一种水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的原核表达方法及表达载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供了一种基因的原核表达方法W及表达载体，具体设及一种水稻广谱抗 性负调控基因0sSSI2,属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 水稻稻攝病是由真菌Magnaporthe oryzae引起的水稻病害，已是全球最具影响力 和破坏力的水稻病害之一。目前，稻攝病的防治主要采用化学防治和抗病新品种培育两种 途径。化学防治通常成本高、效果差而且污染环境。因此发掘水稻自身的广谱抗性基因资 源，培育持久高抗品种，是最经济有效的病害控制措施，但对于水稻的广谱抗性机理不甚清 楚。
[0003] 植物在抗病过程中通过激活不同的防御通路来对抗病原体感染，其中水杨酸 (SA)，莱莉酸(JA)和乙締化T)等植物激素是诱导植物抗病反应的重要的信号分子。每种激 素调节不同的防御通路但相互配合。除了植物激素，一些研究也表明脂肪酸(FA)及其衍生 物在植物抗病反应中也起着重要的作用，扮演了一个重要的信号分子的作用。已经有报道 证明抑制硬脂酷-ACP去饱和酶基因（SACPD)的表达提高了拟南芥(SSI2)和大豆对多种病原 体的抗性。
[0004] 0sSSI2基因是脂肪酸去饱和基因 SSI2在水稻中的同源基因，0sSSI2的RNAi转基因 水稻表现对稻攝病及白叶枯的广谱抗病性，说明0sSSI2基因参与并且负调控水稻的抗病反 应。因此该基因是研究广谱抗性机理的一个很好材料。
[0005] 然而，在原核细胞表达外源基因0sSSI2的过程中，尤其是W大肠杆菌为宿主菌高 效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集，形成包涵体。W包涵体形式存在的蛋白 质分子不具有正确的天然=维结构，表达蛋白不具有生物活性，需要通过复性操作W得到 具有预期生物活性的蛋白质。而通常的包涵体复性过程中，复性条件难W控制，成本高，在 复性过程中也很难保证包涵体蛋白形成正确的折叠结构，为后续的研究提供了诸多的不 便。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种水稻广谱抗性负调控基因0sSSI2的原核表达方法，解决了背景 技术中的不足，该方法能从上清中表达出大量可溶性的〇sSSI2蛋白，最终提高了目的蛋白 的可溶性表达。
[0007] 实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
[000引一种水稻广谱抗性负调控基因0sSSI2的原核表达方法，包括W下步骤：
[0009] (1)、pGEX-6Pl-〇sSSI2原核表达载体的构建：
[0010] W〇sSSI2质粒DNA为PCR扩增模板，限制性内切酶BamH I、EcoR I为酶切位点设计 引物，引物为：
[0011] 0sSSI26P-1-BamH IF:5'一GATAGGATCCGCGTCGAGGATGGCGCTCC-3'；
[0012] 0sSSI26P-1-EcoR IR:5'一GCGAGAATTCGAGTTGAACTTCCCTACC-3'；
[0013] 利用PCR反应扩增出目的片段，扩增反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测;再使用 清洁回收试剂盒对目的片段进行清洁回收，然后用限制性内切酶BamH I和EcoR I同时双酶 切目的片段和PGEX-6P1空载体;使用凝胶回收试剂盒对酶切后的目的片段及载体片段进行 切胶回收，用Ligation Μ曲连接酶连接0sSSI2目的片段和PGEX-6P1载体片段，然后转化 D册α感受态细胞，涂Amp+平板后于恒溫培养箱内倒置过夜培养；
[0014] 从平板上随机挑取单克隆，提取质粒并且进行PCR及双酶切鉴定，鉴定结果为阳性 的单克隆进行测序，其测序结果100%匹配，说明pGEX-6Pl-〇sSSI2原核表达载体构建成功；
[0015] (2)、重组蛋白的诱导表达：
[0016] 将构建好的pGEX-6Pl-〇sSSI2的重组质粒和PGEX-6P1载体转化化21表达菌株，涂 Amp+平板后于恒溫培养箱内倒置过夜，挑取单克隆菌落接种于含Amp+的液体LB培养基中，于 摇床中振荡培养作为种子液，将种子液接种至含Amp+的液体LB培养基中，继续用摇床振荡 培养至OD600为0.5~0.7，保存菌液后加入IPTG，振荡培养诱导蛋白的表达。
[0017] 步骤（1)中所述PCR反应程序为:94°C预变性2min; 94°C变性15s，60°C退火30s，68 °C延伸2. Omin，重复：34个循环，68°C延伸lOmin。
[001引步骤(2)中加入IPTG的终浓度为0.3mmol/L，于27°C振荡培养化诱导蛋白的表达。 [0019]本发明采用PGEX-6P1原核表达载体，在目标蛋白的N端力化一个约26kD的GST标签 蛋白，在原核表达时优化诱导表达条件，从不同的IPTG浓度、诱导溫度、诱导时间去摸索，结 果在表达条件为IPTG终浓度为0.3mmol/L、诱导溫度为25°C、诱导时间为化时提高了目的蛋 白的可溶性表达，为进一步去研究0sSSI2蛋白在水稻中的相关功能奠定了基础。
【附图说明】
[0020] 图1为实施例中重组表达载体阳性克隆鉴定结果图；
[0021] 图2为含GST标签的0sSSI2融合蛋白的诱导表达SDS-PAGE检测图；
[0022] 图3为不同浓度IPTG诱导pGEX-6Pl-〇sSSI2蛋白表达SDS-PAGE检测图；
[0023] 图4为不同溫度时间诱导pGEX-6Pl-〇sSSI2蛋白表达SDS-PAGE检测图；
[0024] 图5为0sSSI2蛋白Western blot检测图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合【具体实施方式】对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不 局限于W下实施例。
[00%] 1 pGEX-6Pl-〇sSSI2原核表达载体的构建
[0027] W〇sSSI2质粒DNA为PCR扩增模板，限制性内切酶Ba恤I、EcoR I为酶切位点设计 引物，利用PCR反应扩增出目的片段，引物为：
[0028] 0sSSI26P-1-BamH IF:5'_GATAggatccGCGTCGAGGATGGCGCTCC-3'，见沈Q ID NO: l;0sSSI26P-1-EcoR IR:5'一GCGAgaattcGAGTTGAACTTCCCTACC-3'，见沈Q ID N0:2。
[0029] 采用SOliL体系，共3管进行PCR反应，各反应物浓度如下：
[0030]
[0031] PCR 反应程序:94°C 预变性 2min; 94°C 变性 15s，60°C 退火 30s，68°C 延伸 2. Omin，重 复34个循环，68°C延伸lOmin。扩增反应完成后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。使用清洁回 收试剂盒对目的片段进行清洁回收，然后用限制性内切酶BamH I和EcoR I同时双酶切目的 片段和PGEX-6P1空载体，37°C酶切化。使用凝胶回收试剂盒对酶切的目的片段及载体片段 进行切胶回收，16°C用Ligation hi曲连接酶连接0sSSI2目的片段和PGEX-6P1载体片段化 后转化D册α感受态细胞，涂Amp+平板后于37°C恒溫培养箱倒置过夜培养。从平板上随机挑 取单克隆，提取质粒并且进行PCR及双酶切鉴定，鉴定结果为阳性的单克隆进行测序。
[0032] 2重组蛋白的诱导表达
[0033] 将构建好的pGEX-6Pl-〇sSSI2的重组质粒和PGEX-6P1载体转化化21表达菌株，涂 Amp+平板后于37°C恒溫培养箱倒置过夜，随机挑取6个单克隆菌落接种于3mL含Amp+的液体 LB培养基中，于37°C摇床中18化pm振荡培养1化作为种子液，按1:1000的接种量接种至5mL 含Amp+的液体LB培养基中，37°C摇床中18化pm/h振荡培养至OD600约为0.6，保存菌液后加入 IPTG至终浓度为1mmol/L，于37°C振荡培养化诱导蛋白的表达。同时诱导不加 IPTG的口66乂- 6P1 -Os SS12和PGEX-6P1空载体的化21菌株作为阴性对照。
[0034] 3重组蛋白的诱导表达条件的优化
[0035] 选取上一步中表达量较好的一个克隆，用保存的菌液按1:1000的接种量接种至 5mL含Amp+的液体LB培养基中，37°C摇床中18化pm振荡培养至OD600约为0.6后，分别加入 IPTG至终浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0111111〇1/1诱导表达确定1?了6浓度后，分别于10 °C、15°C、25°C、37°C条件下诱导蛋白表达，分别于化、3h、化、化诱导时间取样5mL，利用SD