一种降解酱油中生物胺的酶的制作方法

本发明涉及一种降解酱油中生物胺的酶，属于发酵技术领域。

背景技术：

生物胺是生物体内产生的一类低分子质量含氮有机化合物的总称，它们是生物体合成荷尔蒙、核苷酸、蛋白质的前体。生物体自身合成的适量生物胺具有促进生长、增强代谢活力、加强肠道免疫系统、控制血压和消除自由基等生理功能，但是摄入过量外源生物胺会引起血管、动脉和微血管的扩大，导致生物体的不良反应，如高血压、头疼、腹部痉挛、腹泻和呕吐等。食品中常见的生物胺主要包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺和组胺等。

根据检测市售31种酱油样品，酱油样品的总生物胺含量的范围为41.18-1898.17mg/l，其中组胺、酪胺是酱油样品中含量最高的生物胺，为0-490mg/l、0-650mg/l，其次为腐胺和苯乙胺，含量范围分别为0-595.98mg/l、0-334.96mg/l，fda规定食品中生物胺总量≤1000mg/kg，而多数市售酱油总量为最高标准的1.5～2倍，组胺≤100mg/kg，而市售酱油为最高标准的4～5倍。酱油一般都是在非密闭环境中生产，杂菌控制十分困难，无法保证生产菌种的绝对单一性，因此，通过控制产氨基酸脱羧酶的微生物来控制生物胺的方法有限。目前，酶法降解生物胺最具可行性，不仅不损害食品营养，还不产生新的毒性物质，现有的生物胺降解酶有胺氧化酶，胺氧化酶包括伯胺氧化酶、二胺氧化酶、单胺氧化酶，其中伯胺氧化酶只能降解苯乙胺，最适ph7.0，二胺氧化酶只对二胺尤其是对组胺起作用，最适ph8.5，单胺氧化酶能降解酪胺、色胺，最适ph6.0～7.0，这几个酶存在3个共性问题：1)降解的生物胺类型少；2)降解效率低；3)最适ph偏中性，不适合应用于酸性发酵食品中，应用到酱油中的酶需要耐盐，耐酸。

多铜氧化酶是一类可通过其光谱学性质，同源性的序列及与底物的反应机理定义的一类含铜氧化酶家族，它将生物胺催化氧化成对应的醛、氨和水，达到降低生物胺含量的目的。含多铜氧化酶基因的菌可代谢产生多铜氧化酶，将其所产生的多铜氧化酶进行粗提后加入酱油中，这将大幅度降低酱油中的生物胺，同时降低生产成本并提高食品安全性。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明创造性地采用酶法来降低生物胺，即筛选含有多铜氧化酶基因的菌株，将其所产生的多铜氧化酶进行粗提后加入酱油中，从而提供一种降解酱油中生物胺的酶及一种降低发酵食品中生物胺的方法。

本发明的第一个目的是提供一种多铜氧化酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述多铜氧化酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明的第三个目的是提供携带该基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达该多铜氧化酶的重组菌。

本发明的第五个目的是提供一种降低酱油中生物胺含量的方法，所述方法是向酱油中加入所述多铜氧化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述多铜氧化酶以酶液的形式存在。

在本发明的一种实施方式中，所述多铜氧化酶以细胞为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述多铜氧化酶以10～20u/ml的添加量加入至酱油中。

本发明还提供所述多铜氧化酶在食品、化工、医药领域的应用。

有益效果：本发明提供的多铜氧化酶粗酶，对酱油中的色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺这几种生物胺具有不同程度的降解作用，其中酱油中含量最多的酪胺浓度为540.71mg/l，添加本发明提供的多铜氧化酶粗酶后，24小时内就降低了100mg/l，与现有的纯酶降解生物胺混合液(24h降低58.57mg/l)的技术相比，本发明具有在相同时间内降解效率高的优势。

附图说明

图1为降生物胺菌株的颜色筛选示意图；

图2为bacillusamyloliquefaciens中多铜氧化酶基因的pcr扩增结果；m，marker；1，阴性对照；2，bacillusamyloliquefaciens中多铜氧化酶；

图3为多铜氧化酶在不同温度下的相对酶活；

图4多铜氧化酶在不同ph下的相对酶活；

图5金属离子对多铜氧化酶酶活的影响；

图6盐浓度对多铜氧化酶酶活的影响；

图7乙醇浓度对多铜氧化酶酶活的影响。

具体实施方式

实施例1含多铜氧化酶基因的菌株的高通量筛选

1、不产生物胺菌株的高通量筛选

将酱醪样品用无菌生理盐水混匀，稀释不同倍数涂布于lb培养基，37℃，静置过夜培养后，选择单菌落合适的平板。预先在每个孔板中加入1mllb培养基，用qpix420自动挑菌仪将单菌挑取至96孔板，37℃静止培养24h。再转接到生物胺检测液体培养基中(空白对照不接菌)，37℃静置培养48h后观察颜色变化，和空白对照颜色一样不变色的为阳性，变紫色的为阴性。通过采用高通量筛选技术，从8000个菌株中筛选获得了70株阳性菌株。

2、降生物胺菌株的筛选

将70株阳性菌株接种到mrs培养基中，37℃静置培养24小时，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗两遍，然后添加到生物胺混合液中，共培养48h，离心收集上清液，加入新制cu(oh)2加热反应1min。含有多铜氧化酶基因的菌株，能够将生物胺催化氧化成对应的醛、氨和水，根据醛和新制cu(oh)2反应生成砖红色的沉淀cu2o这一现象，以反应液出现砖红色沉淀的为具有降解生物胺能力的阳性菌株，不变色的为阴性。如图1所示，试管1只含有生物胺混合液的空白对照；试管2为未出现砖红色沉淀的样品，和对照一样为蓝色；试管3为出现砖红色沉淀的样品。根据反应液呈现的砖红色沉淀的效果，筛选获得1株菌株，

3、利用菌落pcr验证上述步骤筛选得到的菌株是否含有编码多铜氧化酶的基因

跟据16srdna测序结果，鉴定所筛到的降生物胺菌株为bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)，根据ncbi中的bacillusamyloliquefaciensstraincmw1(ncbireferencesequence:nz_df836084.1)中的多铜氧化酶的基因序列，设计引物，验证bacillusamyloliquefaciens是否含有多铜氧化酶基因。

引物：上游：atggcacttgaaaaatttgc

下游：ttactgcttttctgtgacgtc

pcr反应程序：95℃下先预变性3min，然后进行以下循环：95℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min30s；34个循环后，72℃下延伸10min，4℃下保温。

以bacillusamyloliquefaciens的基因组为模板，pcr扩增，扩增结束后由1％琼脂糖凝胶电泳显示扩增结果，如图2所示，成功扩增获得1500bp左右的条带，与目的条带大小一致，经测序验证，bacillusamyloliquefaciens中含有多铜氧化酶基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

实施例2多铜氧化酶粗酶对酱油中生物胺的降解

将所筛含多铜氧化酶基因的菌株，接种到含0.5～1mmol/lcu²⁺的lb培养基中，37℃，220rmp/min，培养18～24h，培养完成后，7000～10000r/min，离心5～10min收集菌体，重复2～3次，进行超声破碎。将得到的破碎液过滤离心，上清液经过3kd蛋白超滤管浓缩，得到浓缩3～5倍的粗酶液。

取2ml粗酶液与2ml某品牌市售酱油进行混合，将混合物置于37℃培养箱中静置48h后，于4℃、10000r/min离心5min取上清液，用hplc法检测生物胺的含量取2ml加热失活的粗酶液与2ml同品牌市售酱油进行混合作为对照组。结果如表1所示。

表1酱油中生物胺的含量

实施例3多铜氧化酶粗酶的酶学性质

(1)多铜氧化酶的最适温度

将粗酶液与底物分别在25、35、40、45、50、55、60、70、80℃水浴条件下反应10min，测定酶活，确定酶的最适反应温度，以最高的酶活为100％。结果如图3所示，当温度为45～55℃时，酶较稳定，活力能保持在最适温度下酶活的90％以上。

(2)多铜氧化酶的最适ph

配制不同ph的缓冲液：柠檬酸盐缓冲液ph2.2～6.0、磷酸盐缓冲液ph6.0～8.5。在55℃，不同ph下反应10min，反应结束测定不同ph条件下的酶活，确定最适反应ph。以最高的酶活为100％。结果如图4所示，ph为4时酶活最高，ph为3.5时，酶活还能保持在最适ph下酶活的62％以上。

(3)金属离子对多铜氧化酶酶活的影响

将粗酶液与终浓度为1mmol/l的金属离子缓冲液混合，在37℃条件下保温10min，测定酶活力。以未添加金属离子测得酶活为100％，确定金属离子对酶活力的影响。cu²⁺、ni²⁺对酶活有促进作用，在cu²⁺促进下酶活提高65％，在ni²⁺促进下酶活提高23％，其余测定的金属离子有不同程度的抑制作用。

(4)盐浓度对多铜氧化酶酶活的影响

将粗酶液在不同质量分数的nacl缓冲液中保温1h(对照组不添加nacl)，测定酶活，以未添加nacl测得酶活为100％，计算在不同nacl质量分数下的相对酶活，确定nacl对酶活稳定性的影响。如图6所示，随着nacl浓度的增加酶活降低。当nacl质量分数达到15％(na⁺2.5mmol/l)时，nacl对多铜氧化酶有激活作用，使酶活提高了80％。

(5)乙醇对多铜氧化酶酶活的影响

将粗酶液在不同体积分数的乙醇缓冲液中保温1h(对照组不添加乙醇)，测定酶活，以未添加乙醇测得酶活为100％，确定乙醇对酶活稳定性的影响。结果显示(图7)，在乙醇浓度为2.5％时，相对酶活达57％；乙醇浓度为5％时，相对酶活为30％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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