本发明涉及酵母培养物领域，更具体的说，它涉及一种酵母培养物的制备方法。
背景技术：
抗生素作为促生长剂在动物饲料中大量使用，给畜牧业生产带来积极的作用，但是长期使用抗生素会使动物产生耐药性以及内源性感染等问题，因此导致抗生素的应用逐渐受到限制。酵母应用于动物生产已经有百年的历史，传统的饲料酵母是作为瘤胃微生物的一种生长因子，常用于反刍动物。但是酵母是一个相对脆弱的活性有机体，易因温度、湿度和粗处理而失活，甚至会被瘤胃酸液破坏或杀死。因此，酵母在动物营养中的作用也发生了变化。
由酵母衍生出的酵母产品具有绿色、天然、无污染等特点，在缓解饲料工业蛋白质资源不足等方面具有巨大的发展潜力。酵母产品主要包括活性干酵母、酵母培养物、营养性酵母、酵母制品等。其中用于饲料工业的主要是酵母培养物。
酵母培养物是在特定的工艺条件下，由酵母菌种在特制的培养基上经过充分发酵后所形成的微生物制品，其主要由酵母细胞代谢产物和经过发酵后变异的培养基，以及少量已无活性的酵母细胞所构成。酵母培养物营养丰富、富含b族维生素、矿物质、消化酶、促生长因子和较齐全的氨基酸，是集营养与保健为一体的饲料添加剂。
与活酵母产品相比，酵母培养物产品是非常稳定的，运输、储存和加工的过程并不会影响产品质量或动物生产性能，其效果不依赖于活的酵母菌。目前，常用的酵母培养物的生产工艺包括液体深层发酵法和固体发酵法两大类。液体深层发酵，是指发酵主体在适宜的发酵液中，适宜的生长温度下连续发酵1至2天或更多时间，得到发酵产品的过程。但是液体发酵工艺由于设备、能耗的原因，不能被大面积推广。
固体发酵法是利用自然底物做碳源或利用惰性底物做固体支撑物，其体系无水或接近于无水的发酵过程，微生物的生长及所形成的产物均在基质的表面，但是，固体发酵的主要缺点是菌种经过多级培养和开放式发酵易受到杂菌感染，产品质量难以达到标准。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种酵母培养物的制备方法，利用该制备方法大大降低了杂菌的污染，制得到的酵母培养物中富含酵母细胞破壁后的细胞内容物、细胞壁、酵母代谢终产物和培养基，是一种具有生物活性的饲料添加剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案得以实现的：一种酵母培养物的制备方法，至少包括以下步骤：
菌种扩大培养：将酵母接种至液体培养基20-30kg中，置于恒温振荡培养箱中，保持环境温度30-34℃，190-200r/min的条件下培养24-30h，得到扩大培养液；
液体发酵：将扩大培养液以20-24％的接种量接种至液体培养基50-60kg中，保持环境温度28-30℃有氧发酵56-72h，得到液体菌种溶液；
固体发酵：将液体菌种溶液在35-55℃干燥至含10-30wt％的水分后，加入固体培养基68-81.6kg，得到半固态混合物，在环境温度40-60℃厌氧发酵30-40h后，加入细胞破壁酶10-12kg，40-60℃保温6-8h，之后升温至70-90℃保温5-10min，得到固体发酵物；
成品：将固体发酵物产品干燥、粉碎，得到酵母培养物；
其中，所述固体培养基，其原料包括，秸秆、玉米粉、麸皮、交联葡聚糖凝胶、1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮、d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯。
优选的，所述固体培养基中，秸秆、玉米粉、麸皮、交联葡聚糖凝胶混合物、1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮、d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯的质量比为2:2:1:1:0.5:0.3。
优选的，所述固体发酵步骤中，首先取交联葡聚糖凝胶、1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮、d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯均匀混合，之后加入水中浸泡0.3-0.5h，之后加入秸秆、玉米粉、麸皮，均匀搅拌后，得到固体培养基。
优选的，所述交联葡聚糖凝胶与水的质量比为1:3。
优选的，所述液体培养基包括硫酸镁0.2份、硫酸铵2份、柠檬酸钠1份、磷酸二氢钾6份、磷酸氢二钾4份，蛋白胨10份、氯化钠1份、磷酸二氢钾1份。
优选的，所述液体培养基的ph为5-6。
优选的，所述酵母为热带假丝酵母和酿酒酵母。
优选的，所述细胞破壁酶为酸性蛋白酶、果胶酶或纤维素酶。
优选的，所述液体培养基与固体培养基在使用前均需灭菌。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明得到的酵母培养物大大降低了杂菌的污染，制得到的酵母培养物中富含酵母细胞破壁后的细胞内容物、细胞壁、酵母代谢终产物和培养基，是一种具有生物活性的饲料添加剂。
2、本发明在固体发酵的过程中，固体培养基中的1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮与d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯首先吸附于交联葡聚糖凝胶的大分子链中，在培养酵母的过程中，1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮与d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯氧化，不仅利于酵母菌的厌氧发酵，同时，生成的氧化产物具有抑菌效果，有效抑制杂菌的生成。通过1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮与d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯的配合使用，抑菌效果达到最佳。随着1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮与d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯消耗，二者逐渐释放，不会影响酵母菌的培养。
具体实施方式
本发明实施例中所涉及的所有物质均为市售。
一、制作实施例
实施例1
菌种扩大培养：将热带假丝酵母和酿酒酵母接种至液体培养基25kg中，置于恒温振荡培养箱中，保持环境温度32℃，195r/min的条件下培养27h，得到扩大培养液；其中，液体培养基包括硫酸镁0.2份、硫酸铵2份、柠檬酸钠1份、磷酸二氢钾6份、磷酸氢二钾4份，蛋白胨10份、氯化钠1份、磷酸二氢钾1份，调节液体培养基的ph至5；
液体发酵：将扩大培养液以22％的接种量接种至液体培养基55kg中，保持环境温度29℃有氧发酵64h，得到液体菌种溶液；
固体培养基的制备：首先取交联葡聚糖凝胶11kg、1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮5.5kg、d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯3.3kg均匀混合，之后加入水33kg中浸泡0.4h，之后加入秸秆22kg、玉米粉22kg、麸皮11kg，均匀搅拌后，得到固体培养基；
固体发酵：将液体菌种溶液在45℃干燥至含20wt％的水分后，加入固体培养基，得到半固态混合物，在环境温度50℃厌氧发酵35h后，加入酸性蛋白酶11kg，50℃保温7h，之后升温至80℃保温7.5min，得到固体发酵物；
成品：将固体发酵物产品干燥、粉碎，得到酵母培养物。
实施例2
菌种扩大培养：将热带假丝酵母和酿酒酵母接种至液体培养基20kg中，置于恒温振荡培养箱中，保持环境温度30℃，190r/min的条件下培养30h，得到扩大培养液；其中，液体培养基包括硫酸镁0.2份、硫酸铵2份、柠檬酸钠1份、磷酸二氢钾6份、磷酸氢二钾4份，蛋白胨10份、氯化钠1份、磷酸二氢钾1份，调节液体培养基的ph至6；
液体发酵：将扩大培养液以24％的接种量接种至液体培养基50kg中，保持环境温度29℃有氧发酵72h，得到液体菌种溶液；
固体培养基的制备：首先取交联葡聚糖凝胶10kg、1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮5kg、d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯3kg均匀混合，之后加入水30kg中浸泡0.3h，之后加入秸秆24kg、玉米粉24kg、麸皮10kg，均匀搅拌后，得到固体培养基；
固体发酵：将液体菌种溶液在45℃干燥至含30wt％的水分后，加入固体培养基，得到半固态混合物，在环境温度40℃厌氧发酵30h后，加入细胞破壁酶10kg，40℃保温8h，之后升温至90℃保温5min，得到固体发酵物；
成品：将固体发酵物产品干燥、粉碎，得到酵母培养物。
实施例3
菌种扩大培养：将热带假丝酵母和酿酒酵母接种至液体培养基30kg中，置于恒温振荡培养箱中，保持环境温度30℃，190r/min的条件下培养30h，得到扩大培养液；其中，液体培养基包括硫酸镁0.2份、硫酸铵2份、柠檬酸钠1份、磷酸二氢钾6份、磷酸氢二钾4份，蛋白胨10份、氯化钠1份、磷酸二氢钾1份，调节液体培养基的ph至5；
液体发酵：将扩大培养液以20％的接种量接种至液体培养基60kg中，保持环境温度30℃有氧发酵72h，得到液体菌种溶液；
固体培养基的制备：首先取交联葡聚糖凝胶10kg、1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮6kg、d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯3kg均匀混合，之后加入水25kg中浸泡0.3h，之后加入秸秆24kg、玉米粉20kg、麸皮12kg，均匀搅拌后，得到固体培养基；
固体发酵：将液体菌种溶液在55℃干燥至含30wt％的水分后，加入固体培养基，得到半固态混合物，在环境温度40℃厌氧发酵4h后，加入果胶酶10kg，40℃保温8h，之后升温至70℃保温10min，得到固体发酵物；
成品：将固体发酵物产品干燥、粉碎，得到酵母培养物。
实施例4
菌种扩大培养：将热带假丝酵母和酿酒酵母接种至液体培养基20kg中，置于恒温振荡培养箱中，保持环境温度30℃，200r/min的条件下培养24h，得到扩大培养液；其中，液体培养基包括硫酸镁0.2份、硫酸铵2份、柠檬酸钠1份、磷酸二氢钾6份、磷酸氢二钾4份，蛋白胨10份、氯化钠1份、磷酸二氢钾1份，调节液体培养基的ph至6；
液体发酵：将扩大培养液以24％的接种量接种至液体培养基55kg中，保持环境温度28℃有氧发酵64h，得到液体菌种溶液；
固体培养基的制备：首先取交联葡聚糖凝胶12kg、1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮5kg、d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯3kg均匀混合，之后加入水36kg中浸泡0.5h，之后加入秸秆20kg、玉米粉24kg、麸皮11kg，均匀搅拌后，得到固体培养基；
固体发酵：将液体菌种溶液在35℃干燥至含20wt％的水分后，加入固体培养基，得到半固态混合物，在环境温度60℃厌氧发酵30h后，加入果胶酶10kg，60℃保温6h，之后升温至90℃保温7.5min，得到固体发酵物；
成品：将固体发酵物产品干燥、粉碎，得到酵母培养物。
实施例5
菌种扩大培养：将热带假丝酵母和酿酒酵母接种至液体培养基30kg中，置于恒温振荡培养箱中，保持环境温度34℃，200r/min的条件下培养24h，得到扩大培养液；其中，液体培养基包括硫酸镁0.2份、硫酸铵2份、柠檬酸钠1份、磷酸二氢钾6份、磷酸氢二钾4份，蛋白胨10份、氯化钠1份、磷酸二氢钾1份，调节液体培养基的ph至5；
液体发酵：将扩大培养液以20％的接种量接种至液体培养基50kg中，保持环境温度29℃有氧发酵64h，得到液体菌种溶液；
固体培养基的制备：首先取交联葡聚糖凝胶12kg、1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮6kg、d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯3.6kg均匀混合，之后加入水36kg中浸泡0.5h，之后加入秸秆20kg、玉米粉20kg、麸皮10kg，均匀搅拌后，得到固体培养基；
固体发酵：将液体菌种溶液在45℃干燥至含20wt％的水分后，加入固体培养基，得到半固态混合物，在环境温度60℃厌氧发酵40h后，加入纤维素酶12kg，60℃保温6h，之后升温至70℃保温5min，得到固体发酵物；
成品：将固体发酵物产品干燥、粉碎，得到酵母培养物。
实施例6
菌种扩大培养：将热带假丝酵母和酿酒酵母接种至液体培养基20kg中，置于恒温振荡培养箱中，保持环境温度34℃，190r/min的条件下培养24h，得到扩大培养液；其中，液体培养基包括硫酸镁0.2份、硫酸铵2份、柠檬酸钠1份、磷酸二氢钾6份、磷酸氢二钾4份，蛋白胨10份、氯化钠1份、磷酸二氢钾1份，调节液体培养基的ph至6；
液体发酵：将扩大培养液以24％的接种量接种至液体培养基60kg中，保持环境温度30℃有氧发酵56h，得到液体菌种溶液；
固体培养基的制备：首先取交联葡聚糖凝胶12kg、1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮5kg、d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯3.6kg均匀混合，之后加入水36kg中浸泡0.3h，之后加入秸秆20kg、玉米粉24kg、麸皮12kg，均匀搅拌后，得到固体培养基；
固体发酵：将液体菌种溶液在55℃干燥至含10wt％的水分后，加入固体培养基，得到半固态混合物，在环境温度60℃厌氧发酵30h后，加入纤维素酶12kg，40℃保温6h，之后升温至90℃保温10min，得到固体发酵物；
成品：将固体发酵物产品干燥、粉碎，得到酵母培养物。
二、制作对比例
对比例1
菌种扩大培养：将热带假丝酵母和酿酒酵母接种至液体培养基25kg中，置于恒温振荡培养箱中，保持环境温度32℃，195r/min的条件下培养27h，得到扩大培养液；其中，液体培养基包括硫酸镁0.2份、硫酸铵2份、柠檬酸钠1份、磷酸二氢钾6份、磷酸氢二钾4份，蛋白胨10份、氯化钠1份、磷酸二氢钾1份，调节液体培养基的ph至5；
液体发酵：将扩大培养液以22％的接种量接种至液体培养基55kg中，保持环境温度29℃有氧发酵64h，得到液体菌种溶液；
固体培养基的制备：取秸秆22kg、玉米粉22kg、麸皮11kg，均匀搅拌后，得到固体培养基；固体发酵：将液体菌种溶液在45℃干燥至含20wt％的水分后，加入固体培养基，得到半固态混合物，在环境温度50℃厌氧发酵35h后，加入酸性蛋白酶11kg，50℃保温7h，之后升温至80℃保温7.5min，得到固体发酵物；
成品：将固体发酵物产品干燥、粉碎，得到酵母培养物。
对比例2
菌种扩大培养：将热带假丝酵母和酿酒酵母接种至液体培养基25kg中，置于恒温振荡培养箱中，保持环境温度32℃，195r/min的条件下培养27h，得到扩大培养液；其中，液体培养基包括硫酸镁0.2份、硫酸铵2份、柠檬酸钠1份、磷酸二氢钾6份、磷酸氢二钾4份，蛋白胨10份、氯化钠1份、磷酸二氢钾1份，调节液体培养基的ph至5；
液体发酵：将扩大培养液以22％的接种量接种至液体培养基55kg中，保持环境温度29℃有氧发酵64h，得到液体菌种溶液；
固体培养基的制备：首先取交联葡聚糖凝胶11kg、1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮5.5kg均匀混合，之后加入水33kg中浸泡0.4h，之后加入秸秆22kg、玉米粉22kg、麸皮11kg，均匀搅拌后，得到固体培养基；
固体发酵：将液体菌种溶液在45℃干燥至含20wt％的水分后，加入固体培养基，得到半固态混合物，在环境温度50℃厌氧发酵35h后，加入酸性蛋白酶11kg，50℃保温7h，之后升温至80℃保温7.5min，得到固体发酵物；
成品：将固体发酵物产品干燥、粉碎，得到酵母培养物。
对比例3
菌种扩大培养：将热带假丝酵母和酿酒酵母接种至液体培养基25kg中，置于恒温振荡培养箱中，保持环境温度32℃，195r/min的条件下培养27h，得到扩大培养液；其中，液体培养基包括硫酸镁0.2份、硫酸铵2份、柠檬酸钠1份、磷酸二氢钾6份、磷酸氢二钾4份，蛋白胨10份、氯化钠1份、磷酸二氢钾1份，调节液体培养基的ph至5；
液体发酵：将扩大培养液以22％的接种量接种至液体培养基55kg中，保持环境温度29℃有氧发酵64h，得到液体菌种溶液；
固体培养基的制备：首先取交联葡聚糖凝胶11kg、d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯3.3kg均匀混合，之后加入水33kg中浸泡0.4h，之后加入秸秆22kg、玉米粉22kg、麸皮11kg，均匀搅拌后，得到固体培养基；
固体发酵：将液体菌种溶液在45℃干燥至含20wt％的水分后，加入固体培养基，得到半固态混合物，在环境温度50℃厌氧发酵35h后，加入酸性蛋白酶11kg，50℃保温7h，之后升温至80℃保温7.5min，得到固体发酵物；
成品：将固体发酵物产品干燥、粉碎，得到酵母培养物。
以上各实施例以及对比例中使用的液体培养基与固体培养基在使用前均需灭菌。
三、性能结果测试
试验对象：选用405只蛋雏鸡，随机分成9个处理组，每组设3个重复，每个重复15只雏鸡，试验期8周。其中，9个处理组分别在基础日粮中添加0.5％的实施例1至实施例6、对比例1至对比例3制备得到的酵母培养物。人工喂养，每天三次，自由饮水采食，保证水、料、槽及舍内清洁卫生。
生产性能测试：分别在试验期初、末以重复为单位空腹称重，准确记录各重量耗料量，计算平均日增重、耗料量及饲料增重比。其测试结果如表1所示。
表1各实施例以及对比例制备的酵母培养物的性能测试结果
从上述表中可以看出，本发明制备得到的酵母培养物中杂菌的数量大大减少，制得到的酵母培养物的产品性能大大提高，对雏鸡的生长具有良好的促进作用，是一种具有生物活性的饲料添加剂。
其中，对比例1中不加入1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮、d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯以及交联葡聚糖凝胶，在酵母培养物的制备过程中，即使在使用前对固体培养基进行了灭菌处理，但是在酵母的培养过程中，因为环境适宜，杂菌仍然会增加，导致制备得到的酵母培养物中携带大量杂菌，严重影响酵母培养物的产品性能。
对比例2与对比例3中分别不加入d-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯与1-(2-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮，其在酵母培养物中，对杂菌的抑制作用低于二者的配合使用，导致制备得到的酵母培养物中携带杂菌，影响酵母培养物的产品性能。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。