本发明涉及骨质疏松症诊断领域,更具体地,本发明涉及以检测ppp4c异常为手段的骨质疏松症诊断方法。
背景技术:
骨质疏松症(osteoporosis,op)是一种以骨量低下、骨微结构破坏、导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病(who)。2001年美国国立卫生研究院(nih)提出骨质疏松症是以骨强度下降、骨折风险性增加为特征的骨骼系统疾病,骨强度反映了骨骼的两个主要方面,即骨矿密度和骨质量。
该病可发生于不同性别和任何年龄,但多见于绝经后妇女和老年男性。骨质疏松症分为原发性和继发性两大类。原发性骨质疏松症又分为绝经后骨质疏松症(i型)、老年性骨质疏松症(ii型)和特发性骨质疏松(包括青少年型)3种。
骨质疏松症的危险因素包括:
遗传因素,营养因素,废用因素,酗酒、嗜烟、过多咖啡和咖啡因的摄入、肝素使用均是本病的危险因素。此外,年龄增长、服用皮质类固醇和抗惊厥药物、具有骨质疏松症家族史或具有影响骨量的特殊基因也是骨质疏松症的高危因素。
骨质疏松症早期可以没有任何症状,骨质在不知不觉中流失,直到发生骨折后才被意识到,亦被称之为“无声杀手”,由于早期没有典型的临床症状,所以常常不能引起医患足够的重视,以致许多患者只能无奈的面对从病痛到恢复的漫漫长路。
诊断骨质疏松症,首先必须进行骨密度的测定。骨密度实际上就是表示骨的健康程度,或是反过来说表示骨的老化程度。常用的检测手段:
x线摄片法:使用历史最早,但由于有放射性,其测验结果不能量化,已逐渐被取代。
单光子测定仪:费用低、方便、辐射量小而安全。但因不能测躯干骨以及不能区别皮质骨、松质骨、软组织等而受限制,已逐渐被取代。
定量超声法:低廉、方便、又无放射性损伤。适合各年龄段人群的骨状态普查工作。不仅能检测骨密度,还能了解骨的质量即可反应骨的微结构及弹性。但目前只用于跟骨、胫骨和指骨,不能进行全身骨骼的检测。
双能x线吸收法:是目前最理想的测定法,是诊断骨质疏松症的金标准,国内外通用,可测全身各部位骨骼,也能测软组织厚度,但该设备数量较少且价格昂贵,因此对于骨质疏松症患者的诊断来说经济负担大。为此寻找一种敏感性高、准确度高且价格合理的诊断骨质疏松症的方法是亟待解决的问题。
近年来,遗传因素已经成为了骨生物学中最活跃的研究领域之一,很多基因已经被确定为调节古骨密度的候选基因。这些候选基因大多数都是影响骨代谢的基因。如维生素d受体(vdr)、脂蛋白受体相关基因5(lrp5)、i型胶原蛋白(colia1)、雌激素受体α、转化生长因子tgfβ1、骨形态发生蛋白(bmps)、runx2、osterix(osx)、sclerostin、tcirg1、igf-1、il-1(骨质疏松症,张弛,中国骨质疏松杂志,2010年10月,802-813)。此外,已经有相当数量的专利申请涉及骨质疏松症的基因诊断,如申请号为:201610272604.0、201610922798.4、201510628024.6、201510628081.4、201510725408.x、201510628042.4、201610530383.2、201510629348.1、201510627056.4、201510627060.0、201610555353.7的专利。可见利用基因来诊断骨质疏松症成为了今后骨质疏松症早期诊断的发展趋势。
技术实现要素:
本发明的目的之一在于提供一种通过检测ppp4c基因或蛋白表达差异来诊断骨质疏松症的方法。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
本发明提供了检测ppp4c基因或ppp4c蛋白的产品在制备骨质疏松症诊断工具中的用途。
进一步,所述检测ppp4c基因或ppp4c蛋白的产品包括检测ppp4c基因或ppp4c蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合ppp4c基因的核酸或者能够结合ppp4c蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测ppp4c基因的表达水平;所述物质能够检测ppp4c蛋白的表达水平。
本发明的检测ppp4c基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能:如pcr、如southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得,或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因,然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步,所述pcr方法为已知方法,例如,arms(amplificationrefractorymutationsystem,扩增不应突变系统)法、rt-pcr(逆转录酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特异性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可扩增片段长度多态性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(单链构象多态性)法来检测。
上面所述的核酸包括扩增ppp4c基因的引物,产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备,通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计,并通过化学合成来制备。
在本发明的具体实施方案中,所述核酸为qpcr实验中使用的扩增引物,所述引物的序列如seqidno.1(正向序列)和seqidno.2(反向序列)所示。
上面所述的核酸还可包括探针,所述探针可以通过化学合成来制备,通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计,并通过化学合成来制备,或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因,并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的检测ppp4c蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能:例如,可以包括elisa、放射免疫测定法、免疫组织化学法、western印迹等。
本发明的检测ppp4c蛋白的产品包括特异性结合ppp4c蛋白的抗体或其片段。
如本文所用,术语”抗体”,意指特异性结合至特定抗原或与特定抗原相互作用的任意抗原-结合分子或分子复合体,其包含至少一个互补决定区(cdr)。术语”抗体”包括含有4个多肽链(即,通过双硫键相互连接的2个重(h)链以及2个轻(l)链)以及其多聚体(例如igm)。每个重链含有重链可变区以及重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域ch1、ch2和ch3。每个轻链含有轻链可变区以及轻链恒定区。轻链恒定区含有一个结构域(cl1)。vh与vl区可进一步细分成高变区(称为互补决定区(cdr)),其中散布着较保守的称为框架区(fr)的区域。每个vh和vl均由三个cdr和四个fr组成,从氨基端到羧基端按以下顺序排列:fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。
如本文所用,术语“抗体”还包括整个抗体分子的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术,例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区和任选恒定区的dna的操纵和表达的重组基因改造技术,从例如完整的抗体分子衍生。这样的dna是已知的及/或很容易从例如市售来源、dna库(包括例如噬菌体-抗体库)获得,或可以被合成。该dna可以被测序且以化学方法或分子生物学技术加以操纵,从而例如将一个或多个可变区和/或恒定区排列成适宜的构型,或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括:(i)fab片段;(ii)f(ab')2片段;(iii)fd片段;(iv)fv片段;(v)单链fv(scfv)分子;(vi)dab片段;以及(vii)由模拟抗体高变区(例如孤立的互补决定区(cdr),如cdr3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单元或约束型fr3-cdr3-fr4肽。抗原结合片段还包括其它工程化的分子,如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、cdr移植的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(smallmodularimmunopharmaceuticals)(smip),以及鲨鱼可变ignar域。
进一步,所述检测ppp4c基因或ppp4c蛋白的产品可以是检测ppp4c基因或ppp4c蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等,也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
利用前面所述的检测产品检测受试者样本中的ppp4c基因或ppp4c蛋白的表达水平,与正常人相比,受试者样本中的ppp4c基因或ppp4c蛋白的表达水平降低,则诊断该受试者为骨质疏松症患者或该受试者患有骨质疏松症的风险高。
作为依照本发明的检测产品的样本,可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制,只要它适于本发明的测定;例如,它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中,所述样本来自受试者的血液。
本发明还提供了一种诊断骨质疏松症的工具,所述工具能够检测受试者样本中ppp4c基因或ppp4c蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合ppp4c基因的核酸或者能够结合ppp4c蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测ppp4c基因的表达水平;所述物质能够检测ppp4c蛋白的表达水平。
进一步,所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步,所述诊断骨质疏松症的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台;高通量测序平台是一种特殊的诊断骨质疏松症的工具,随着高通量测序技术的发展,对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱,容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此,在高通量测序中获知ppp4c基因的异常与骨质疏松症相关也属于ppp4c基因的用途,同样在本发明的保护范围之内。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗ppp4c抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制,只要抗体能够结合ppp4c即可。当抗体作为治疗药物时,优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸,只要它能抑制ppp4c功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个,更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制,可以是igg、igm、iga、ige、igd或igy。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗ppp4c抗体的其他性质同前面所述。
进一步,所述受试者样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制,只要它适于本发明的测定;例如,它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中,所述样本来自受试者的血液。
本发明还提供了一种诊断骨质疏松症的方法,所述方法包括如下步骤:
(1)获取受试者的样品;
(2)检测受试者样品中ppp4c基因或蛋白的表达水平;
(3)将测得的ppp4c基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与正常人相比,ppp4c基因或蛋白的表达水平降低,则该受试者被诊断为骨质疏松症,或诊断该受试者患有骨质疏松症的风险大。
在本发明的上下文中,“诊断骨质疏松症”既包括判断受试者是否已经患有骨质疏松症、也包括判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险。
附图说明
图1显示利用qpcr检测ppp4c基因在骨质疏松症患者和正常人中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如sambrook等人,分子克隆:实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选骨质疏松症患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象:
骨质疏松组:随机抽取医院骨科收治的10例原发性骨质疏松症患者,男、女各5例,年龄最小50岁,最大75岁。纳入标准:符合《中国人骨质疏松症建议诊断标准》(第二稿)。无明显心、肝、肾、肺功能不全、无引起继发性骨质疏松症的各种内分泌疾病、排除肿瘤、糖尿病等其他严重疾病干扰骨代谢者。
正常组:选取年龄50-75岁的健康志愿者10例,男女各5例。
两组之间年龄、性别差异无统计学意义(p>0.10),具有可比性。
所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。
2、血液总rna提取
使用博凌科为tripurelsreagent血液(血液样本)rna抽提试剂进行血液总rna的提取。
基本步骤:
(1)按照3:1的体积比例加入tripurelsreagent和血液振荡混匀;
(2)加入氯仿帮助有机相和水相分层;
(3)异丙醇沉淀rna;
(4)漂洗rna沉淀;
(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。
3、rna样品的质量分析
利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测,琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性,agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg,浓度≥200ng/μl,od260/280介于1.8~2.2之间。
5、片段化rna
illumina平台是针对短序列片段进行测序,mrna平均长度可能达几kb,因此需要对其进行随机打断。利用金属离子,可以将rna随机断裂成200bp左右的小片段。
6、反转合成cdna
在逆转录酶的作用下,利用随机引物,以mrna为模板反转合成一链cdna,进行二链合成时,dntps试剂中用dutp代替dttp,使cdna第二链中碱基包含a/u/c/g。
7、连接adaptor
双链的cdna结构为粘性末端,加入endrepairmix将其补成平末端,随后在3’末端加上一个a碱基,用于连接y字形的接头。
8、ung酶消化cdna二链
在pcr扩增前,用ung酶将cdna第二链消化,从而使文库中仅包含cdna第一链。
9、illuminax-ten上机测序
illuminax-ten测序平台,进行2*150bp测序。
10、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示:
(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim,trim掉质量<20的碱基,并且删掉n大于10%的reads;
(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为grch38.p7,fasta和gff文件下载自ncbi;
(3)cuffquant定量mrna的表达量并标准化输出;
(4)在r环境下用degseq包比较对照组跟疾病组mrna的表达差异。显著差异mrna筛选条件:p-value<0.05。
11、结果
用以上标准筛选得到差异表达基因3296个,其中表达上调的基因1428个,表达下调的基因有1868个。
实施例2qpcr实验验证骨质疏松症患者和正常人中差异表达的基因
选择实施例1筛选出的ppp4c基因进行大样本验证。
1、研究对象:
骨质疏松组:随机抽取医院骨科收治的50例原发性骨质疏松症患者,男、女各25例,年龄最小50岁,最大75岁。纳入标准:符合《中国人骨质疏松症建议诊断标准》(第二稿)。无明显心、肝、肾、肺功能不全、无引起继发性骨质疏松症的各种内分泌疾病、排除肿瘤、糖尿病等其他严重疾病干扰骨代谢者。
正常组:选取年龄50-75岁的健康志愿者46例,男女各23例。
两组之间年龄、性别差异无统计学意义(p>0.10),具有可比性。
所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。
2、血液总rna提取
使用博凌科为tripurelsreagent血液(血液样本)rna抽提试剂进行血液总rna的提取。
基本步骤:
(1)按照3:1的体积比例加入tripurelsreagent和血液振荡混匀;
(2)加入氯仿帮助有机相和水相分层;
(3)异丙醇沉淀rna;
(4)漂洗rna沉淀;
(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。
3、逆转录
用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系,每个样品取1μg总rna作为模板rna,在pcr管中分别加入以下组分:depc水,5×逆转录缓冲液,10mmol/ldntp,0.1mmol/ldtt,30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv,模板rna。42℃孵育1h,72℃10min,短暂离心。
4、qpcr
采用25μl反应体系,每个样本设置3个平行管,所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
配制以下反应体系:sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl,正向引物(5μm/μl)1μl,反向引物(5μm/μl)1μl,模板cdna2.0μl,无酶水8.5μl。
引物序列如下:
扩增ppp4c基因的正向引物序列为5’-tggtgatggaaggttacaag-3’(seqidno.1),反向引物序列为5’-acagcggtagcagtagtt-3’(seqidno.2);扩增gapdh基因的正向引物序列为5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3),反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。
扩增程序:95℃10min,(95℃10s,60℃60s)*40个循环。以sybr
green作为荧光标记物,在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,δδct法进行相对定量。
5、结果
结果如图1所示,与正常人相比,骨质疏松症患者血液中ppp4c基因的mrna水平显著下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110>北京泱深生物信息技术有限公司
<120>ppp4c基因及其表达产物在制备骨质疏松症诊断产品中的应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tggtgatggaaggttacaag20
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
acagcggtagcagtagtt18
<210>3
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tttaactctggtaaagtggatat23
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ggtggaatcatattggaaca20