本发明涉及一种从猴头菌丝体中分离的化合物，该化合物从猴头菌丝体中提取分离而得。
背景技术：
猴头菌丝体是齿菌科真菌猴头菌Hericium erinaceus(Bull.)Pers.经定向生物转化而得到的菌丝体，用于治疗胃肠道疾病已经超过2000年的历史了，一系列小分子化合物如erinacines，被认为具有神经再生，并且可以透过血脑屏障修复受损神经组织，猴头菌还有抗溃疡，抗炎，抗微生物，免疫调节，提高肝功能，抗衰老，降低血糖和血脂，提高抗缺氧能力，增加心脏输出、和改善备注循环等作用，包含猴头菌的医用制剂在中国广泛使用。
猴头菌丝体的活性物质主要是菌类多糖。目前国内外对菌类多糖的药理作用研究综合起来有以下几方面：治疗慢性胃炎胃溃疡，增强机体免疫力，促进神经生长因子表达，抗癌等。研究表明，此种猴头菌丝体多糖具有多种生物活性和药理作用，能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进溶血素的形成，抗白细胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突变和抗衰老等。因此，猴头菌丝体多糖备受人们关注，成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域研究和开发应用热点。
近年来，随着分离手段的不断完善和对猴头菌丝体作用机制深入研究的需要，人们从其子实体和菌丝体中纯化得到多种新化合物，并对单一物质具有的药理活性进行研究。其主要成分有：多糖、低聚糖、甾醇类、猴头菌丝体素、腺苷、酶等。药理作用有：对消化系统的保护、提高免疫功能及、抗突变、抗肿瘸、降血糖、抗氧化延缓衰老、神经保护作用，猴头菌丝体还有抗菌、抑制血小板聚集、保护肝脏、改善局部缺血脑损伤等作用。临床研究表明，猴头菌丝体制剂在临床上已被广泛用于治疗胃肠道消化系统的疾病，在治疗胃癌癌前病变和作为治疗肿瘤辅助用药方面也有较好的疗效。在治疗神经系统疾病(如Alzheimer s病、认知功能障碍)和糖脂代谢紊乱疾病(如高脂血症、糖尿病)等方面也有潜在的应用前景。
当前，从高等真菌及其培养物中筛选和发现活性成分，应用于抗肿瘤、抗癌，不仅已经成为国家研究新药的重点发展方向，也是当今世界各国开发生物医药的热点。
技术实现要素：
本发明中，猴头菌丝体由湖南新汇制药股份有限公司提供，符合《中国药典》2015年版一部第1614页，其培育方法获得专利ZL 201410393488.9，专利名称：一种猴头菌丝体及其培育方法。本发明采用该创新的培育方法，即二次定向生物转化方法，培育出来的猴头菌丝体，经物质基础分析，发现这种新化合物(12R,13R)-Flavonolignan A：
经活性评价发现猴头菌丝体提取物具有较好的抗肿瘤效果，抗肿瘤效果是与这种新化合物密切相关的，经文献查询，未有文献报导猴头菌、猴头菌丝体、猴头菇等含有这种新化合物。本发明适应了国家发展生物医药的需求，有利于充分挖掘和科学利用此猴头菌丝体的药用价值。
附图说明
图1为化合物1的1H-NMR谱图；
图2为化合物1的13C-NMR谱图；
图3为化合物1的DEPT谱图；
图4为化合物1的HSQC谱图；
图5为化合物1的HMBC谱图；
图6为化合物1的CD谱图。
具体实施方式
1实验仪器、实验材料及试剂
1.1实验仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪，配备四元梯度、在线脱气、自动进样、DAD、VWD检测器、Chemstation色谱工作站(美国Agilent公司)；Agilent 1100制备液相色谱仪(美国Agilent公司)；大连伊利特半制备色谱柱SinoChrom(ODS-BP,10×250mm,10μm)；YMC半制备色谱柱Pack-ODS-A(10×250mm,10μm)；Nicolet AVATAR360FT-IR红外光谱仪，KBr压片(美国Nicolet公司)；UV Probe-2450紫外可见分光光度仪(日本SHIMADZU公司)；INOVA-400核磁共振仪(美国Varian公司)，TMS为内标；INOVA-500核磁共振仪(美国Varian公司)，TMS为内标，Finnigan LCQ-Advatange质谱仪(美国Thermo公司)；
1.2实验材料及试剂
猴头菌丝体由湖南新汇制药股份有限公司提供，符合《中国药典》2015年版一部第1614页，培育方法获得专利ZL 201410393488.9，专利名称：一种猴头菌丝体及其培育方法。薄层色谱硅胶及柱层析硅胶为青岛海洋化工厂产品，聚酰胺(30-60、80-100目)购自国药集团化学试剂有限公司，Sephadex LH-20为pharmacia公司进口分装，薄层及柱层析色谱试剂均为分析纯，制备及半制备液相试剂均为色谱纯。
2猴头菌丝体的提取分离
猴头菌丝体30kg，加入5倍量体积50％的乙醇溶液，加热回流提取2小时，过滤，滤渣加入4倍量体积50％的乙醇溶液加热回流1.5小时，过滤，两次得到的滤液合并，4000r/min离心10min，取上清液，共220L；在60℃真空条件下旋转蒸发至无醇味约(50L)，加水补齐至原体积220L，4000r/min离心10min，弃去上清，沉淀即为所得，干燥，得浸膏，约500g。
浸膏用水分散，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取；石油醚部位得到油状物117.2g，乙酸乙酯部位得油状物约60g；
石油醚部位上硅胶柱(200-300目)，石油醚：乙酸乙酯(20:1、10:1、5:1、1:1、0:1)作为流动相，得到10个留分Fr1-10；Fr1经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯洗脱)，得到化合物1(5mg)；Fr2经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯洗脱)，得到化合物2(6mg)；Fr3析出晶体，经氯仿重结晶，得化合物7(20mg)；Fr4析出晶体，经氯仿重结晶，为化合物6(10mg)；Fr4母液经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯洗脱)，得化合物3(12mg)、8(8mg)、9(12mg)。
乙酸乙酯部分上硅胶柱(200-300目)，二氯甲烷-甲醇梯度(1:0、100:2、10:1、5:1、1:0)洗脱，得到7个留分Fr11-Fr17；Fr11经硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇洗脱)、凝胶LH-20柱层析(水-甲醇洗脱)和HPLC制备(水-乙腈洗脱)得到得到化合物4(4mg)、5(5mg)、10(7mg)；Fr12经凝胶LH-20柱层析(水-甲醇洗脱)和HPLC制备(水-乙腈洗脱)，得到化合物11(20mg)、15(4mg)；Fr13经凝胶LH-20柱层析(水-甲醇洗脱)和HPLC制备(水-乙腈洗脱)，得到化合物12(5mg)、13(8mg)、14(6mg)、16(7mg)；Fr17经凝胶LH-20柱层析(水-甲醇洗脱)和HPLC制备(水-乙腈洗脱)，得到化合物17(6mg)、18(4mg)。
3黄酮木脂素类化合物
化合物1
黄色无定形粉末，易溶于DMSO、氯仿，能溶于甲醇，难溶于水。三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，薄层色谱显黄色，氨熏颜色加深，显示结构中有酚羟基存在，可能为一黄酮类化合物。
UV(MeOH)max：271,360nm
IR(KBr)：显示该化合物结构中含有C＝O(1650cm-1)、苯环(1600,1457cm-1)、-OH(3758cm-1)。
高分辨率质谱显示m/z：508.1451(理论值：508.1364)，结合化合物的1H-NMR谱、13C-NMR谱，得到化合物1分子式为C27H24O10，不饱和度为16。
1H-NMR谱(H信号从高场到低场依次标记为H-1-H-17)(图1)显示：谱中共有23个质子信号，包括3个甲氧基信号(H-3-H-5,9H)，6个芳香质子信号(H-8-H-13,6H)，4个活泼质子信号和4个其它质子信号；在1H-NMR谱中未显示的1个质子信号可能为1个活泼质子信号。又因为1H-NMR谱上有δ：6.17(1H,d,J＝2.0)、6.55(1H,d,J＝2.0)、6.67(1H,d,J＝2.0)、6.51(1H,d,J＝8.0)、6.11(1H,dd,J＝2.0,8.0)五组峰，可以推测出分子中存在两个耦合系统，分别为间位耦合苯环和1,2,4-三取代苯环。
13C-NMR谱(C信号从高场到低场依次标记为C-1-C-27)(图2)显示：谱中共有27个C信号，包括21个低场区C信号，4个连氧C信号和2个高场区C信号。
DEPT谱(图3)显示：谱中有1个-CH2-信号、11个-CH3和-CH-信号，结合13C-NMR谱，我们可以推测分子中含有15个季C、1个-CH2-(C-6)、11个-CH3和-CH-。
结合13C-NMR谱：C-3、C-4、C-5，1H-NMR谱：δ：3.50(3H，s)、3.66(3H，s)、3.96(3H，s)，可以推测出这3个C信号和9个H信号分别为3个-OCH3的C、H信号。
在13C-NMR谱可以看出，在低场区有21个C信号，δ180.4为1个C＝O信号，而δ:94.5、99.2为黄酮的(黄酮C-6位、C-8位)特征C信号，所以推测出化合物1应该含有1个黄酮母核结构；除了黄酮在低场的15个C信号，在低场还剩下6个C信号，我们推测这可能为1个苯环上的6个C信号。
HSQC谱(图4)显示：C-1与H-6相关，C-2与H-2相关，C-3与H-4相关(-OCH3)，C-4与H-5相关(-OCH3)，C-5与H-3相关(-OCH3)，C-6与H-1相关，C-7与H-11相关，C-8与H-9相关，C-9与H-13相关，C-12与H-12相关，C-13与H-10相关，C-15与H-8相关；又由于C-6只能看到与H-1相关、而DEPT谱显示分子中C-6为-CH2-，仔细分析，得出可能有一个相关氢信号包含在峰H-3中。
HMBC谱(图5)显示：H-12(1H,d,J＝2.0)与C-13、C-15、C-19、C-20相关，C-12与H-8(1H,dd,J＝2.0,8.0)、H-10(1H,d,J＝8.0)相关，H-10与C-12、C-17、C-19、C-20相关，H-8与C-12、C-19相关，H-3(-OCH3)与C-20相关，H-14(-OH)与C-19、C-20、C-13相关，结合HSQC谱，推测分子中可能含有以下片段1(式Ⅱ)：
除了上述基团外，在13C-NMR谱的低场中刚好剩下15个C信号，应该为1个黄酮母核结构(式Ⅲ)。
结合1H-NMR谱，除去片段1中的3个芳香质子，此结构中应只含有3个芳香质子H-9(1H,d,J＝2.0)、H-11(1H,d,J＝2.0)、H-13(1H,s)。HSQC谱显示，C-8与H-9相关，C-7与H-11相关，C-9与H-13相关。HMBC谱显示，H-11与C-23、C-26、C-8、C-10相关；H-9与C-7、C-10、C-25、C-26相关；H-16(-OH)与C-7、C-8、C-26相关；H-17(-OH)与C-8、C-10、C-25相关；H-15(-OH)与C-18、C-21、C-22相关；H-4(-OCH3)与C-21相关；H-5(-OCH3)与C-22相关；H-13与C-14、C-16、C-18、C-21、C-22、C-24相关，又因为此结构为黄酮结构，推测黄酮C-2位和C-3位可能是C-24、C-11，由此，我们可以推测出结构中含有以下片段2(式Ⅳ):
片段1和片段2的分子式为C24H19O9，化合物分子式为C27H24O10，所以分子中还有一个分子式为C3H5O的片段未进行归纳；从HSQC谱分析结果可知，该片段可以分别归纳为-CH2OH三部分。
又因为H-6与C-2、C-6、C-11、C-14、C-15、C-17、C-20相关，且在H谱中，H-6为单峰，H-2为多重峰，所以可以推测出以下片段3(式Ⅴ)：
片段3的分子式为C27H24O10，与化合物的分子式相同，又由于化合物的不饱和度为16，而片段3的不饱和度为15，所以片段中应该增加一个环结构，所以可以推测出分子的平面结构如式Ⅵ所示：
化合物的平面结构与(12S,13S)-Flavonolignan A一致，化合物1和(12S,13S)-Flavonolignan A的1H-NMR和13C-NMR数据归属见表1；
表1
CD结果显示，化合物1和(12S,13S)-Flavonolignan A的数据相反，化合物1和(12S,13S)-Flavonolignan A的CD谱数据见表2，化合物1的CD谱图见图6：
表2
旋光度测试结果显示，化合物1与(12S,13S)-Flavonolignan A有相反的旋光度。25℃条件下，(12S,13S)-Flavonolignan A的[α]Hg＝-43.5°(c＝0.1,MeOH)；化合物1在20℃条件下，[α]Hg＝32.5°(c＝0.1,MeOH)。
所以我们判断化合物1的构型与文献[7]中的(12S,13S)-Flavonolignan A构型相反，此化合物为新化合物，命名为(12R,13R)-Flavonolignan A，化合物1结构式如式Ⅰ：
其中，R、S-构型表示法原则为：①首先把手性碳原子所连的四个基团(a、b、c、d)按“顺序规则”的规定，进行排队。若a＞b＞c＞d，即a的顺序最大，d的顺序最小。②再把立体结构式或其透视式中d(顺序最小)的基团，放在离观察者最远的位置，而使a、b、c处在观察者的眼前。③然后从a开始，按a→b→c连成圆圈，如果a→b→c是按顺时针方向旋转，这种构型就用R表示(R是拉丁文“Rectus”的字首，是右的意思)；反之，如a→b→c是按反时针方向旋转，就用S表示(S是拉丁文“Sinister”，是左的意思)。
大量的文献报道，异甘草素、苜蓿素和salcolin B具有较好的抗胃肠道肿瘤活性。通过比较分析，我们选择了夏佛塔苷、异甘草素、苜蓿素、Salcolin B和(12R,13R)-Flavonolignan A进行抗肿瘤实验，来验证猴头菌丝体中的黄酮类化合物是否具有抗肿瘤作用，是否是猴头菌丝体活性部位中抗肿瘤的有效成分。
4蒽醌类化合物抗幽门螺杆菌实验
4.1试验材料
样品：猴头菌丝体提取物(5)(50％EtOH提取，EtOAc萃取，1％NaOH萃取，调pH3.0，EtOAc萃取，回收溶媒即得，为油状物)、猴头菌丝体提取物(6)(总提物经过硅胶柱层析后合并相应含蒽醌的流份，EtOAc萃取即得)、大黄素(7)、大黄酸(8)、大黄酚(9)、芦荟大黄素(10)、大黄素甲醚(11)；样品由前期实验中分离获得，实验时各受试品先用少量DMSO溶解，再加无菌蒸馏水稀释。对照品定容，65℃隔水加温30min除菌，4℃保存供实验用。
5黄酮类化合物抗肿瘤实验
5.1实验材料及仪器
HEPG2胃癌细胞和CACO2肠癌细胞来自湘雅三医院医学实验中心、DMEM(Gibco公司)、新生牛血清(Gibco公司)、胰蛋白酶(HYclone公司)、双抗(青霉素和链霉素溶液)(Gibco公司)、谷氨酰胺(Gibco公司)、PBS(生工上海生物工程有限公司)、MTT(鼎国昌盛生物科技有限责任公司)、DMSO(北京索莱宝科技有限公司)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)(上海旭东海普药业有限公司，20mg/瓶)，夏佛塔苷、异甘草素、苜蓿素、Salcolin B和(12R,13R)-Flavonolignan A由前期实验中分离得到。微量加样器(Eppendorf公司)、超低温冷冻储存冰箱(中科美菱)、电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)、超净工作台(Thermo公司)、CO2恒温培养箱(RS Biotech公司)、酶标仪(Bio Tek公司)。
5.2实验方法；
5.2.1细胞培养与接种
肿瘤细胞株在含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基中37℃、5％CO2培养、传代。
5.2.2供试品配制与细胞生长抑制测定
①取对数生长期的细胞，消化细胞。
②用含10％血清的培养液将细胞配制成单细胞悬液，混匀后吸取该悬液进行细胞计数，调整细胞密度为3-4×104个/ml之间。
③轻轻混匀细胞悬液，每孔100μl接种于96孔板中，并设置调零组(即只加含10％血清的培养液)，每个浓度均设六个复孔，边缘孔用无菌PBS填充。
④置于37℃、5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁后，吸弃培养液，调零组和实验对照组均加入含10％血清的培养液，试验组分别加入不同浓度的药物溶液。
⑤置37℃、5％CO2培养箱中培养44h，取出培养板每孔加入20μl MTT，培养箱继续培养4h后，取出培养板每孔加入150μl DMSO，振荡10min，使结晶充分溶解。酶标仪上选择570nm波长，测定吸光度A值，计算实际吸光度ΔA：
5.3实验结果(表2)：
表2化合物对肿瘤细胞的抑制率
表2结果表明：夏佛塔苷、异甘草素、苜蓿素、Salcolin B和(12R,13R)-Flavonolignan A对Caco-2肠癌细胞均表现出来了一定的抑制作用，其中苜蓿素、(12R,13R)-Flavonolignan A的抑制作用较强，可以达到40.92％和40.17％，但是与对照品5-FU相比，5个黄酮的抑制率都存在着一定的差距。
6结论
在黄酮类化合物抗肿瘤实验中，夏佛塔苷、异甘草素、苜蓿素、Salcolin B和(12R,13R)-Flavonolignan A对HepG2肝癌细胞和Caco-2肠癌细胞均表现出来了一定的抑制作用。在考察化合物对HepG2肝癌细胞的生长抑制率的实验中，夏佛塔苷表现出来了最好的抑制作用，在100μM的条件下，抑制率可以达到63.85％；在考察化合物对Caco-2肠癌细胞的生长抑制率的实验中，苜蓿素和(12R,13R)-Flavonolignan A都表现出来了最好的抑制作用，在100μM的条件下，抑制率分别可以达到40.92％和40.17％。以上化合物的活性与5-氟尿嘧啶相比有一定的差距，但是在实验过程中，我们的细胞培养密度较小(3-4×104个/ml)，药物作用时间较短(48h)，上述数据能较为真实地反映了化合物对HepG2肝癌细胞和Caco-2肠癌细胞的抑制能力。