S- PAGE电泳检测比较诱导溫度和时间对可溶性蛋白表达的影响。
[0036] 4重组蛋白的SDS-PAGE检测
[0037] 将诱导表达完成的菌液转入离屯、管中，40(Κ)巧m离屯、lOmin，弃上清收集菌体，加入 3mL PBS(pH7.4)缓冲液重新悬浮菌体，在冰浴中超声波破碎细胞，破碎5s，间隔5s，每管破 碎1 Omin，4000巧m离屯、15min收集蛋白上清，在沉淀中加入ImL bufferB，室溫静置化，间隔 震荡几次，12000;rpm离屯、15min，取上清为蛋白沉淀。各取上清lOOyL加入适量loading buffer于100°C沸水中煮lOmin，瞬时离屯、后进行10%SDS-PAGE检测。恒压100V电泳，用考马 斯亮蓝染色液染色化后用脱色液进行脱色。
[0038] 5重组蛋白的Western Blot检测
[0039] 将诱导表达的蛋白用10%SDS-PAGE蛋白胶电泳完成后，取出蛋白胶于电转仪横流 80mA转膜化，使蛋白条带转移到醋酸纤维素薄膜上，先用40mL封闭液室溫静置封闭化，按1: 15000的比例在封闭液中加入GST-抗，在4°C环境下震荡封闭过夜，按1:10000的比例加入 二抗羊抗兔在封闭液中，放入解育箱内28°C震荡解育封闭化后进行化学发光检测信号。
[0040] 结果与分析
[0041 ] pGEX-6Pl-〇sSSI2原核表达载体的克隆
[0042] 将重组质粒pGEX-6Pl-〇sSSI2通过PCR鉴定，0sSSI2大小为1197bp，图1中A为重组 表达载体PCR鉴定结果;B为重组表达载体双酶切鉴定结果，Μ: DL2000Marker; 1-3:3个单克 隆。图中可见目的片段大小在1200bp左右；通过双酶切鉴定显示，重组质粒经过BamH I和 EcoR I双酶切，得到两段大小分别为5000bp和1200bp左右大小的条带，与预期估计条带大 小相同。将构建好的载体送公司测序，其测序结果100%匹配，说明pGEX-6Pl-〇sSSI2原核表 达载体构建成功。
[0043] 重组蛋白的SDS-PAGE检测
[0044] 将构建好的pGEX-6Pl-〇sSSI2的重组质粒和PGEX-6P1载体转化化21表达菌株，随 机挑取6个单克隆菌落进行诱导表达，用SDS-PAGE检测表达产物，结果如图2所示，图2中M: 蛋白Marker; 1:空载体细胞混合物;2-7:6个单克隆诱导表达后细胞混合物（箭头为目的蛋 白）。从图2可见，经染色和脱色后观察，目的蛋白大小约为44.4kD，GST标签大小约为26kD， 所W表达目的蛋白大小约为70.4kD，在70kD左右，诱导处理后的样品与空载蛋白存在明显 差异，表明0sSSI2蛋白可能高效表达，其中2、3、7号克隆蛋白表达量较高，可用于下一步蛋 白表达条件摸索。
[0045] 利用表达量较高的克隆进行蛋白表达IPTG浓度的摸索，发现该蛋白同时在上清和 沉淀都有表达，当IPTG浓度为0.3mmol/L时，上清中可溶性蛋白表达量最高，因此我们确定 IPTG终浓度为0.3mmo 1/L(见图3)。图3为不同浓度IPTG诱导pGEX-6Pl-〇sSSI2蛋白表达SDS- PAGE检测图，其中Μ:蛋白Marker; 1:空载体细胞混合物;2-3: IPTG浓度为0.1 mmol/L上清/沉 淀;4-5: IPTG浓度为0.2mmol/L上清/沉淀;6-7: IPTG浓度为0.3mmol/L上清/沉淀;8-9: IPTG 浓度为0.5mmol/L上清/沉淀。
[0046] 在蛋白表达IPTG终浓度为0.3mmol/L时，进行表达溫度和时间的优化，经过10°C、 15°C、25°C、37°C不同溫度，化、化、5h、化不同时间的摸索，确定25°C、化为最佳表达条件(见 图4)。图4为不同溫度时间诱导pGEX-6Pl-〇sSSI2蛋白表达SDS-PAGE检测图，图中，M:蛋白 Marker; 1:空载体细胞混合物;2-3:25°C、化上清/沉淀;4-5:25°C、-IPTG上清/沉淀;6-7:37 °C、化上清/沉淀;8-9:37°C、-IPTG上清/沉淀。
[0047] 综上，确定目的蛋白较适宜的诱导表达条件为：IPTG终浓度为0.3mmol/L、诱导溫 度和时间为25°C、7h。
[004引重组蛋白的Western Blot检测
[0049]用GST单抗对诱导表达的蛋白解育进行检测，可W观察到在20kD和35kD之间空载 体及诱导后重组蛋白均有，分析该条带为GST条带。在70kD附近，诱导处理后的PGEX-6P1- 0sSSI2上清、沉淀中均出现单一的信号条带，而未加 IPTG诱导的pGEX-6Pl-〇sSSI2和空载体 的蛋白样品中未见信号表达(见图5)。图5为OsSSI2蛋白Western blot检测图，图中，1-2:空 载体蛋白上清/沉淀;3-4:融合蛋白上清/沉淀(+IPTG); 5-6:融合蛋白上清/沉淀(+IPTG); 7-8:融合蛋白上清/沉淀(-IPTG)。
[0050]此结果进一步表明载体构建成功，水稻0sSSI2蛋白成功并高效的表达，并且该外 源蛋白有可溶性和包涵体两种表达形式。
【主权项】
1. 一种水稻广谱抗性负调控基因0sSSI2的原核表达方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 、pGEX-6Pl-〇sSSI2原核表达载体的构建： 以OsSSI2质粒DNA为PCR扩增模板，限制性内切酶BamH I、EcoR I为酶切位点设计引物， 引物为： OsSSI26P-1-BamH IF:5'一GATAGGATCCGCGTCGAGGATGGCGCTCC-3'； OsSSI26P-1-EcoR IR:5'一GCGAGAATTCGAGTTGAACTTCCCTACC-3'； 利用PCR反应扩增出目的片段，扩增反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测;再使用清洁 回收试剂盒对目的片段进行清洁回收，然后用限制性内切酶BamH I和EcoR I同时双酶切目 的片段和PGEX-6P1空载体;使用凝胶回收试剂盒对酶切后的目的片段及载体片段进行切胶 回收，用Ligation high连接酶连接0sSSI2目的片段和pGEX-6Pl载体片段，然后转化DH5a感 受态细胞，涂Amp+平板后于恒温培养箱内倒置过夜培养； 从平板上随机挑取单克隆，提取质粒并且进行PCR及双酶切鉴定，鉴定结果为阳性的单 克隆进行测序，其测序结果100%匹配，说明pGEX-6Pl-〇sSSI2原核表达载体构建成功； (2) 、重组蛋白的诱导表达： 将构建好的pGEX-6Pl-〇sSSI2的重组质粒和pGEX-6Pl载体转化BL21表达菌株，涂Amp+平 板后于恒温培养箱内倒置过夜，挑取单克隆菌落接种于含Amp+的液体LB培养基中，于摇床 中振荡培养作为种子液，将种子液接种至含Amp+的液体LB培养基中，继续用摇床振荡培养 至OD600为0.5~0.7，保存菌液后加入IPTG，振荡培养诱导蛋白的表达。2. 根据权利要求1所述的水稻广谱抗性负调控基因0sSSI2的原核表达方法，其特征在 于:步骤（1)中所述PCR反应程序为:94°C预变性2min; 94°C变性15s，60°C退火30s，68°C延伸 2. Omin，重复34个循环，68°C延伸lOmin。3. 根据权利要求1所述的水稻广谱抗性负调控基因0sSSI2的原核表达方法，其特征在 于:步骤(2)中加入IPTG的终浓度为0.3mmol/L，于27°C振荡培养7h诱导蛋白的表达。4. 权利要求1中所述的pGEX-6Pl-〇sSSI2原核表达载体，所述表达载体中包含有水稻广 谱抗性负调控基因 Os SS12。
【专利摘要】本发明提供了一种水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的原核表达方法，包括以下步骤：1、pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体的构建。2、重组蛋白的诱导表达：将构建好的pGEX-6P1-OsSSI2的重组质粒和pGEX-6P1载体转化BL21表达菌株，涂Amp+平板后于恒温培养箱内倒置过夜，挑取单克隆菌落接种于含Amp+的液体LB培养基中，于摇床中振荡培养作为种子液，将种子液接种至含Amp+的液体LB培养基中，继续用摇床振荡培养至OD600为0.5～0.7，保存菌液后加入IPTG，振荡培养诱导蛋白的表达。该方法能从上清中表达出大量可溶性的OsSSI2蛋白，最终提高了目的蛋白的可溶性表达。
【IPC分类】C12N15/70
【公开号】CN105543264
【申请号】CN201610060819
【发明人】刘新琼, 陈亚红, 刘早利, 王春台
【申请人】中南民族大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月28日