本发明提供了一种新型金属离子耐受性角蛋白酶的基因挖掘、表达、性质研究及其在生物法合成纳米银中的应用方法，属于工业生物技术领域。
背景技术：
角蛋白酶是能够特异性降解羽毛、羊毛、毛发、指甲等富含角蛋白的特殊的蛋白酶类。其能够降解不溶性的角蛋白而区别于一般的蛋白酶的特性使角蛋白酶能够广泛地运用于畜牧行业、饲料行业、制革行业、医药行业中。我国早期对微生物角蛋白酶的研究主要集中在角蛋白酶产生菌的选育、角蛋白酶的分离纯化和性质研究、角蛋白酶的应用上。2003年，吉林大学的梁斌等人首次成功将来自于地衣芽孢杆菌l-25的角蛋白酶基因进行了分离并且成功在枯草芽孢杆菌中实现了外源表达，自此，角蛋白酶的基因分离表达等分子生物学和基因工程研究开始受到越来越多国内研究者的关注。近几年来，不同来源的角蛋白酶在芽孢杆菌、大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母表达系统中重组角蛋白酶的表达上均取得了一定成功，但是表达水平以及重组角蛋白酶的降解活性并不理想，难以大量用于工业发酵，这也限制了角蛋白酶的工业应用。角蛋白酶早期主要运用于角蛋白废弃物的处理、皮革脱毛、饲料生产、洗涤剂中，近几年来，研究者将目标转向了角蛋白酶应用于管道毛发废弃物的清理，皮肤、指甲相关的药物，个人洗护用品等领域中。印度的一个科研团队从bacillushaloduransppks-2野生菌中纯化获得两个角蛋白酶，发现其中一个具有很高的二硫键还原活性(appliedmicrobiologyandbiotechnology,2010,87,2:625–633)；表明角蛋白酶具有良好的还原能力。
近年来，随着纳米银制备技术的不断发展，纳米银的应用越来越广泛。银纳米材料具有特殊的物化性质，被广泛用于工业、医药等重要领域。在工业生产中，纳米银与银相比具有更好的催化活力，且加入纳米银后可有效改善产品的光学、热学、磁学等特性。在医药领域，纳米银常作为药物用于疾病的预防和治疗。纳米银粒子的制备方法有物理法、化学法和生物法。物理法包括真空沉积法、球磨法、蒸发冷凝法、等离子法等方法来制备，适用于大规模制备但是对设备要求较高，反应能耗高，产率低。化学法通过化学还原试剂将溶液中的银离子还原为单质银，然后聚集变为纳米级别的银粒子，反应中经常需要引入其它添加剂，如分散剂，稳定剂、保护剂等。这些添加剂中不乏毒性较大、污染严重的有机溶剂，因而不利于所制纳米银的广泛应用，尤其限制了其在医药领域中的应用(cn106180753a)。而生物法合成纳米银，主要通过生物样品中的酶类、蛋白质等物质还原出单质银，并且自身可以作为稳定剂制备得到纳米银粒子，因其方法简单易行、绿色环保、反应条件温和、低成本，以及制备得到的纳米粒子具有良好的生物相容性而受到国内外诸多研究者的关注。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新型高金属离子耐受性角蛋白酶的基因挖掘、表达、性质研究及其生物法合成纳米银的应用方法，属于工业生物技术领域。提供包含本发明基因的质粒及包含该表达质粒的宿主细胞，利用该重组菌株表达生产角蛋白酶的方法，以及利用该角蛋白酶生物法合成纳米银的应用方法。
本发明的技术方案是：
基于宏基因组技术，以皮革厂堆放皮毛的土壤宏基因组dna为模板，以角蛋白酶的保守序列进行简并引物设计并且进行pcr扩增，筛选目的角蛋白酶基因，然后根据测序结果进一步设计引物通过pcr技术扩增获得完整的基因编码序列。将获得的完整编码序列构建到表达载体上，例如枯草-大肠穿梭质粒pma5，pet系列载体，ppic系列载体等。将构建好的重组质粒转化至宿主菌枯草芽孢杆菌感受态细胞中、但不局限于枯草芽孢杆菌，还包括大肠杆菌，丝状真菌，谷氨酸棒杆菌，钝齿棒杆菌，毕赤酵母，酿酒酵母等，经发酵培养后实现角蛋白酶的异源表达。对该角蛋白酶进行酶学性质分析，利用其高金属离子耐受性及高还原能力的特性应用于生物法合成纳米银的制备，并对制备得到的纳米银进行多方面的表征和抑菌活性验证。
(1)宏基因组技术筛选角蛋白酶基因
从皮革厂堆放皮毛的地方收集土样，用土壤基因组提取试剂盒提取样品总dna。根据角蛋白酶的保守序列设计简并引物进行pcr扩增反应，扩增获得的片段测序后与ncbi数据库进行比对，根据结果再进一步设计引物，扩增获得完整的角蛋白酶基因编码序列。该方法基于宏基因组技术，结合数据库中角蛋白酶的保守序列进行直接扩增筛选，与基于宏基因组文库构建筛选方法相比，具有操作方法简单易行，筛选周期短等优点。
(2)角蛋白酶枯草芽孢杆菌表达体系的建立
根据角蛋白酶基因序列设计带有酶切位点的引物，通过pcr扩增获得角蛋白酶编码基因序列：
上游引物：5’-cgggatccatgagaggcaaaaaggtatgg-3’
下游引物：5’-cgacgcgtttactgagctgccgcctgta-3’
pcr扩增反应在40μl体系中进行，反应体系中加入20μlprimestarhs，17μlddh2o，1μl模板dna，上下游引物各1μl。反应条件为在95℃预变性5min后开始循环：95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。
pcr产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化，回收产物克隆至载体构建重组质粒，将质粒转化至克隆宿主，挑取多个阳性转化子至带有相应抗生素的lb液体培养基中以37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后对质粒进行pcr、双酶切、测序验证。将正确验证的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌表达宿主菌中，并且涂布带有相应抗生素的固体培养基，用pcr验证的方法进一步筛选阳性转化子。将成功构建的角蛋白酶产生菌在固体培养基上划线分离出单菌落，然后挑取至10ml液体lb培养基中过夜培养，次日以2％的接种量接种至30mltb发酵培养基中，进行角蛋白酶产酶研究。
(3)重组角蛋白酶酶活检测方法
1％角蛋白底物的配制：首先配制0.1mtris-hcl(ph＝9.0)的溶液，然后加入5％的可溶性角蛋白母液，再加入去离子水使tris-hcl溶液浓度稀释为0.05m，并且使角蛋白溶液浓度稀释为1％。酶反应：取适度稀释的酶液100μl，加入0.1ml底物溶液，置50℃水浴准确反应15min，反应结束后立即加入200μl5％的tca终止反应。对照组中先加入200μltca，酶反应结束后再加入0.1ml底物溶液。上述反应后以12000rpm离心5min，吸取200μl上清到新的1.5ml的ep管中，加入1ml0.4m的na2co3，再加入200μl福林酚，置40℃水浴显色反应20min后在680nm处检测吸光度值。酶活定义：在上述反应条件下，酶液水解底物在680nm下产生0.01的吸光度的差别定义为一个酶活单位u。酶活计算公式：u＝(od680实验组-od680对照组)×100×稀释倍数
(4)重组角蛋白酶的酶学性质研究
将重组角蛋白酶进行酶学性质研究，重点研究其对化学试剂以及金属离子耐受性的性质：
a.金属离子对重组角蛋白酶酶活的影响
在酶活测定反应体系中分别添加不同金属离子(mg2+、ca2+、zn2+、mn2+、co2+、ni2+、fe2+、cd2+、ba2+、li+、fe3+、al3+、pb2+、ag+)，使其终浓度分别达到1mm和5mm，分别测定酶活力，以未添加金属离子的反应管作为100％。
b.化学试剂对重组角蛋白酶酶活的影响
在酶活测定反应体系中分别添加pmsf、edta、dtt、β-巯基乙醇以及不同种类的表面活性剂sds、tween20、tween80、tritonx-100、tritonx-114以及h2o2、dmso使其终浓度分别达到1mm、5mm以及1％，按照酶活测定方法分别测定酶活力，以未添加化学试剂的反应作为100％。
c.角蛋白酶还原力分析
300μl适当稀释的样品角蛋白酶酶液中加入300μl0.2mpbs(ph6.6)和300μl1％(w/v)铁氰化钾溶液，置于50℃水浴中反应20min。然后加入300μl10％(w/v)tca，以4000rpm离心10min。最后吸取200μl上清液加入到800μl0.01％(w/v)三氯化铁溶液中。在30℃反应10min,测定700nm下的吸光度值。吸光度值越高，就具有越高的还原能力。对照为不含角蛋白酶的样品溶液。
(5)角蛋白酶生物法合成纳米银
将2ml过滤除菌的角蛋白酶溶液加入到50ml1mm的硝酸银溶液中，不添加任何还原剂和稳定剂，于37℃振荡反应，发现反应液由无色逐渐变成较深的橙黄色，即为制备得到的纳米银溶液。将该方法制备得到的纳米银进行紫外-可见光光谱分析、动态光散射分析、透射电镜分析、傅里叶红外分析等多方面的表征。最后，将制备得到的纳米银进行抑菌活性检测。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种新型高金属离子耐受性角蛋白酶的基因挖掘、表达、性质研究及其生物法合成纳米银的应用方法。它具有seqidno:1所示的核苷酸序列，全长1,149个核苷酸，编码382个氨基酸。以枯草芽孢杆菌为例，成功实现了该角蛋白酶基因的异源表达。该角蛋白酶对表面活性剂表现出良好的耐受性。该角蛋白酶对金属离子具有较好的耐受性以及具有高还原能力，可将其用于生物法合成纳米银粒子。角蛋白酶生物法制备纳米银粒子过程操作简单，无需添加还原剂及稳定剂，绿色环保，反应条件温和可控。该法制备得到的纳米银粒子在430nm处有最大吸收峰，为银纳米粒子的等离子共振能带，该纳米粒子溶液具有较好的分散性，透射电镜显示其具有6.54±2.62nm的平均粒径并且具有呈球形的良好形态，最后，红外光谱分析3100-3500cm-1和1650cm-1的吸收峰证明是角蛋白酶的还原作用造成了纳米银的生成，抑菌分析显示与化学法制备的纳米银相比较，角蛋白酶生物法合成的纳米银具有更好的抑菌活性。
附图说明
图1是角蛋白酶基因的系统进化树分析
图2是金属离子对角蛋白酶酶活的影响
图3是角蛋白酶还原力检测
1：对照样品；2：角蛋白酶样品。
图4是角蛋白酶生物法合成纳米银粒子的等离子共振能带
图5是角蛋白酶生物法合成纳米银粒子透射电镜图
图6是角蛋白酶生物法合成纳米银粒子粒径分析
图7是角蛋白酶生物法合成纳米银粒子傅里叶红外光谱分析
图8是角蛋白酶生物法合成纳米银粒子抑菌活性分析
1：空白对照；2：化学法制备纳米银抑菌活性；3：角蛋白酶生物法合成纳米银抑菌活性。
具体实施方案
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1
本实施例说明基于宏基因组技术筛选角蛋白酶基因的方法。
从皮革厂堆放皮毛的地方收集土样，用土壤基因组提取试剂盒提取样品总dna。根据角蛋白酶的保守序列设计简并引物进行pcr扩增反应，扩增获得的片段测序后与ncbi数据库进行比对，再根据结果进一步设计引物，扩增获得完整的角蛋白酶基因编码序列。获得的角蛋白酶序列进行了系统进化树分析后，发现其与芽孢杆菌b.velezensis来源的角蛋白酶的序列最为相近(图1)。该方法基于宏基因组技术，结合数据库中角蛋白酶的保守序列进行直接扩增筛选，与基于宏基因组文库构建筛选方法相比，具有操作方法简单易行，筛选周期短等优点。
实施例2
本实施例说明角蛋白酶枯草芽孢杆菌表达体系构建过程。
根据角蛋白酶基因序列设计带有酶切位点的引物，通过pcr扩增获得角蛋白酶编码基因序列：
上游引物：5’-cgggatccatgagaggcaaaaaggtatgg-3’
下游引物：5’-cgacgcgtttactgagctgccgcctgta-3’
pcr扩增反应在40μl体系中进行，反应体系中加入20μlprimestarhs，17μlddh2o，1μl模板dna，上下游引物各1μl。反应条件为在95℃预变性5min后开始循环：95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。
pcr产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化，回收产物克隆至载体构建重组质粒，将质粒转化至克隆宿主，挑取多个阳性转化子至带有相应抗生素的lb液体培养基中以37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后对质粒进行pcr、双酶切、测序验证。将正确验证的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌表达宿主菌中，并且涂布带有相应抗生素的固体培养基，用pcr验证的方法进一步筛选阳性转化子。将成功构建的角蛋白酶产生菌在固体培养基上划线分离出单菌落，然后挑取至10ml液体lb培养基中过夜培养，次日以2％的接种量接种至30mltb发酵培养基中，进行角蛋白酶产酶研究。
实施例3
本实施例说明重组角蛋白酶酶活检测方法。
1％角蛋白底物的配制：首先配制0.1mtris-hcl(ph＝9.0)的溶液，然后加入5％的可溶性角蛋白母液，再加入去离子水使tris-hcl溶液浓度稀释为0.05m，并且使角蛋白溶液浓度稀释为1％。酶反应：取适度稀释的酶液100μl，加入0.1ml底物溶液，置50℃水浴准确反应15min，反应结束后立即加入200μl5％的tca终止反应。对照组中先加入200μltca，酶反应结束后再加入0.1ml底物溶液。上述反应后以12000rpm离心5min，吸取200μl上清到新的1.5ml的ep管中，加入1ml0.4m的na2co3，再加入200μl福林酚，置40℃水浴显色反应20min后在680nm处检测吸光度值。酶活定义：在上述反应条件下，酶液水解底物在680nm下产生0.01的吸光度的差别定义为一个酶活单位u。酶活计算公式：u＝(od680实验组-od680对照组)×100×稀释倍数
实施例4
本实施例说明角蛋白酶的催化特征。
(1)在酶活测定的反应体系中分别添加不同的金属离子使终浓度达到1mm，与未添加任何金属离子的空白对照组相比，有6种金属离子(mg2+、ca2+、zn2+、ni2+、cd2+、fe3+)对酶活具有促进作用，其中cd2+离子对重组角蛋白酶的促进作用最明显；而mn2+离子明显抑制了酶活。当金属离子浓度达到5mm时，除了mg2+和li+离子对酶活有微弱的促进作用，其余金属离子都表现为或多或少的抑制作用(图2)。总之，该角蛋白酶对多种金属离子具有高耐受性，并且在1mm和5mm的银离子浓度条件下均能够保持80％以上的相对活性，可见其应用于纳米银粒子生物法合成研究中具有很大的潜在优势。
(2)在酶活测定反应体系中分别添加不同的化学试剂后分别测定酶活力。结果如表1所示，pmsf在1mm的浓度时对该酶表现出明显的抑制作用，并且在5mm的浓度下能够完全抑制该酶的活性，说明该重组角蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类；表面活性剂如吐温和曲拉通对重组角蛋白酶表现出促进作用，该酶在表面活性剂中表现出的良好稳定性，使其在洗涤剂领域有良好的应用前景。
表1化学试剂对重组角蛋白酶酶活的影响
(3)与对照样品相比较，该角蛋白酶表现出明显的高还原力，其独特的性质可以运用于纳米银生物法制备研究中(图3)。
实施例5
本实施例说明应用角蛋白酶进行纳米银的生物合成过程。
将2ml过滤除菌的重组角蛋白酶溶液加入到50ml1mm的硝酸银溶液中，于37℃振荡反应，发现反应液由无色变成较深的橙黄色，即为制备得到的纳米银溶液。将生物法制备得到的纳米银溶液进行紫外-可见光光谱分析，发现在430nm处有最大吸收峰，为该纳米银的spr能带，进一步证实了纳米银的合成(图4)。动态光散射分析显示该纳米银溶液具有较好的分散特性。透射电镜分析可以清晰地观察到纳米银颗粒的外貌形态(图5)，并且获得平均粒径为6.54±2.62nm(图6)。傅里叶红外分析的表征显示纳米银的合成与蛋白质有关(图7)，也证实了是角蛋白酶的作用结果。最后，将制备得到的纳米银颗粒进行抑菌活性检测。结果显示，角蛋白酶生物法合成的纳米银具有较好的抑菌活性(图8)。
本发明不限于这些公开的实施例，本发明将覆盖技术方案所描述的范围，以及权利要求范围的各种变形和等效变化，在不偏离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域技术人员容易实现的任何修改或改进均属于本发明所要求保护的范围。
序列表
<110>江南大学
<120>一种新型金属离子耐受性角蛋白酶及其应用
<130>kerbv
<141>2017-12-29
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1149
<212>dna
<213>bacillusvelezensis
<400>1
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