本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法。
背景技术：
β-葡萄糖苷酶又称β-D-葡萄糖苷水解酶，是糖苷水解酶(EC 3.2.1)中的一类酶，别名纤维二糖酶、龙胆二糖酶及苦杏仁酶，其英文名称是beta-glucosidase，属于水解酶类，简称CB。β-葡萄糖苷酶广泛应用于医疗、食品、生物质转化等各个领域，但是目前使用的β-葡萄糖苷酶存在活性低，稳定性差，使用寿命短、不易回收等缺陷，使得β-葡萄糖苷酶的使用成本过高，限制了该酶的工业化应用。
β-葡萄糖苷酶的固定化能有效提高其稳定性和使用寿命，初步实现β-葡萄糖苷酶的低使用成本，β-葡萄糖苷酶的固定化的研究也因此成为了该技术领域的一个研究热点，随之而来的大量的载体和固定化方法也已被人们陆续开发出来，β-葡萄糖苷酶的固定化方法的优劣也主要取决于所使用载体材料的性质和固定化方法。目前，国内外研究者已经开发的S-IS互变载体系统，即以Eudragit L-100为载体，该载体会随溶液pH值不同，而呈现出可溶和不可溶性状态，倘若用其固定化β-葡萄糖苷酶就可避免单独使用不溶性载体系统酶与底物的传质阻力问题，以及可溶性载体系统酶使用后不易回收的缺陷；但是这种载体固定化酶也暴露了一些技术问题，比如制备的固定化β-葡萄糖苷酶会出现吸附不稳定、固定效率偏低，导致酶重复利用率低、酶活保留率低等技术问题，如何改善这种载体固定化酶存在的缺点，还需对β-葡萄糖苷酶的固定化进一步研究。
发明人从商业和技术角度考虑，提供了一种新的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，来解决β-葡萄糖苷酶重复利用率低、以及重复利用的酶活保留率低的技术难题，从而为降低β-葡萄糖苷酶的生产成本提供了可能。
技术实现要素：
为了解决现有技术中的β-葡萄糖苷酶的催化活性偏低、酶的重复利用率低、以及重复利用的酶活保留率低的技术问题，本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，以Eudragit L-100为载体，固定化修饰β-葡萄糖苷酶，制备得到固定化β-葡萄糖苷酶；其中，所述修饰β-葡萄糖苷酶是以单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)为修饰剂，定点修饰β-葡萄糖苷酶制备而成的。
现有技术中已有采用载体Eudragit L-100固定化酶来解决酶稳定性差及使用寿命短的技术问题，但是研究发现，以Eudragit L-100为载体，该载体会随溶液pH值不同，而呈现出可溶和不可溶性状态，倘若用其固定化β-葡萄糖苷酶就可避免单独使用不溶性载体系统酶与底物的传质阻力问题，以及可溶性载体系统酶使用后不易回收的缺陷；但是制备得到的固定化β-葡萄糖苷酶会出现吸附不稳定、固定效率偏低，从而导致酶重复利用率低、酶活保留率低的技术问题，并且固定化条件一般在偏碱性环境中进行，会导致一部分酶失活，本发明就是针对以上技术问题提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法。
酶化学修饰指通过化学反应将某种特定的基团或者化学物质引入至酶分子上或者使酶分子表面的某种基团去除或者代替，以改造酶分子的天然结构，进而改良酶的固有性能。比如等电点、稳定性、催化效率、酶动力学等可能会随着酶分子的化学修饰而发生变化。但是仅仅通过酶化学修饰的β-葡萄糖苷酶根本无法回收重复利用。
发明人惊喜的发现，固定化反应的中的原料β-葡萄糖苷酶通过酶化学修饰，再以EudragitL-100为载体对修饰后的β-葡萄糖苷酶进行固定化得到的成品β-葡萄糖苷酶，不仅能实现酶的回收利用，而且酶活保留率也变化不大，具体的是采用单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)为修饰剂，定点修饰β-葡萄糖苷酶，再用Eudragit L-100为载体固定化修饰后的β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶分子是两性分子，理论上经过mPEG-ALD修饰后消耗了酶分子上的氨基，导致酶的等电点降低，在相同pH环境下，修饰酶分子上带的负电荷量比天然酶的多，进而使得修饰酶与Eudragit L-100载体之间的吸附能力比天然酶的更强，固定化β-葡萄糖苷酶吸附稳定、固定效率较高，实现β-葡萄糖苷酶的高效固定化，固定化β-葡萄糖苷酶可反复利用多次，酶催化效率较高并且酶活保留率变化不大；同时因为蛋白酶原子之间的极性、分子结构以及表面电荷量相互之间的作用因素，使得酶分子产生了一个微环境，这种微环境的改变会对酶分子的催化性能产生影响，当酶经过化学修饰之后，可能会在酶分子表面形成一层“保护膜”，能够将酶分子的微环境保护起来，抵御外界极性以及电荷的变化，维持酶活性基因的微环境相对稳定，使酶催化效率较高，能够提高酶的重复利用率和酶活保留率，使得酶的应用更加适应实际的要求。
固定化修饰β-葡萄糖苷酶的反应条件为，Eudragit L-100载体溶液的体积浓度为0.1～5.0％，修饰β-葡萄糖苷酶溶液的体积浓度为为1～10mg/mL，V载体溶液:V酶液＝1:1～6:1；固定化反应的pH值为7.0～13.0，反应温度为15～50℃，反应时间为30～200min；作为优选，Eudragit L-100载体溶液的体积浓度为0.5～2.0％，修饰β-葡萄糖苷酶溶液的体积浓度为1～4mg/mL，固定化反应的pH值为9.0～12.0，反应温度为20～35℃，反应时间为30～100min。
本发明提供的β-葡萄糖苷酶的来源没有具体限制，作为优选，β-葡萄糖苷酶来源于苦杏仁。
作为优选，修饰剂单甲氧基聚乙二醇丙醛的分子量为5000。单甲氧基聚乙二醇丙醛属于mPEG类大分子修饰剂，具有良好的生物相容性，不仅能溶于水还可以溶于乙醇、丙酮、甲醇等有机溶剂；无生物免疫性，无毒害性使之在药品、食品以及化妆品上得到广泛的使用。
本发明所述的修饰β-葡萄糖苷酶的具体制备方法为，在35℃温度条件下，向pH为4.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中加入β-葡萄糖苷酶粉，待酶粉溶解后加入相对分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇丙醛，1h后加入氰基硼氢钠，反应24h，加入甘氨酸终止反应，透析24h，即得到纯化的修饰β-葡萄糖苷酶溶液。
本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，该方法可以实现β-葡萄糖苷酶的高效固定化，得到的固定化β-葡萄糖苷酶可反复利用多次，酶催化效率较高并且酶活保留率变化不大，首次得到的固定化胡β-葡萄糖苷酶的酶活回收率最高能达到93.0％。该固定化方法简易可操作、试剂安全无毒，大大降低了β-葡萄糖苷酶的使用成本，使β-葡萄糖苷酶的工业化成为可能。
具体实施方式
本发明公开了一种β-葡萄糖苷酶的固定化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明当中。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的制备方法中，还包括对产物β-葡萄糖苷酶进行纯化的步骤。具体地，包括对产物进行离心，缓冲液溶解等步骤。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
修饰β-葡萄糖苷酶的制备在35℃温度条件下，向20mLpH为4.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中加入20mgβ-葡萄糖苷酶粉，待酶粉溶解后加入20mg相对分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇丙醛，1h后加入4mg氰基硼氢钠，反应24h，加入0.2g甘氨酸终止反应，透析24h，即得到纯化的体积浓度为1mg/ml的修饰β-葡萄糖苷酶溶液；
固定化β-葡萄糖苷酶的制备准确称取Eudragit L-100置于蒸馏水中，滴加NaOH至pH值为12.0，待Eudragit L-100完全溶解后，滴加盐酸至pH值至9.0，定容至50mL备用，定容后的载体溶液的浓度为1％；称取1mL Eudragit L-100溶液，然后加入1mL上述1mg/mL的修饰β-葡萄糖苷酶溶液，在pH为7.0，温度为15℃条件下反应30min，用3M的醋酸调节pH值为4.0，10000rpm下离心10min，将沉淀溶解于pH值为5.2的磷酸缓冲液中，即得到所需要的固定化β-葡萄糖苷酶，固定化酶活回收率为86％。
实施例2
修饰β-葡萄糖苷酶的制备在35℃温度条件下，向20mLpH为4.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中加入200mgβ-葡萄糖苷酶粉，待酶粉溶解后加入200mg相对分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇丙醛，1h后加入40mg氰基硼氢钠，反应24h，加入2g甘氨酸终止反应，透析24h，即得到纯化的体积浓度为10mg/mL的修饰β-葡萄糖苷酶溶液；
固定化β-葡萄糖苷酶的制备准确称取Eudragit L-100置于蒸馏水中，滴加NaOH至pH值为12.0，待Eudragit L-100完全溶解后，滴加盐酸至pH值至9.0，定容至50mL备用，定容后的载体溶液的浓度为5％；称取6mL Eudragit L-100溶液，然后加入1mL上述10mg/mL的修饰β-葡萄糖苷酶溶液，在pH为13.0，温度为50℃条件下反应200min，用3M的醋酸调节pH值为4.0，10000rpm下离心10min，将沉淀溶解于pH值为5.2的磷酸缓冲液中，即得到所需要的固定化β-葡萄糖苷酶，固定化酶活回收率为89％。
实施例3
修饰β-葡萄糖苷酶的制备在35℃温度条件下，向20mLpH为4.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中加入100mgβ-葡萄糖苷酶粉，待酶粉溶解后加入100mg相对分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇丙醛，1h后加入20mg氰基硼氢钠，反应24h，加入1g甘氨酸终止反应，透析24h，即得到纯化的体积浓度为5mg/mL的修饰β-葡萄糖苷酶溶液；
固定化β-葡萄糖苷酶的制备准确称取Eudragit L-100置于蒸馏水中，滴加NaOH至pH值为12.0，待Eudragit L-100完全溶解后，滴加盐酸至pH值至9.0，定容至50mL备用，定容后的载体溶液的浓度为2.0％；称取3mL Eudragit L-100溶液，然后加入1mL上述5mg/mL的修饰β-葡萄糖苷酶溶液，在pH为10.0，温度为35℃条件下反应100min，用3M的醋酸调节pH值为4.0，10000rpm下离心10min，将沉淀溶解于pH值为5.2的磷酸缓冲液中，即得到所需要的固定化β-葡萄糖苷酶，固定化酶活回收率为93％。
将实施例3最终得到成品β-葡萄糖苷酶进行重复回收利用，重复利用的酶活回收率的数据见表1。
表1固定化修饰酶的重复利用结果
表1数据显示，实施例3得到的成品β-葡萄糖苷酶的首次酶活回收率为93％，反复利用多次之后，酶活回收率扔可保持在一个较高的水平，酶活保留率变化不大。
对比例1
反应条件与实施例3相同，仅将未经修饰的天然β-葡萄糖苷酶酶液代替用单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的β-葡萄糖苷酶，并将该β-葡萄糖苷酶成品进行重复利用，重复利用的酶活回收率的数据见表2。
表2固定化天然酶的重复利用结果
表2数据显示，首次酶活回收率为84％，但是经过数次循环利用之后，酶活回收率大大降低，酶活保留率变化很大。
表1和表2的数据对比显示，本发明提供了的β-葡萄糖苷酶的固定化方法，可以实现β-葡萄糖苷酶的高效固定化，得到的固定化β-葡萄糖苷酶可反复利用多次，酶催化效率较高并且酶活保留率变化不大，成功的降低了β-葡萄糖苷酶的使用成本，使β-葡萄糖苷酶的工业化应用成为可能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。