与小麦条锈病抗性新基因YrQz紧密连锁的分子标记及其应用的制作方法

文档序号:15457599发布日期:2018-09-15 01:34
本发明属于小麦分子技术与育种应用领域,涉及一种与小麦条锈病抗性新基因YrQz紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
:小麦是世界上最重要的粮食作物之一,因此小麦的高产稳产品种的选育一直被育种家高度重视。小麦条锈病是由小麦条锈菌(pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的一种世界性病害,在我国条锈病是最严重的小麦病害之一。分子标记辅助育种是一种采用与特定形状相关联的分子标记作为辅助手段进行育种的有效方法,具有不受外界环境条件限制,在植物发育的组织和生育时期均可检测,且具有选择效率高的优势。麦类作物常用的分子标记技术主要分为两大类:基于分子杂交的RFLP技术和以PCR为基础的RAPD、SSR、AFLP等技术。KASP基因分型技术是一项独特的竞争型等位基因特异性PCR,可对各种基因组DNA样本,针对指定的SNPs(单核苷酸多态性)和InDels(插入和缺失)进行高精度双等位基因分型。鉴定新的抗条锈病基因,并对这些基因进行定位和分子作图,进而对于这些基因加以利用,是选育抗病品系品种的经济且简单的方法。技术实现要素:本发明的目的是提供一种与小麦条锈病抗性新基因YrQz紧密连锁的分子标记及其应用。本发明提供的第一种鉴定待测小麦是否为条锈病抗病小麦的方法,包括如下步骤:检测待测小麦的基因组DNA中特异SNP位点的基因型;如果基因型为T纯合型,待测小麦为或候选为条锈病抗病小麦;如果基因型为C纯合型,待测小麦为或候选为条锈病感病小麦;所述特异SNP位点为小麦基因组中序列表的序列1所示DNA分子的第21位核苷酸。本发明提供的第二种鉴定待测小麦是否为条锈病抗病小麦的方法,包括如下步骤:检测待测小麦的基因组DNA中特异SNP位点的基因型;如果基因型为T纯合型或者CT杂合型,待测小麦为或候选为条锈病抗病小麦;如果基因型为C纯合型,待测小麦为或候选为条锈病感病小麦;所述特异SNP位点为小麦基因组中序列表的序列1所示DNA分子的第21位核苷酸。本发明还保护一种条锈病抗病小麦育种方法,包括如下步骤:检测待测小麦的基因组DNA中特异SNP位点的基因型,选择基因型为T纯合型的小麦作为条锈病抗病育种材料;所述特异SNP位点为小麦基因组中序列表的序列1所示DNA分子的第21位核苷酸。本发明还保护一种特异引物组,由引物F1、引物F2和引物R组成。所述特异引物组的功能为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):(b1)鉴定小麦条锈病抗性;(b2)鉴定待测小麦是否为条锈病抗病小麦;(b3)鉴定待测小麦是否为条锈病感病小麦;(b4)选育条锈病抗病小麦。本发明还保护所述特异引物组的应用,为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):(b1)鉴定小麦条锈病抗性;(b2)鉴定待测小麦是否为条锈病抗病小麦;(b3)鉴定待测小麦是否为条锈病感病小麦;(b4)选育条锈病抗病小麦。本发明还保护一种试剂盒,包括所述特异引物组。所述试剂盒还可包括KASP试剂。所述试剂盒的功能为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):(b1)鉴定小麦条锈病抗性;(b2)鉴定待测小麦是否为条锈病抗病小麦;(b3)鉴定待测小麦是否为条锈病感病小麦;(b4)选育条锈病抗病小麦。本发明还保护所述试剂盒的制备方法,包括将各条引物单独包装的步骤。以上任一所述方法中,采用竞争性等位基因特异性PCR检测待测小麦的基因组DNA中特异SNP位点的基因型。竞争性等位基因特异性PCR中,采用由引物F1、引物F2和引物R组成的引物组。以上任一所述引物F1为如下(a1)或(a2):(a1)序列表的序列2所示的单链DNA分子;(a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子;以上任一所述引物F2为如下(a3)或(a4):(a3)序列表的序列3所示的单链DNA分子;(a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子;以上任一所述引物R为如下(a5)或(a6):(a5)序列表的序列4所示的单链DNA分子;(a6)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。以上任一所述方法中,竞争性等位基因特异性PCR的反应体系为(10μl):含100ng模板DNA、0.12μMF1、0.12μMF2、0.3μMR、1μLKASP试剂,余量为水。以上任一所述方法中,竞争性等位基因特异性PCR的反应程序为:94℃预变性15min;94℃变性20s,61℃-55℃退火60s(第一个循环退火温度为61℃,之后每个循环比上一个循环降低0.6℃,最后一个循环退火温度为55℃),10个循环;94℃变性20s,55℃退火60s,26个循环。本发明还保护序列表的序列1所示的DNA分子。本发明还保护序列表的序列1所示的DNA分子的应用,为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4):(c1)作为分子标记,鉴定小麦的条锈病抗性;(c2)作为分子标记,鉴定待测小麦是否为条锈病抗病小麦;(c3)作为分子标记,鉴定待测小麦是否为条锈病感病小麦;(c4)作为分子标记,选育条锈病抗病小麦。以上任一所述待测小麦为如下品种中的任意一种:京411、济麦20、铭贤169、Qz180、陕229、小偃81、烟优361。以上任一所述待测小麦为以Qz180和条锈病感病小麦为亲本得到的后代植株。具体来说,Qz180作为母本,条锈病感病小麦作为父本。所述条锈病感病小麦具体可为铭贤169。以上任一所述待测小麦为以Qz180和条锈病感病小麦为亲本得到的F2代植株。具体来说,Qz180作为母本,条锈病感病小麦作为父本。所述条锈病感病小麦具体可为铭贤169。以上任一所述待测小麦为如下F2代植株:以Qz180和条锈病感病小麦为亲本,杂交,获得的后代植株为F1代植株;F1代植株自交,获得的后代植株为F2代植株。具体来说,Qz180作为母本,条锈病感病小麦作为父本。所述条锈病感病小麦具体可为铭贤169。以上任一所述条锈病具体可为小麦条锈菌CY32引起的条锈病。鉴于Qz180对于国内最新的条锈菌系表现出近免疫,因此,Qz180对小麦抗条锈病育种具有重要的应用价值。对Qz180进行分子作图进而选择紧密连锁的分子标记对于抗条锈病基因YrQZ的利用具有十分重要的意义。本发明所提供的小麦条锈病抗性基因YrQZ的连锁标记可用于检测小麦品种或品系中是否含有提高小麦条锈病抗性基因YrQZ,以便快速筛选出具有条锈病抗性基因YrQZ的小麦品种或者品系用于育种,可大大加快小麦条锈病抗性品种的选育进程。将本发明提供的与小麦条锈病抗性新基因YrQZ的紧密连锁的分子标记用于小麦育种,筛选快速精准,不受环境影响,选择目标明确,而且节约了生产成本,大大提高了条锈病抗性小麦品种的选择效率和质量。本发明可加快条锈病高抗小麦的选育进程。附图说明图1为条锈菌接种试验中示例性植株的表型照片。图2为基因型检测时部分植株的示例性结果具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。KASP试剂即KASPMastermix,英国LGC公司,货号KBS-1016-017。普通六倍体小麦Qz180,简称Qz180,染色体组形式为AABBDD。普通六倍体小麦铭贤169,简称铭贤169,染色体组形式为AABBDD,为高感条锈病的冬小麦。条锈菌接种试验(接种在苗期进行):待测小麦植株长至第2叶展平时,将小麦条锈菌CY32生理小种接种至第2叶,然后将接种后的小麦植株置于温室中培养15天(此时作为感病对照的铭贤169充分显症),然后观察表型,确定反应型。培养条件:15℃、80%湿度,14h/d光照(光强10000Lux)。反应型根据小麦过敏性坏死反应有无和其强度划分,用以表示小麦的条锈病抗病程度。反应型分为如下六个类型:0、0;、1、2、3、4;各类型可附加“-”或“+”,以表示偏轻或偏重。反应型划分标准如下:0(免疫型):叶上不产生任何可见的症状;0;(近免疫型):叶上产生小型枯死斑,不产生夏孢子堆;1(高度抗病型):叶上产生枯死条点或条斑,夏孢子堆很小,数目很少;2(中度抗病型):夏孢子堆小到中等大小,较少,其周围叶组织枯死或显著褪绿;3(中度感病型):夏孢子堆较大、较多,其周围叶组织有褪绿现象;4(高度感病型):夏孢子堆大而多,周围不褪绿。实施例1、抗条锈病基因YrQZ的遗传分析、差异分子标记分析以及遗传连锁图谱构建一、抗条锈病基因YrQZ的遗传分析1、基因推导Qz180具有良好的条锈病抗性,对当前国内流行的小麦条锈菌小种(CY32、CY33)都表现出免疫或高抗。基因推导表明,Qz180中存在一个新的条锈病抗性基因,推测其优良抗性由该基因控制,本发明的发明人将这个新基因暂定名为YrQZ基因。2、构建F2群体(1)Qz180作为母本,铭贤169作为父本,杂交,获得的后代植株为F1代植株。(2)F1代植株自交,获得的后代植株为F2代植株。共获得767株F2代植株,组成F2群体。3、条锈病抗性鉴定将步骤2得到的767株F2代植株分别进行条锈菌接种试验。767株植株中,有602株抗病植株和165株感病植株。卡平方测验表明,F2群体中的抗病植株和感病植株的分离比例符合3:1(X23:1=2.486<X20.05.1=3.84)。结果表明,YrQZ基因是一个显性单基因。将20株Qz180进行条锈菌接种试验,所有植株均抗病。将20株铭贤169进行条锈菌接种试验,所有植株均感病。示例性植株的表型照片见图1(条锈菌接种试验中培养15天后植株的照片)。二、差异分子标记的发现和引物组的设计以步骤一的2得到的767株F2代植株为研究对象,发掘特异SNP,发现了一个与YrQZ基因紧密连锁的特异SNP,为C/T多态。在该特异SNP的基础上,基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术,将其转换为共显性KASP标记,又称为共显性标记AX-111106851。共显性标记AX-111106851如序列表的序列1所示。用于检测共显性标记AX-111106851的引物组如下:F1(序列表的序列2):5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGAACCAACTTTACTGCGCAC-3’;F2(序列表的序列3):5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGAACCAACTTTACTGCGCAT-3’;R(序列表的序列4):5’-AAACTGACGCTCTAGCAGCC-3’。三、应用引物组检测F2代植株以步骤一的2得到的767株F2代植株为研究对象,应用步骤二设计的引物组检测其基于特异SNP的基因型。1、取植株叶片,提取基因组DNA。2、以步骤1提取的基因组DNA为模板,进行PCR扩增。PCR扩增体系(10μl):含100ng模板DNA、0.12μMF1、0.12μMF2、0.3μMR、1μLKASP试剂,余量为水。PCR扩增程序:94℃预变性15min;94℃变性20s,61℃-55℃退火60s(第一个循环退火温度为61℃,之后每个循环比上一个循环降低0.6℃,最后一个循环退火温度为55℃),10个循环;94℃变性20s,55℃退火60s,26个循环;10℃保存。设置用等体积水代替模板DNA的空白对照。3、完成步骤2后,将PCR扩增产物置于ABI7500荧光定量PCR仪进行荧光收集。具体程序为:94℃变性20s,57℃退火60s,6个循环;30℃、1min,收集FAM荧光信号(蓝色)和HEX荧光信号(红色)。对于某一植株来说,如果其检测结果显示蓝色荧光信号(FAM),基于特异SNP,该植株为T纯合型。对于某一植株来说,如果其检测结果显示红色荧光信号(HEX),基于特异SNP,该植株为C纯合型。对于某一植株来说,如果其检测结果显示绿色荧光信号,基于特异SNP,该植株为CT杂合型。部分植株的示例性结果见图2。图2中,横坐标表示读取HEX的荧光强度值,纵坐标表示读取的FAM的荧光强度值。图2中,左下角的×,表示空白对照。767株F2代植株中,187株为T纯合型,161株为C纯合型,419株为CT杂合型。187株为T纯合型的植株中,186株为条锈病抗病植株,仅1株为条锈病感病植株。161株C纯合型的植株中,160株为条锈病感病植株,仅1株为条锈病抗病植株。419株CT杂合型植株中,415株为条锈病抗病植株,仅4株为条锈病感病植株。四、应用引物组检测亲本植株将Qz180和铭贤169进行检测,方法同步骤三。20株Qz180均为T纯合型。20株铭贤169均为C纯合型。五、测序验证将步骤三的2的PCR扩增产物和步骤四的2的PCR扩增产物进行测序,各个植株均得到了54bp的扩增产物,如序列表的序列1所示。步骤三和步骤四中基因型检测的结果,准确率为100%。六、遗传连锁图谱构建利用共显性标记AX-111106851,通过遗传作图软件MapManagerQTX(Manlyetal.2001)进行分析,用软件的‘ripple’功能进行多点顺序排列,LOD值设定为3.0。使用‘Kosambimapping’功能将重组值转换为遗传距离(cM)。共显性标记AX-111106851位于小麦2AL染色体,位于YrQZ基因靠着丝点一侧,遗传距离为1.84cM。实施例2、应用引物组检测现有品种待测小麦:京411(J411)、济麦20(JM20)、铭贤169(MX169)、Qz180、陕229(S229)、小偃81(XY81)、烟优361(YY361)。按照实施例1的步骤三的方法,检测待测小麦的基因型。每种小麦检测20株,结果一致。将待测小麦分别进行条锈菌接种试验。每种小麦检测20株,结果一致。结果见表1。表1J411JM20MX169Qz180S229XY81YY361基因型CCCCCCTTCCCCCC条锈菌接种试验的反应型4级4级4级0;级4级4级4级SEQUENCELISTING<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所<120>与小麦条锈病抗性新基因YrQz紧密连锁的分子标记及其应用<130>GNCYX180717<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>54<212>DNA<213>Artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(21)<223>y=cort<400>1tgaaccaactttactgcgcayacgattttatcatggctgctagagcgtcagttt54<210>2<211>42<212>DNA<213>Artificialsequence<400>2gaaggtcggagtcaacggatttgaaccaactttactgcgcac42<210>3<211>42<212>DNA<213>Artificialsequence<400>3gaaggtgaccaagttcatgcttgaaccaactttactgcgcat42<210>4<211>20<212>DNA<213>Artificialsequence<400>4aaactgacgctctagcagcc20当前第1页1 2 3 
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