本发明涉及生物制药
技术领域：
，特别涉及一种猴头菌的培养基、生物转化菌丝体、生物转化菌丝体的提取物及其用途。
背景技术：
：猴头菌是一种猴头菌科蘑菇(真菌)，在中药用于治疗胃肠道疾病已经超过2000年的历史了，一系列小分子化合物如erinacines，被认为具有神经再生，并且可以透过血脑屏障修复受损神经组织。猴头菌还有抗溃疡，抗炎，抗微生物，免疫调节，提高肝功能，抗衰老，降低血糖和血脂，提高抗缺氧能力，增加心脏输出、和改善备注循环等作用，包含猴头菌的医用制剂在中国广泛使用。猴头菌丝体中的活性物质最重要的是多糖及糖蛋白，目前国内外对猴头多糖的研究表明，猴头菌多糖具有多种生物活性和药理作用，能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进溶血素的形成，抗白细胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突变和抗衰老等。因此，猴头菌多糖备受人们关注，成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域研究和开发应用的热点。《中国药典》记载了猴头菌丝体(参见2015年版一部的第1614-1615页)，本发明所述的猴头菌丝体就是该标准记载的猴头菌丝体。当前，从高等真菌及其培养物中进行筛选和发现活性成分，应用于抗肿瘤、抗病毒、和治疗糖尿病等，不仅成为国家重点研究新药的发展方向，也是当今世界各国开发生物医药的热点。但是，目前并未见到中药作为猴头菌的培养基经过生物转化后的新型药用菌丝体应用于降血糖的报道。女贞子(学名：fructusligustrilucidi)，别名：女贞实、冬青子、蜡树、鼠梓子，为木犀科植物女贞ligustrumlucidumait.的干燥成熟果实，具有滋阴清热、补肝益肾的功效，常用于腰膝酸软、耳鸣目眩、肝肾阴虚等病证的治疗。味甘苦，性凉，归肝肾经。有滋补肝肾、明目乌发的功效，临床主要用于眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白、目暗不明等症。女贞子含有多种化学成分，最先发现的是女贞子含有较高含量的齐墩果酸，后又发现了乙酰齐墩果酸、熊果酸等。红景天苷、酪醇、羟基酪醇、齐墩果酸、熊果酸和多糖是其主要活性成分。女贞子具有免疫调节、降血糖、降血脂等作用，其提取物乌苏酸、齐墩果酸有明显的降血糖作用。糖尿病是世界范围的最常见的流行性疾病之一，其死亡率在发达国家仅次于心血管疾病、恶性肿瘤，成为第三位的致死病因疾病。糖尿病的治疗手段目前常采用胰岛素和化学合成降糖药物，但存在多种不良反应和毒副作用。由于该病的并发症会导致较高的死亡率，人们迫切需要找到一种有效低毒的治疗药物。国内外学者开始将寻求新的降血糖药物的目光投向中国传统中医药，中药在治疗糖尿病方面不同于化学合成药物，不仅能发挥良好的降血糖等治疗效果，中药及其有效成分由于本身为天然活性物质，还能够较好的克服西药的缺点，许多中药在治疗糖尿病的同时可以起到防治糖尿病并发症的作用。生物转化“菌丝体”是指利用菌丝体(包括真菌)的代谢功能，使有机物分解的生物化学反应过程。以适宜的培养基为营养，通过菌丝体的生长代谢和生命活动产生丰富的次生代谢产物。借鉴中医药组方思想，将单味中药、具有类似或协同作用的中药作为部分培养基进行菌丝体转化，不同菌株诱变“次生”代谢不同的生物活性成分，再实行“定向培养、双向转化”生物转化工艺，可获得不同生物活性物质原料，目的是增强功效或者降低药物毒副作用。技术实现要素：本发明旨在克服现有技术的不足，跨学科创新，结合微生物学、中药学等多学科，提供一种新原料(女贞子)作为猴头菌的培养基成分，即本发明的目的在于提供一种猴头菌的培养基、生物转化菌丝体、生物转化菌丝体的提取物及其用途。所述生物转化菌丝体的提取物的制备方法简单，成本较低，提取物用于制备降血糖药物。基于上述目的，本发明的内容包括一种猴头菌的培养基，包括基础培养基和女贞子，每100份的培养基中包括基础培养基70～50份，女贞子30～50份；所述基础培养基包括如下重量份的各组分：麦麸490～350份，玉米粉140～100份，谷糠70～50份，水400～500份。优选地，所述基础培养基包括如下重量份的各组分：麦麸420份，玉米粉120份，谷糠60份，水450份。优选地，每100份的培养基中包括基础培养基60份，女贞子40份；所述基础培养基包括如下重量百分数的各组分：麦麸70％、玉米粉20％、谷糠10％。本发明还提供一种生物转化菌丝体，将猴头菌类菌株接种至所述的培养基中，在20～27℃下，培育30～40天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体。优选地，所述猴头菌类菌株为猴头菌科真菌猴头菌hericiumerinaceum(bull.exfr.)pers。优选地，所述生物转化菌丝体为猴头菌科真菌猴头菌hericiumerinaceum(bull.exfr.)pers.的菌丝体与其附生含有女贞子成份的固体培养基的干燥混合物。本发明还提供一种生物转化菌丝体的提取物，所述提取物通过以下步骤制备得到：(1)将所述的生物转化菌丝体进行水提，50-70℃下用水浸泡2-3次，每次浸泡2-5小时，水的重量为生物转化菌丝体重量的6～10倍，得到提取液；(2)将步骤(1)中的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在50-70℃条件下抽真空干燥，即得生物转化菌丝体的提取物。优选地，所述用水浸泡的温度为60℃；将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥。本发明还提供了一种所述的生物转化菌丝体的提取物在制备降血糖药物中的用途。本发明的有益效果有：(1)本发明的生物转化菌丝体的提取物采用简单的处理工艺制备得到，其抗肿瘤效果就达到预料不到的技术效果，经生物转化的“菌丝体”的抗肿瘤效果好于所有的天然植物来源的中药材，如果进一步分离纯化富集有效成分，其降血糖效果将更好，可用于制备降血糖药物。(2)猴头菌是一种药用真菌，能很好地吸收培养基中营养，彻底转化培养基，产生新的活性物质及代谢物，为此，本发明将中药女贞子加入到猴头菌的基础培养基中，作为猴头菌的培养基成分之一，并对中药材女贞子掺入猴头菌的培养基的比率进行调配，最终选择中药材女贞子最佳掺入的比率为40％，女贞子占40％比率时，菌丝体生长情况较好，齐墩果酸、熊果酸含量较高。(3)猴头菌对女贞子进行中药菌丝体转化，得到新的菌丝体，本发明对所得的生物转化菌丝体进行提取，得到的生物转化菌丝体的提取物进行了体外降血糖筛选试验，水提样品以ic50值和emax为评价指标，试验结果表明：生物转化菌丝体的提取物有良好的降血糖作用，体外降血糖作用由强到弱为：生物转化菌丝体＞女贞子药材＞猴头菌丝体≈猴头菌丝体+女贞子药材，该生物转化菌丝体的提取物降血糖作用明显优于猴头菌丝体或女贞子的降血糖作用，而且生物转化菌丝体的ic50值大于单独女贞子药材和单独猴头菌丝体的ic50值之和，emax大于单独女贞子药材和单独猴头菌丝体的emax之和，这说明猴头菌中丰富的酶系通过结构修饰或降解作用，把女贞子中的活性成分转化成活性更强的成分，或增强了女贞子中的活性成分(如齐墩果酸、熊果酸)的产量，或把非活性成分转化成活性成分，活性成分相互促进达到增强降血糖功效的目的；同时进行四氧嘧啶性糖尿病小鼠模型试验，试验结果表明：生物转化菌丝体的提取物对四氧嘧啶性糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用，因此，生物转化菌丝体的提取物可用于制备降血糖药物。(4)本发明低温水浸泡生物转化菌丝体，在50-70℃下水浸泡，无高温破坏，既能溶解有效成分且又不破坏有效成分；50-70℃减压浓缩，不会破坏有效成分，特别是活性酶类物质；为了不影响有关活性物质，本发明优选采用60℃条件下抽真空干燥。具体实施方式实施例1一种生物转化菌丝体的提取物，其制备方法包括如下步骤：(1)取农副产品麦麸490g、玉米粉140g、谷糠70g，以及中药材女贞子粗粉(女贞子)300g，混匀，加入400g水拌匀，即得猴头菌的培养基；再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在27℃条件下转化培养40天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；(2)取生物转化菌丝体，70℃水浸泡2次，每次浸泡2小时，水的重量为生物转化菌丝体重量的6倍，得到提取液；(3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得生物转化菌丝体的提取物(代号：hn-3)。实施例2一种生物转化菌丝体的提取物，其制备方法包括如下步骤：(1)取农副产品麦麸420g、玉米粉120g、谷糠60g，以及中药材女贞子粗粉(女贞子)400g，混匀，加入450g水拌匀，即得猴头菌的培养基；再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在20℃条件下转化培养40天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；(2)取生物转化菌丝体，60℃水浸泡3次，每次浸泡3小时，水的重量为生物转化菌丝体重量的8倍，得到提取液；(3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得生物转化菌丝体的提取物(代号：hn-4)。实施例3一种生物转化菌丝体的提取物，其制备方法包括如下步骤：(1)取农副产品麦麸350g、玉米粉100g、谷糠50g，以及中药材女贞子粗粉(女贞子)500g，混匀，加入500g水拌匀，即得猴头菌的培养基；再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在25℃条件下转化培养30天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；(2)取生物转化菌丝体，50℃水浸泡3次，每次浸泡5小时，水的重量为生物转化菌丝体重量的10倍，得到提取液；(3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得生物转化菌丝体的提取物(代号：hn-5)。实施例4女贞子掺入比例试验基础培养基投料以干料计，比率固定为：麦麸70％、玉米粉20％、谷糠10％(不包括水)。本发明把中药材女贞子作为培养基成分之一，中药材女贞子掺入的比率分别占猴头菌培养基总量的30％、40％、50％，设计实验方案，总投料5000g，分别按上述实施例1、实施例2、实施例3所述的步骤配制培养基，加水500g混匀、灭菌、接种、培养，平行对照，培养条件完全一致，培养过程中观察菌丝体生长状况、生长周期、污染情况、生长速度，挖瓶后烘干称重计算收率，检测样品中的纤维素酶、麦角甾醇含量(考察转化是否彻底)、总黄酮含量、野黄芩苷含量，干燥后的样品分别标注为hn-3、hn-4、hn-5。试验结果统计如下表1所示：表1分组编号hn-3hn-4hn-5培养前物料总重(g)5000g5000g5000g培养过程中污染比率(％)9.5％8.0％15.2％生长周期(天)38天40天44天生长速度(mm/天)4.21mm/天4.00mm/天3.63mm/天纤维素酶含量(u/g)162u/g182u/g147u/g麦角甾醇含量(mg/g)0.69mg/g0.82mg/g0.63mg/g总黄酮含量1.31％1.61％1.66％齐墩果酸、熊果酸总含量1.02％1.27％1.16％试验结果表示：女贞子占50％时污染率高、生长速度慢、生长周期长，纤维素酶与麦角甾醇含量低，生物转化不彻底；而女贞子占30％时生长速度较快、生长周期短，但齐墩果酸与熊果酸总含量和总黄酮含量低；女贞子占40％比率时最为合适，菌丝体生长情况较好，兼顾各优势，为最佳比率。实施例5四氧嘧啶性糖尿病小鼠试验1.试验材料1.1实验动物小白鼠，雌雄各半，实验用健康清洁级，4～5周龄，体重18～22g，购自北京医科大学实验动物中心。1.2供试品样品编号：htj表示猴头菌丝体，nzz表示女贞子中药材，htj+nzz表示60％的猴头菌丝体+40％女贞子中药材，hn-3、hn-4、hn-5分别表示猴头菌的培养基中女贞子掺入比例为30％、40％、50％的生物转化菌丝体。上述样品平行操作进行如下处理：60℃水浸泡3次，每次浸泡4小时，水的重量为样品重量的10倍；将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得六种提取物，分别对应编号htj，nzz，htj+nzz，hn-3，hn-4，hn-5。1.3主要试剂四氧嘧啶购自sigma公司，超氧化物歧化酶(sod)的测定试剂盒购自南京建成生物研究所，总抗氧化能力(t-aoc)的测定试剂盒购自南京建成生物研究所，糖化血红蛋白(hbal-c)的测定试剂盒购自南京建成生物研究所，丙氨酸转氨酶(alt)的测定试剂盒购自南京建成生物研究所。1.4主要仪器血糖仪(日本京都ii型，arkrylnc公司)、超净台、组织匀浆机(kikawerke)、旋转蒸发仪(re52-98，上海亚荣生化仪器厂)、旋转蒸发仪(r-1005，郑州长城科工贸有限公司)、数字控温电热套(98-1-c，天津市泰斯特仪器有限公司)、电热恒温水浴锅(dk-98-iia，天津市泰斯特仪器有限公司)、移液枪(eppendorf)、磁力加热搅拌器(78-1，江苏省金坛市医疗仪器厂)、生物安全柜(香港hfd公司)，以及电热鼓风干燥箱(101，天津市宏诺仪器有限公司)。2.试验方法2.1糖尿病模型的建立和分组方法四氧嘧啶性糖尿病小鼠模型的建立，小白鼠适应性饲养3～7d后，禁食(不禁水)12h，称量空腹体重、尾静脉取血测定血糖浓度。注射四氧嘧啶，建立高血糖模型：分两次注射，浓度在1％～5％之间，第一次注射剂量要高于第二次注射剂量，注射2h后补充5％葡萄糖。试验动物分组及处理方法：小白鼠140只，分7组，每组20只，雌雄各半，分组方法如下：正常组，htj组，nzz组，htj+nzz组，hn-3组，hn-4组，hn-5组。正常组灌胃等体积的生理盐水，其他组分别灌胃等体积的相对应的供试品提取物。试验时间为4星期，每天测量饮水量和尿量，每星期称一次体重，每星期取空腹尾静脉血，用血糖仪测定血糖浓度。2.2小鼠饮水量的测定试验过程中每天测定各组小鼠的饮水量，测量前灌给相同体积的水量，24h后记录剩余水量，两者之差就是该组小鼠每天的饮水量。2.3血糖的测定试验过程中每星期测定一次血糖，测定血糖前小鼠禁食(不禁水)12h，用无菌针头刺破尾静脉采血，取血清按照葡萄糖氧化酶法，用日本京都血糖仪及试纸测定血糖，直接读取数据。2.3.1正常小鼠血糖的测定取18～22g小鼠30只，雌雄各半，随机均分为3组。每组每天分别灌胃等体积的相应供试品400mg/kg，正常组灌胃等量生理盐水，连续7d，每日一次。末次给药后2h尾静脉取血测定血糖。2.3.2高血糖小鼠血糖的测定取18～22g小鼠110只，雌雄各半，随机取10只为正常组，其余腹腔注射四氧嘧啶(260mg/kg)，造成糖尿病模型。注射前禁食12h，注射后72h尾静脉取血测定血糖，去除未造成模型(禁食12h，血糖低于11.1mmol/l)的动物，再分3组，组间平均血糖值相差不应大于1.11mmol/l。计七组，即正常组和htj组，nzz组，htj+nzz组，hn-3组，hn-4组，hn-5组，灌胃给药，每日1次，连续28d，末次给药后2h尾静脉取血测定血糖。3.试验结果3.1提取物对糖尿病小鼠体重的影响如表2所示，建模前，各组小鼠体重之间无明显差异；建模后(给药前)，糖尿病组小鼠体重明显低于正常组(p<0.05)，揭示建模成功；给药第7、14d，各组小鼠体重明显低于正常组(p<0.05)；给药第7、14d，nzz组，htj+nzz组，hn-3组，hn-4组，hn-5组小鼠体重明显高于htj组(p<0.05)；建模后nzz组，htj+nzz组，hn-3组，hn-4组，hn-5组小鼠体重之间无明显差异(p>0.05)。表2提取物对糖尿病小鼠体重(g)的影响3.2提取物对糖尿病小鼠饮水量的影响如表3所示，建模前，各组小鼠饮水量之间无明显差异；建模后(给药前)，糖尿病组小鼠饮水量明显高于正常组(p<0.05)，揭示建模成功；给药第7、14d，各组小鼠饮水量明显高于正常组(p<0.05)；给药第7、14d，htj+nzz组、hn-3组、hn-4组和hn-5组小鼠饮水量明显低于htj组和nzz组(p<0.05)；给药第7、14d，hn-4组、hn-5组小鼠饮水量明显低于htj+nzz组和hn-3组(p<0.05)。表3提取物对糖尿病小鼠饮水量(ml)的影响3.3提取物对正常小鼠血糖的影响如表4所示，各组小鼠给药后的血糖值明显低于正常组(p<0.05)；各组给药后小鼠的血糖值明显低于给药前的血糖值(p<0.05)；hn-4组给药后的血糖值明显低于其他各组(p<0.05)。表4提取物对正常血糖的影响3.4提取物对四氧嘧啶小鼠血糖的影响测定如表5所示，第0、7、14、28d血糖值，在治疗前各糖尿病组之间血糖值无明显差异(p>0.05)，与正常组相比糖尿病组血糖值明显升高(p<0.01)；第0d，各糖尿病组的禁食血糖很高，第7d，hn-3组、hn-4组的血糖明显下降(p<0.05)，相反htj组到第14d都无明显下降；第21d，hn-4组的血糖下降了49.0％，hn-5组的血糖下降了30.7％，htj组的血糖只下降了17.98％；第28d，hn-4组的血糖明显下降(p<0.01)，达到了61.5％，血糖值接近正常水平，htj组仅下降了49.13％。表5提取物对四氧嘧啶小鼠血糖的影响结果表明hn女贞子转化物能明显改善四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的症状；hn-4号提取物能够显著降低四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠的血糖，这些作用可能与其降血糖作用有关。所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12