本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种水稻抗条纹叶枯病基因qstv11-i的分子标记及其应用。
背景技术：
水稻是我国重要粮食作物。rsv侵染水稻后，水稻心叶沿叶脉呈现断续的黄绿色或黄白色短条斑，以后合并成大片，病叶的一半或大半变成黄白色，但在其边缘部分仍呈现断续的褪绿短条斑。稻条纹叶枯病的病株率与有效穗关系密切，病株率越高，每亩有效穗数越少。据测定病株率在10％以下时，产量损失平均<4％，病株率>10％时，产量损失随病株率增加而上升，病株率>50％时，产量损失率平均达60％。因此，最为经济有效而不造成污染的防治措施是抗病品种的应用。
washio等在日本陆稻品种中发现了两个主效的抗条纹叶枯病显性互补基因，stv-a，stv-b，其中stv-a位于第6染色体短臂上，与角质胚乳wx基因和光敏感基因se-1连锁。随后，在籼稻品种modan中定位到一个不完全显性基因stvb-i，其与stv-b等位(washioetal.1968a,1968b,1968c)，最终将该基因位于11染色体长臂约286kb的区间内(hayano-saitoetal.1998,2000)。在对一些抗性品种的qtl定位中，又陆续发现了数个抗rsv的主效qtl。丁秀兰等(2004，2005)利用重组自交系群体dv85/kinmaze和回交重组自交系群体nipponbare/kasalath//nipponbarel将基因定位于第11染色体s2260-g257标记区间内。maeda等(2004，2006)发现陆稻品种kanto72携带了一个主效的抗rsv位点，其位于第11染色体的相同区间内。wu等(2009)在品种dular中检测到了3个抗性qtl，一个位于第3染色体，另两个位于第11染色体相邻的标记区间rm287-rm209和rm209-rm21。zhang等(2010)利用窄叶青8号/京系17的加倍单倍体群体，定位到一个位于11染色体稳定表达的qtl，其位于区间ct533-ct224内。
近几年，随着研究的不断深入，数个抗条纹叶枯病基因得到了进一步的精细定位。利用抗病品种特青和感病品种lemont构建的染色体单片段代换系，将抗性qtlqstv11tq定位于11染色体标记caps3-caps2之间，55.7kb的区间内(wuetal.2010)。zhang等(2011)将来源于kasalath的抗性基因qstv11kas定位在同一染色体标记c1-r53，39.2kb的区间内。zhang等(2012)又将来源于抗性品种habataki的两个qtl(qstv11hab-1andqstv11hab-2)分别定位于11染色体r15-rm209和r69-r73两个相邻的区间内，区间大小分别为333kb和203kb。其中，qstv11hab-1包含qstv11kas区间。利用构建的近等基因系群体，将来自品种shingwang的抗性基因qstv11sg定位于11染色体标记indel11-indel5之间，约150kb的区间内(kwonetal.2012)，该区间包含qstv11-i和qstv11tq的定位区间，与qstv11hab-1定位区间存在部分重叠。综上，利用不同的定位群体，均在第11染色体长臂检测到一个稳定表达的主效qtl，相信这些抗性基因在条纹叶枯病抗性遗传中起到了至关重要的作用。
由于抗病性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗病基因。而在找到与抗病基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(marker-assistedselection,mas)技术则可以有目的地进行抗病基因或qtl的聚合，选育持久抗性品种，延缓抗病品种的退化年限。
技术实现要素：
本发明的目的是：提供了水稻品种ir24抗条纹叶枯病中抗基因qstv11-i的分子标记及其应用，通过检测与这些抗褐飞虱主基因连锁的分子标记，可以预测水稻植株的条纹叶枯病抗性，加快抗条纹叶枯病水稻的选择进度。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种水稻抗条纹叶枯病基因qstv11-i的分子标记方法，用分子标记rm26801引物：seqidno.1/seqidno.2或者用分子标记h02-10引物：seqidno.3/seqidno.4或者用分子标记hiri3引物：seqidno.5/seqidno.6或者用分子标记hiri9引物：seqidno.7/seqidno.8扩增水稻或育种材料dna，如果用分子标记rm26801引物能够扩增出166bp的扩增片段，或用分子标记h02-10引物能够扩增出170bp的扩增片段，或用分子标记hiri3引物能够扩增出193bp的扩增片段，或用分子标记hiri9引物能够扩增出167bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗条纹叶枯病基因qstv11-i的存在。
本发明还提供一种抗条纹叶枯病基因qstv11-i的分子标记：
rm26801引物：
前引物序列gccttcatccgtaaatccataagc(如seqidno.1所示)
后引物序列gagtaccacatggcattatgagagc(如seqidno.2所示)。
本发明还提供一种抗条纹叶枯病基因qstv11-i的分子标记h02-10引物：
前引物序列ttttgcctgccttccttat(如seqidno.3所示)
后引物序列tgtttattggttctgttatgcc(如seqidno.4所示)。
本发明还提供一种抗条纹叶枯病基因qstv11-i的分子标记hiri3引物：
前引物序列cgattctacgttaactttcc(如seqidno.5所示)
后引物序列tgttgaccaactcagcaa(如seqidno.6所示)。
本发明还提供一种抗条纹叶枯病基因qstv11-i的分子标记hiri9引物：
前引物序列atacctcccagagtcccagt(如seqidno.7所示)
后引物序列gcacccaccaatcctttt(如seqidno.8所示)。
本发明还提供所述抗条纹叶枯病基因qstv11-i的分子标记方法、所述分子标记rm26801、分子标记h02-10、分子标记hiri3或分子标记hiri9在水稻育种中的应用。
本发明还提供所述抗条纹叶枯病基因qstv11-i的分子标记方法、所述分子标记rm26801、分子标记h02-10、分子标记hiri3或分子标记hiri9在鉴定抗条纹叶枯病植物品种或品系中的应用。
本发明所述的鉴定抗条纹叶枯病植物品种或品系中的应用，具体为用分子标记rm26801引物：seqidno.1/seqidno.2或者用分子标记h02-10引物：seqidno.3/seqidno.4或者用分子标记hiri3引物：seqidno.5/seqidno.6或者用分子标记hiri9引物：seqidno.7/seqidno.8扩增待鉴定水稻或育种材料dna，并检测扩增产物，如果用分子标记rm26801引物能够扩增出166bp的扩增片段，或用分子标记h02-10引物能够扩增出170bp的扩增片段，或用分子标记hiri3引物能够扩增出193bp的扩增片段，或用分子标记hiri9引物能够扩增出167bp的扩增片段，则标志着待鉴定水稻或育种材料为抗条纹叶枯病品种或品系。
本发明还提供所述抗条纹叶枯病基因qstv11-i的分子标记方法、所述分子标记rm26801、分子标记h02-10、分子标记hiri3或分子标记hiri9在筛选抗条纹叶枯病植物品种或品系中的应用。
本发明所述的筛选抗条纹叶枯病植物品种或品系中的应用，具体为用分子标记rm26801引物：seqidno.1/seqidno.2或者用分子标记h02-10引物：seqidno.3/seqidno.4或者用分子标记hiri3引物：seqidno.5/seqidno.6或者用分子标记hiri9引物：seqidno.7/seqidno.8扩增待筛选水稻或育种材料dna，并检测扩增产物，如果用分子标记rm26801引物能够扩增出166bp的扩增片段，或用分子标记h02-10引物能够扩增出170bp的扩增片段，或用分子标记hiri3引物能够扩增出193bp的扩增片段，或用分子标记hiri9引物能够扩增出167bp的扩增片段，则标志着待筛选水稻或育种材料为抗条纹叶枯病品种或品系。
本发明所提供的水稻品种抗条纹叶枯病中抗基因qstv11-i的分子标记及其引用，具有以下优点：
1)通过本发明在国际上首次精细定位了水稻品种ir24中的抗条纹叶枯病基因qstv11-i；
2)通过本发明分子标记定位的qstv11-i基因位置明确，鉴定方便。通过检测这些与抗条纹叶枯病基因连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的条纹叶枯病的抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有条纹叶枯病抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于水稻育种。主基因位点的检测方便快速，不受环境影响；
3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗病基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对条纹叶枯病抗性进行单株选择。对水稻抗条纹叶枯病进行表型鉴定复杂，同时受灰飞虱带毒率影响，首先要获得虫源、饲养灰飞虱并检测其带毒率，此外要获得接种虫源和水稻秧苗同步，非常困难，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗虫传病毒病育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗条纹叶枯病中抗基因位点，可以在苗期就鉴定出抗条纹叶枯病的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗条纹叶枯病的选择效率。
4)同时可用于抗病杂交品种的纯度鉴定和苗期快速鉴定。
附图说明
图1抗条纹叶枯病基因qstv11-i在染色体上的分布。
图2利用qstv11-i位点紧密连锁分子标记hiri9进行单株选择。m为marker；p1：抗病亲本cssl62；p2，感病亲本asominori；4-25，抗病单株；26-48：抗病单株。
图3利用qstv11-i位点紧密连锁分子标记hiri3进行单株选择。m为marker；p1：抗病亲本cssl62；p2，感病亲本asominori；4-25，抗病单株；26-48：抗病单株。
图4利用qstv11-i位点紧密连锁分子标记rm26801进行单株选择。m为marker；p1：抗病亲本cssl62；p2，感病亲本asominori；4-25，抗病单株；26-48：抗病单株。
图5利用qstv11-i位点紧密连锁分子标记h02-10进行单株选择。m为marker；p1：抗病亲本cssl62；p2，感病亲本asominori；4-25，抗病单株；26-48：抗病单株。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂公司。
实施例1
(一)asominori/cssl62f2群体构建及表型鉴定
利用asominori/ir24重组自交系和全基因组染色体片段置换系(chromosomesegementsubstitutionlines，cssls)在水稻第11染色体重复检测到一个抗条纹叶枯病qtl，等位性分析表明，该qtl与前人报道的stvb-i不等位，为一个新的抗条纹叶枯病qtl，并将其命名为qstv11-i。本研究通过染色体片段置换系群体和次级群体验证了来源于ir24的主效抗性qtlqstv11-i，为遗传利用和图位克隆中抗rsv的抗性资源提打好基础。
本研究所用遗传群体为以粳稻品种asominori为背景的ir24全基因组染色体片段置换系)，共65个株系。本研究利用携带有11染色体主效抗性基因的株系cssl62与asominori构建次级分离群体进行初定位(群体大小为120份)和精细定位(群体大小为2780份)。2007年5-6月将两个亲本及片段置换系群体在南京农业大学实验室进行鉴定，方法为强迫饲毒鉴定(seedlingtest)。ir36和武育粳3号分别作为抗病和感病对照。
用于定位的asominori/cssl62f2:3(bc4f2:3)群体含有2900个家系，从中任意挑选120个家系用作于连锁定位qstv11-i，剩下的2780个家系用于进一步精细定位qstv11-i。为了进一步的精细定位qstv11-i，利用r45和r48两个标记对另外一个含有2780个家系的bc4f2:3群体进行基因型分析，从中挑选出纯合型的交换单株用于精细定位。
分别于2007年5月底在江苏建湖条纹叶枯病重病区采取田间自然接种方法对120个asominori/cssl62f2:3家系进行抗病性鉴定。在精细定位qstv11-i试验中，交换单株的抗病性鉴定在南京农业大学牌楼温室采取强迫饲毒的方法进行。
采用斑点免疫法(dot-immunobindingassay，diba)检测发病稻株的病毒及灰飞虱带毒率。rsv病毒的单抗由江苏省农业科学院植物保护研究所周益军研究员提供，效价1︰10000,测得2007年江苏建湖条纹叶枯病重病区灰飞虱带毒率为39％左右。2008年牌楼温室进行强迫饲毒鉴定的灰飞虱带毒率为18％。按病害发生严重程度，根据washio的抗性鉴定标准，将各苗分成a、b、bt、cr、c和d等级别，统计各家系中不同级别的株数，按下列公式计算病情指数。将重组自交系各家系的病情指数作为表型值。再将每个品种的病情指数与感病对照品种的相比值乘以100，计算出病情指数比率(theratioforthediseaseratingindex,rdri)。
评价品种抗性标准为：病情指数比率为0～29％为高抗(hr)、30％～39％为中抗(mr)、40％～69％为中感(ms)、高于70％为高感(hs)。
(二)asominori/cssl62f2:3群体的分子标记分析
ssr标记分析的方法如下所述：
提取上述选取单株的总dna作为模板，具体方法如下所述：
①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于2mleppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型geno/grinder仪器上粉碎样品1min。
②加入660μl提取液(含100mmtris-hcl(ph8.0)，20mmedta(ph8.0)，1.4mnacl,0.2g/mlctab的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。
③加入40μl20％sds，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。
④加入100μl5mnacl，温和混匀。
⑤加入100μl10×ctab，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。
⑥加入900μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。
⑦转移上清液至一1.5mleppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。
⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。
⑨加入100μl1×te(121gtris溶于1升水中，用盐酸调ph值至8.0得到的溶液)溶解dna。
⑩取2μl电泳检测dna质量，并用du800分光光度仪测定浓度(bechmaninstrumentinc.u.s.a)。
将上述提取的dna稀释成约20ng/μl，作为模板进行pcr扩增；
pcr反应体系(10μl)：dna(20ng/μl)1μl，上游引物(2pmol/μl)1μl，下游引物(2pmol/μl)1μl，10xbuffer(mgcl2free)1μl，dntp(10mm)0.2μl，mgcl2(25mm)0.6μl，rtaq(5u/μl)0.1μl，ddh2o5.1μl，共10μl。
pcr反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。pcr反应在mjresearchptc-225热循环仪中进行。
ssr标记的pcr产物检测：扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的dnaladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。
(三)结果与分析：
如前所述利用asominori/ir24重组自交系群体在水稻第11号染色体检测到一个抗条纹叶枯病qtl，等位性分析发现其与前人报道的stvb-i不等位，并将其命名为qstv11-i。利用强迫饲毒对120asominori/cssl62f2:3家系进行条纹叶枯病抗性鉴定，利用复合区间作图的方法，在标记区间r45-r48(区间大小2.5cm)之间检测到一个qtl，lod值为13.2，贡献率42.3％，进一步验证了qstv11-i位点是真实存在的。
为了精细定位该qtl，利用其两侧的两个引物r21和r48对2780个asominori/cssl62f2:3进行基因型分析，共筛选到137个重组株系，因为杂合基因型的表型比较难确定，本研究将137个f2:3家系每个家系种植16株，利用r21和r48标记挑选一个纯合的重组单株收获f3:4种子用于表型鉴定。2007年和2008年利用强迫饲毒的方法分别对137个杂合重组的f2:3株系和纯合重组的f3:4株系进行鉴定。
进一步在标记r21和r48区间内，根据nipponbare和93-11的序列自行开发了一些基于pcr的indel标记共有13个，其中标记rm26801、h02-10、hiri3和hiri9在asominori和cssl62之间具有较好的多态性，并结合重组个体的表型数据，最终将qstv11-i精细定位于标记rm26801和标记h02-10之间，于hiri3和hiri9共分离，如图1所示。
为进一步验证rm26801、h02-10、hiri3和hiri9在抗条纹叶枯病基因qstv11-i分子标记辅助选择中选择效率，对78个asominori/cssl62f2:3家系进行了条纹叶枯病抗性鉴定，及四个标记的分子检测。结果见图2、图3和图4，结果表明，标记rm26801和标记h02-10的选择效率分别为97.4和96.1，hiri3和hiri9的选择效率为100％。
分子标记rm26801引物：
前引物序列gccttcatccgtaaatccataagc(如seqidno.1所示)
后引物序列gagtaccacatggcattatgagagc(如seqidno.2所示)。
分子标记h02-10引物：
前引物序列ttttgcctgccttccttat(如seqidno.3所示)
后引物序列tgtttattggttctgttatgcc(如seqidno.4所示)。
分子标记hiri3引物：
前引物序列cgattctacgttaactttcc(如seqidno.5所示)
后引物序列tgttgaccaactcagcaa(如seqidno.6所示)。
分子标记hiri9引物：
前引物序列atacctcccagagtcccagt(如seqidno.7所示)
后引物序列gcacccaccaatcctttt(如seqidno.8所示)。
用分子标记rm26801引物：seqidno.1/seqidno.2或者用分子标记h02-10引物：seqidno.3/seqidno.4或者用分子标记hiri3引物：seqidno.5/seqidno.6或者用分子标记hiri9引物：seqidno.7/seqidno.8扩增待鉴定水稻或育种材料dna，并检测扩增产物，如果用分子标记rm26801引物能够扩增出166bp的扩增片段，或用分子标记h02-10引物能够扩增出170bp的扩增片段，或用分子标记hiri3引物能够扩增出193bp的扩增片段，或用分子标记hiri9引物能够扩增出167bp的扩增片段，则标志着待鉴定水稻或育种材料具有抗条纹叶枯病基因qstv11-i，该品种为抗条纹叶枯病品种或品系。
通过本发明鉴定的抗条纹叶枯病基因qstv11-i及其连锁分子标记的开发，可用来指导抗条纹叶枯病水稻品种的选育工作，用与之连锁的分子标记对抗病品种进行筛选，使不同抗病主基因位点快速聚合在同一个植株中，从而大大提高育种效率。
序列表
<110>南京农业大学
<120>水稻抗条纹叶枯病基因qstv11-i的分子标记方法及其应用
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gccttcatccgtaaatccataagc24
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gagtaccacatggcattatgagagc25
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cgattctacgttaactttcc20
<210>4
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
tgttgaccaactcagcaa18
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
atacctcccagagtcccagt20
<210>6
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
gcacccaccaatcctttt18
<210>7
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
ttttgcctgccttccttat19
<210>8
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
tgtttattggttctgttatgcc22