本发明属于石韦提取
技术领域：
，尤其是一种基于响应面法石韦绿原酸提取方法。
背景技术：
石韦为水龙骨科植物庐山石韦pyrrosiasheareri(bak.)ching、石韦pyrrosialingua(thunb.)farwell或有柄石韦pyrrosiapetiolosa(christ)ching的干燥叶。其主要有效成分为绿原酸。药理研究表明绿原酸具有降糖、降血脂、抗菌、抗病毒等活性。关于石韦绿原酸的超声法提取及回流法提取已见文献报道，其中超声法提取以乙醇作为提取溶剂，存在提取溶剂用量大，对提取设备有特殊要求等缺点，而回流法提取也是以乙醇作为提取溶剂，存在有机溶剂用量大，提取耗时长等缺点。酶法提取是通过选用恰当的生物酶，在温和条件下降解植物细胞壁，从而促进有效成分的释放，达到高效提取中药有效成分或部位的目的。酶法提取具有提取条件温和、能耗小，对设备无特殊要求等优点，目前尚未见该技术在石韦绿原酸提取中的应用研究。传统的单变量优化试验存在不考虑各个因素之间交互作用的不足，而响应面法的试验是一种优化过程的综合技术，具有试验次数少、周期短、精度高等特点。采用该法可建立连续变量曲面模型，对影响过程的交互因素及其相互作用进行评价，确定最佳水平范围，而且所需的试验组次数较少，因此在药学中提取药物活性成分领域得到广泛的应用。基于此，为了能够实现酶法提取石韦绿原酸，使得绿原酸得率得到大幅度的提高，降低提取成本，本研究者结合响应面法和复合酶法应用于石韦绿原酸成分进行探索，为石韦绿原酸提供一种新思路。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种基于响应面法石韦绿原酸提取方法具体通过以下方式实现一种基于响应面法石韦绿原酸提取方法，包括以下步骤：(1)将石韦烘干、粉碎，得石韦粉末；(2)称取石韦粉末，加入缓冲溶液，调整ph值为2.5-3.5，加入复合酶酶解45-75min，复合酶用量以每g石韦计为9-15mg，酶解温度为45-55℃；(3)将步骤(2)酶解后的物料进行过滤，得到粗提液；(4)采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干12-48h，即可。优选地，石韦粉末为50～120目。优选地，烘干时间为24h。所述复合酶中酸性蛋白酶和果胶酶重量比为2:1。所述缓冲溶液为醋酸-醋酸盐溶液、磷酸-磷酸二氢盐溶液、磷酸-磷酸氢盐溶液中任一种。所述步骤(2)酶解温度50℃、酶解时间62min、酶解ph值3.0、复合酶用量12mg/g。所述的步骤(2)，其在酶解温度、酶解时间、酶解ph值及复合酶用量确定的时候，应当使得各指标参数满足如下关系式：y＝-96.77667+2.73600a+0.25711b+11.55833c+2.71250d+0.00117ab+0.02400ac-0.01350ad-0.01367bc-0.00067bd-0.12333cd-0.02728a2-0.00214b2-1.71333c2-0.06926d2；其中，a表示酶解温度，b表示酶解时间，c表示酶解ph值，d表示复合酶用量，y为绿原酸得率。所述的关系式，是以酶解温度a、酶解时间b、酶解ph值c、复合酶用量d为自变量，并根据四个因素单因素试验进行调整，获得酶解温度a、酶解时间b、酶解ph值c、复合酶用量d的最优值，并以该最优值为基础，根据box-behnken试验设计原则，以绿原酸得率为响应值y，建立绿原酸得率的多元二次方程，并得出多元二次方程后，根据方程的最大值计算出相应的参数。优选地，醋酸盐为醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵中任一种。优选地，磷酸二氢盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中任一种。优选地，磷酸氢盐为磷酸氢钾、磷酸氢盐中任一种。有益效果本发明通过响应面法对复合酶法提取石韦绿原酸的工艺参数进行界定，其能够充分考虑各个因素及两两因素相互作用对得到充分的弥补和完善，通过响应面法得到了最佳酶法提取石韦绿原酸的工艺参数；使得石韦绿原酸得率达到12.07mg/g以上，本发明提取方法条件温和，较大程度的保留了提取物中的有效成分，该提取方法具有高效、可控、稳定的特点。附图说明图1为酶解温度对石韦绿原酸得率的影响图；图2为酶解时间对石韦绿原酸得率的影响图；图3为酶解ph值对石韦绿原酸得率的影响图；图4为复合酶用量对石韦绿原酸得率的影响图；图5为酶解温度和酶解时间对石韦绿原酸得率影响的响应面三维图；图6为酶解温度和酶解ph值对石韦绿原酸得率影响的响应面三维图；图7为酶解温度和复合酶用量对石韦绿原酸得率影响的响应面三维图；图8为酶解时间和酶解ph值对石韦绿原酸得率影响的响应面三维图；图9为酶解时间和复合酶用量对石韦绿原酸得率影响的响应面三维图；图10为酶解ph值和复合酶用量对石韦绿原酸得率影响的响应面三维图。具体实施方式下面结核具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。实施例1将石韦干燥、粉碎成80目，得到石韦粉末；称取石韦粉末20.0000g，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在酶解温度55℃、酶解时间45min、酶解ph值3.0、复合酶(酸性蛋白酶：果胶酶＝2:1)用量12mg/g条件下进行酶法提取，将酶解后的物料进行过滤，得到粗提液；采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可得到粗提物；称取上述粗取物，采用50％甲醇溶解，稀释后，采用高效液相色谱法测定石韦绿原酸，并根据绿原酸得率y＝[(绿原酸含量×提取物重量)/石韦药材重量]×100％，计算出绿原酸得率为12.07mg/g。实施例2将石韦干燥、粉碎成80目，得到石韦粉末；称取石韦粉末20.0000g，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在酶解温度50℃、酶解时间60min、酶解ph值3.5、复合酶(酸性蛋白酶：果胶酶＝2:1)用量9mg/g条件下进行酶法提取，将酶解后的物料进行过滤，得到粗提液；采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可得到粗提物；称取上述粗取物，采用50％甲醇溶解，稀释后，采用高效液相色谱法测定石韦绿原酸，并根据绿原酸得率y＝[(绿原酸含量×提取物重量)/石韦药材重量]×100％，计算出绿原酸得率为12.86mg/g。实施例3将石韦干燥、粉碎成80目，得到石韦粉末；称取石韦粉末20.0000g，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在酶解温度50℃、酶解时间75min、酶解ph值3.5、复合酶(酸性蛋白酶：果胶酶＝2:1)用量12mg/g条件下进行酶法提取，将酶解后的物料进行过滤，得到粗提液；采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可得到粗提物；称取上述粗取物，采用50％甲醇溶解，稀释后，采用高效液相色谱法测定石韦绿原酸，并根据绿原酸得率y＝[(绿原酸含量×提取物重量)/石韦药材重量]×100％，计算出绿原酸得率为12.97mg/g。实施例4将石韦干燥、粉碎成80目，得到石韦粉末；称取石韦粉末20.0000g，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在酶解温度50℃、酶解时间75min、酶解ph值2.5、复合酶(酸性蛋白酶：果胶酶＝2:1)用量12mg/g条件下进行酶法提取，将酶解后的物料进行过滤，得到粗提液；采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可得到粗提物；称取上述粗取物，采用50％甲醇溶解，稀释后，采用高效液相色谱法测定石韦绿原酸，并根据绿原酸得率y＝[(绿原酸含量×提取物重量)/石韦药材重量]×100％，计算出绿原酸得率为12.94mg/g。实施例5将石韦干燥、粉碎成80目，得到石韦粉末；称取石韦粉末20.0000g，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在酶解温度45℃、酶解时间60min、酶解ph值3.0、复合酶(酸性蛋白酶：果胶酶＝2:1)用量15mg/g条件下进行酶法提取，将酶解后的物料进行过滤，得到粗提液；采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可得到粗提物；称取上述粗取物，采用50％甲醇溶解，稀释后，采用高效液相色谱法测定石韦绿原酸，并根据绿原酸得率y＝[(绿原酸含量×提取物重量)/石韦药材重量]×100％，计算出绿原酸得率为12.54mg/g。在本发明创造的某些实施例中，对于干燥粉碎后的粉末颗粒度在70-90目之间；在某些实施例中采用缓冲液为醋酸-醋酸盐溶液或磷酸-磷酸二氢盐溶液或磷酸-磷酸氢盐溶液。上述的醋酸盐为醋酸钾、醋酸铵中任一种，上述的磷酸二氢盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中任一种；所述的磷酸氢盐为磷酸氢钾、磷酸氢盐中任一种。试验例：将石韦粉末采用复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)进行酶法提取，得到粗提液；并将粗提液进行浓缩至稠膏，采用真空干燥箱烘干后，烘干12-48h，优选烘干24h；采用高效液相色谱法定量分析绿原酸的含量，在高效液相色谱法测定过程中，流动相采用乙腈:0.5％磷酸溶液＝11:89的体积比混合溶液，流速为1ml/min，并在波长为326nm下绘制石韦绿原酸的标准曲线，具体的回归方程如下：y绿原酸＝76282142.86x-197540.00(r2＝0.9998)，其中y绿原酸为绿原酸含量，x为绿原酸的峰面积。石韦绿原酸得率y＝[(绿原酸含量×提取物重量)/石韦原药材重量]×100％，对酶解温度、酶解时间、酶解ph值、复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量作为石韦绿原酸得率影响的四个因素，并将上述四个因素进行单因素试验，确定四个因素在其他因素不变前提下的最优水平，具体单因素试验操作如下步骤：(1)酶解温度单因素试验以酶解时间60min，酶解ph值3.0，复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量12mg/g，酶解温度40℃、45℃、50、55℃、60℃条件进行酶法提取，并测定计算出石韦绿原酸得率，得出酶解温度最优值，其测定结果如图1所示。从图1可知，在酶解时间、酶解ph值纤、复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量相同的条件下，当酶解温度为50℃时，绿原酸得率最高，因此，酶解温度以50℃为宜。(2)酶解时间单因素试验以酶解温度50℃，酶解ph值3.0，复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量12mg/g，酶解时间30min、45min、60min、75min、90min，并测定计算出石韦绿原酸得率，得到酶解时间最优值，其结果如图4所示。从图2可知，在酶解温度、酶解ph值、复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量相同的条件下，当酶解时间为60min时，绿原酸得率达到最大值，随着酶解时间进一步延长，绿原酸得率增加趋势平缓，因此，酶解时间以60min为宜。(3)酶解ph值单因素试验以酶解温度50℃，酶解时间60min，复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量12mg/g，酶解ph值2.5、3.0、3.5、4.0、4.5条件进行酶法提取，并测定计算出石韦绿原酸得率，得到酶解ph最优值，其结果如图3所示。从图3可知，在酶解温度、酶解时间、复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量相同的条件下，当酶解ph值为3.0时，绿原酸得率达到最大值。因此，酶解ph值以3.0为宜。(4)复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶)用量单因素试验以酶解温度50℃，酶解时间60min，酶解ph值3.0，复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量6mg/g、9mg/g、12mg/g、15mg/g、18mg/g条件进行酶法提取，并测定计算出石韦绿原酸得率，得到复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量最优值，其结果如图4所示。从图4可知，在酶解温度、酶解时间、酶解ph值相同的条件下，当复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量为12mg/g时，绿原酸得率达到最大值，因此，复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量以12mg/g为宜。在完成以上单因素试验操作处理步骤之后，将上述单因素试验得到的结果拟定为最优水平，并进行响应面优化设计，具体水平设置表为表1：表1利用design-expert软件根据box-benhnken设计原则进行四因素三水平实验设计，试验方案以及响应结果如表2所示：表2以酶解温度a、酶解时间b、酶解ph值c、复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量d为自变量，以石韦绿原酸得率为响应值y，建立多元二次方程，并对多元二次方程进行计算，得到回归方程如下：y＝-96.77667+2.73600a+0.25711b+11.55833c+2.71250d+0.00117ab+0.02400ac-0.01350ad-0.01367bc-0.00067bd-0.12333cd-0.02728a2-0.00214b2-1.71333c2-0.06926d2。对上述石韦绿原酸回归方程进行方差分析，其结果如表3所示：表3来源平方和自由度方差f值p值模型4.5100140.320019.68<0.0001a-酶解温度0.046010.04602.790.1208b-酶解时间0.240010.240014.370.0026c-酶解ph值0.095010.09505.830.0326d-复合酶用量0.130010.13007.960.0154ab0.031010.03101.870.1964ac0.014010.01400.880.3667ad0.160010.160010.020.0081bc0.042010.04202.570.135bd0.003610.00360.220.6474cd0.140010.14008.370.0135a22.480012.4800151.64<0.0001b21.240011.240075.75<0.0001c20.980010.980059.8<0.0001d22.070012.0700126.64<0.0001残差0.2000120.0160失拟0.1900100.01903.810.2258纯误差0.009820.0049总和4.710026并利用design-expert软件对多元二次回归方程进行响应面分析，得到回归方程各因素相互之间的响应面图，如图5～图10所示。最终得出石韦绿原酸的复合酶提取法优化后的工艺参数为：酶解温度49.92℃、酶解时间62.03min、酶解ph值3.05、复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量11.70mg/g。并根据实际情况进行了工艺参数的修正，并修正为：酶解温度50℃、酶解时间62min、酶解ph值3、复合酶(酸性蛋白酶:果胶酶＝2:1)用量12mg/g，在该修正后的工艺条件下进行三次平行试验，其石韦绿原酸得率分别为13.54mg/g、13.64mg/g、13.58mg/g，平均值13.59mg/g。在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。当前第1页12