本发明属于生物药物技术领域，具体涉及一种CD55特异性配体肽及其在用于制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
CD55又称促衰变因子，为细胞膜上糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定糖蛋白。主要功能是同C2竞争与C4b结合，抑制C3转化酶形成以及促进其分解，同时抑制补体C3的沉积和激活，因此能抑制补体经典途径和旁路途径激活，从而抑制机体的补体系统对肿瘤细胞的攻击，使肿瘤逃避机体免疫防御。前期预实验发现在多种实体瘤中如结肠癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等均有CD55基因的过表达，而在正常细胞表达量较少。
技术实现要素：
本发明的目的是提供了一种CD55特异性配体肽及其在用于制备抗肿瘤药物中的应用，利用本发明提供的所述CD55特异性配体肽，可高效地与肿瘤细胞表面CD55特异性结合，为下一步CD55蛋白活性位点的筛查和抗肿瘤药物的靶向投放提供条件。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种CD55特异性配体肽，其具有如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
本发明提供了一种CD55特异性配体肽，其具有如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。
本发明提供了一种CD55特异性配体肽，其具有如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。
本发明还提供了所述的CD55特异性配体肽在用于制备抗肿瘤的药物中的应用。
进一步的：所述肿瘤为宫颈癌。
进一步的：所述配体肽的用量范围为0.1-300μg/ml。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明通过噬菌体肽库展示技术筛选有效的可与肿瘤细胞表面CD55特异性结合的多肽，为CD55蛋白活性位点的筛查和抗肿瘤药物的靶向投放提供了理论支持。本发明的技术方案是国际上首次对CD55配体肽进行筛选；本发明的技术方案为CD55蛋白活性位点的筛查提供了条件，也为抗肿瘤药物的靶向投放提供理论基础。
附图说明
图1是培养平板的噬菌斑；
图2是15个噬菌体克隆进行ELISA的鉴定结果；
图3是11个单克隆噬菌体的DNA电泳分析结果；
图4是11个单克隆噬菌斑的测序结果；
图5是随机十二肽-gIII融合蛋白的N末端序列；
图6是精简遗传密码表；
图7是几种肿瘤细胞和正常细胞表面的CD55分子表达量；
图8是短肽与人高表达CD55细胞的结合特异性；
图9是配体肽对宫颈癌Hela、SiHa细胞增殖的影响；
图10是配体肽对细胞凋亡的影响；
图11是电镜观察细胞的凋亡形态。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
本发明的CD55特异性配体肽的获得包括以下步骤：噬菌体随机十二肽库→以高表达CD55的HeLa细胞为靶目标进行孵育结合→非特异性漂洗→细胞表面洗脱→扩增→挑取单克隆扩增→细胞特异性结合分析、噬菌体竞争结合分析→单克隆DNA提取、测序→序列结果比对分析→CD55特异性配体肽的设计和合成→活性检测。
实施例1
一、噬菌体肽库筛选CD55配体肽
1、噬菌体滴度的测定
本发明在开始第一轮筛选前，对噬菌体原液进行铺板测定滴度，设置一系列不同倍数稀释浓度(10，102，103···1010倍)，在稀释109倍时，如表1和图1所示，三个重复组培养平板中噬菌蓝斑。根据计算公式：N＝Y/V×X，(N：效价值即所求滴度，Y：平均噬菌斑数/皿，V：取样量，X：稀释度)，求得噬菌体滴度，如表1。
表1噬菌体原液稀释109倍时，三个重复组的噬菌斑数量
2、回收率的测定
以高表达CD55分子的Hela细胞为靶目标，经过4轮亲和筛选，计算每一轮的回收率，如表2。从表2可以看出，高亲和力结合的噬菌体随着筛选轮数的增加逐渐富集，3、4轮趋于稳定。
表2人高表达CD55 Hela细胞的CD55配体肽的筛选
3、ELISA鉴定单克隆噬菌体对人高表达CD55的Hela细胞的特异性结合
利用ELISA方法对扩增的15个噬菌体克隆进行特异性结合鉴定，如图2所示。其中编号1，2，4，5，6，9，10，11，13，14，15共11个噬菌体克隆与Hela细胞表面CD55分子有高亲和力，如表3所示。以M13噬菌体肽库为阴性对照，PBS为空白对照，计算公式为：在ELISA实验中，(OD450nm随机克隆-OD450nm空白对照)/(OD450nm阴性对照-OD450nm空白对照)＞2.1时，即表示细胞与此克隆具有高亲和力。
表3 11个高亲和力噬菌体克隆的ELISA鉴定
4、单克隆噬菌体ssDNA的检测
用超微量分光光度计测得11条ssDNA浓度，如表4。从结果可以看出，已提取出比较高浓度的ssDNA。
表4 ssDNA浓度
5、琼脂糖凝胶电泳检测提取的单克隆噬菌体ssDNA
对提取的ssDNA进行DNA电泳分析，如图3所示的11条ssDNA显现在5000bp-10000bp之间，符合其7249bp大小，提取的ssDNA序列比较完整。
6、测序及序列分析
将上述11条ssDNA对应的培养平板中的噬菌斑进行送样测序，测序结果如图4所示。根据测序结果再结合图5中随机十二肽-gIII融合蛋白的N末端序列分析出插入的12肽的DNA序列，然后通过图6中精简遗传密码表将短肽的氨基酸序列读出，根据分析结果获得3条短肽(序列分别为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3)，如表5。其中将高重复率的序列QVNGLGERSQQM(11条SSDNA中九条的氨基酸序列均为此序列)作为与人高表达CD55的Hela细胞的CD55分子特异性结合的配体肽提交到PIR国际蛋白数据库(http://pir.georgetown.edu/)进行比对，结果未发现有匹配一致的序列。交由吉尔生物公司合成此肽，并在N端连上FITC荧光进行细胞实验。
表5由DNA序列推导的氨基酸序列
二、短肽的鉴定及生物学功能的检测
1、几种肿瘤细胞和正常细胞表面的CD55分子表达量
如图7所示，通过流式细胞术检测到宫颈癌细胞SiHa、HeLa表面的CD55蛋白分子的表达量为93.4％、93.3％，明显高于正常的成骨细胞Mc3T3-E113.5％和乳腺癌细胞MDA-MB-2311.0％。
2、荧光显微镜检测短肽与人高表达CD55细胞的结合特异性
通过荧光显微镜验证观察到宫颈癌细胞SiHa(图8A)、HeLa(图8B)荧光强度明显高于正常的成骨细胞Mc3T3-E1(图8C)和乳腺癌细胞MDA-MB-231(图8D)。结果表明本发明所筛选的短肽QVNGLGERSQQM(SEQ ID No:1)为CD55分子的结合肽。
3、CCK-8法检测配体肽对宫颈癌Hela、SiHa细胞增殖的影响
如图9所示，随着活性肽(QVNGLGERSQQM)浓度的升高，宫颈癌SiHa、HeLa细胞活性逐渐变差，结果表明宫颈癌SiHa、HeLa细胞生长状态具有此活性肽的浓度依赖性。由Graph Pad软件分析结果，发现活性肽对宫颈癌SiHa、HeLa细胞的IC50为210.3、244.7μg/ml。
4、流式细胞术检测药物对细胞凋亡的影响
如图10所示，当活性肽(QVNGLGERSQQM)的浓度梯度分别为0，100，200，300(μg/ml)时，宫颈癌SiHa细胞的凋亡率分别为0.5％，1.1％，2.5％，9.4％；宫颈癌HeLa细胞的凋亡率分别为0.2％，1.3％，10.4％，19.2％，结果表明随着活性肽浓度的升高，宫颈癌SiHa、HeLa细胞的凋亡率逐渐升高。
5、电镜观察细胞的凋亡形态
如图11所示，对照组正常未凋亡的宫颈癌SiHa(图11A)、HeLa细胞(图11B)的细胞核、线粒体等细胞器形态正常；而活性肽(QVNGLGERSQQM)处理组凋亡的宫颈癌SiHa(图11C)、HeLa细胞(图11D)中部分细胞出现凋亡的形态，胞质浓缩细胞核染色加深，凋亡小体出现。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
序列表
<110> 青岛大学
<120> CD55特异性配体肽及其在用于制备抗肿瘤药物中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(phage E)
<400> 1
Gln Val Asn Gly Leu Gly Glu Arg Ser Gln Gln Met
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<210> 2
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<212> PRT
<213> 噬菌体(phage E)
<400> 2
Gly Leu Arg Thr Met Gln Ser Pro Asn Ser Phe Tyr
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<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(phage E)
<400> 3
Val Trp Asp Ser Gly Leu Arg Gln Ser Arg Pro Ala
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