcaactctgcagcggaaccgactactttgggtgtccgtgtttcctt480ttattcctatattggctgcttatggtgacaatcaaaaagttgttaccatatagctattgg540attggccatccggtgtgcaacagggcaattgtttacctatttattggttttgtaccatta600tcactgaagtctgtgatcactctcaaattcattttgaccctcaacacaatcaaac655当前第1页12