本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种姜黄素衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
癌症是一种以基因突变和表观遗传学改变为特征的复杂疾病，在长期致癌因子的刺激下，基因突变和功能调节异常导致正常细胞的持续过度增殖。癌症对人类健康构成严重威胁，其新发病率和死亡率连年攀升。
近年来，研究报道显示了天然传统中药对癌症有着较好的疗效且毒性小，大大提高患者的生存质量。中药单体化合物姜黄素(curcumin，cu)是一种从姜科植物姜黄的根茎中提取得到的天然低毒的酚性色素，作为食品添加剂已经使用了几个世纪，安全性较高，即使在高剂量(12g/d)情况下，也没有出现任何明显毒副作用。姜黄素具有多种药理作用，如抗肿瘤、抗菌、抗炎、清除自由基、提高免疫力等，其中抗肿瘤作用更是科研工作者们的研究热点。1985年，packard等就提出姜黄素可能具有抗癌活性，随后，众多体外和体内试验表明姜黄素具有广泛的抗肿瘤作用，包括消化系统(胃、肠、肝、胰腺和结肠)肿瘤，泌尿系统(前列腺和肾)肿瘤、生殖系统(宫颈和子宫等)肿瘤，血液系统肿瘤、乳腺、肺和脑肿瘤等，被美国国立癌症研究所(nationalcancerinstitute,nci)列为第三代肿瘤化学预防药物，由此提示，姜黄素在抗肿瘤方面具有良好的发展前景。然而，姜黄素也存在自身的局限性：水溶性差，对光、热敏感，在碱性及中性条件下极不稳定。同时，姜黄素在人体中稳定性差，容易被血浆组织中的酶代谢灭活，口服吸收差，导致生物利用度低。
目前对姜黄素的改造思路主要体现在苯环取代基、羰基及亚甲基等活性位点的修饰。研究表明，姜黄素由两部分构成，即共轭的β-二酮链连接两个苯环以及苯环上取代基团(羟基和甲氧基)，共轭的β-二酮链和抗肿瘤活性相关，破坏或还原β-二酮链其抗肿瘤活性会减弱或消失，而苯环上的甲氧基可提高清除自由基和增强苯酚的稳定性；酚羟基对姜黄素的稳定性起关键作用，姜黄素在体内代谢容易发生生物转化，其酚羟基可在相关酶的催化下与体内内源性物质(葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸等)结合而被清除。利用姜黄素苯环上酚羟基具有较高化学反应活性这一特点，越来越多的学者发现，可将姜黄素与其它化合物反应生成姜黄素酯，以达到改善姜黄素的稳定性，提高对细胞膜的通透性，增强抗癌活性等目的。
目前，一般与酚羟基发生酯化反应的试剂为毒性较大的酰化试剂如二氯亚砜等。也有许多研究者采用高效酯化反应催化剂dcc/dmap体系，这一体系虽然反应条件较温和，环境污染比二氯亚砜小，但纯化过程中，反应体系中的dcc，dmap等不易除去，且易产生较多副产物。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种对癌细胞具有较强杀伤作用而毒副作用较小的姜黄素衍生物。
本发明的另一个目的是提供该姜黄素衍生物的制备方法和用途。
本发明所述的姜黄素衍生物，名称为：丁二酸单酯姜黄素(succinicacidmonoestercurcumin)，缩写为samc，分子式为：1-(4-羟基-3-甲氧苯基)-7-(3-甲氧-4-丁二酸甲酯苯酯)-1,6-庚二烯-3,5-二酮，结构式为：
本发明所述的姜黄素衍生物samc的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将40～60ml浓度为0.7～1.2mol/l的姜黄素的二氯甲烷溶液加入反应器中，冰浴条件下，加入7～13ml浓度为5～10mol/l的三乙胺的二氯甲烷溶液，避光搅拌均匀得溶液m。
步骤二、将7～13ml浓度为4～8mol/l的丁二酸单甲酯酰氯的二氯甲烷溶液，缓慢滴加入溶液m中，冰浴条件下避光反应25～35min，除去有机溶剂得物质n。
步骤三、将二氯甲烷、乙酸乙酯分别按体积比180～220:1、150～190:1、130～170:1混合成三种混合液，将物质n依次用前述顺序的三种混合液作洗脱剂洗脱，收集洗脱液，用hplc检测洗脱液成分，保留时间一致的合并为一管，去除溶剂，35～45℃烘干，得姜黄素衍生物samc。
本发明所述的姜黄素衍生物samc，该samc在制备治疗肝癌和肺癌药物中的应用。
本发明所述姜黄素的衍生物samc，经硅胶柱柱层析洗脱分离纯化，条件为二氯甲烷：乙酸乙酯(v/v)＝180～220:1、150～190:1、130～170:1。其uv最大吸收波长为413nm，hplc归一化含量>98％，1hnmr(500mhz,dmso):16.25(s,1h),9.70(s,1h),7.61(d,j＝3.5hz,1h),7.58(d,j＝4.0hz,1h),7.51(s,1h),7.34(s,1h),7.31(d,j＝8.5hz,1h),7.17(d,j＝8.0hz,1h),7.12(d,j＝8.5hz,1h),6.95(d,j＝16.0hz,1h),6.84(s,1h),6.81(d,j＝4.5hz,1h),6.78(s,1h),3.84(s,6h),3.63(s,3h),2.84(t,j＝13hz,2h),2.66(t,j＝13.5hz,2h)。分子式：c26h26o9，esi-msm/z确证分子量为482。
细胞试验结果表明：姜黄素衍生物samc，主要通过作用于人肝癌细胞和肺癌细胞的细胞核，对癌细胞均有良好的抑制作用，同时诱导癌细胞凋亡。
本发明选择催化效率高且易除去的三乙胺作为催化剂，将姜黄素制成前体药物samc，保护药物被迅速降解，增加姜黄素的稳定性，提高其抗肿瘤活性，对癌细胞具有较强杀伤作用而毒副作用较小。本发明所述制备方法简便易行、副产物少，使用的催化试剂与dcc/dmap相比容易除去，能够减少对环境污染，绿色环保。
附图说明
图1为姜黄素(a)和本发明姜黄素衍生物samc(b)在200～700nm的紫外分光光度计全波长扫描图。
图2为姜黄素(a)和本发明姜黄素衍生物samc(b)的高效液相色谱图。
图3为姜黄素(a)和本发明姜黄素衍生物samc的标准曲线图。
图4为空白固体脂质纳米粒(a)和姜黄素衍生物samc的固体脂质纳米粒samc-sln(b)在200-700nm的紫外分光光度计全波长扫描图。
图5为本发明姜黄素衍生物samc的固体脂质纳米粒samc-sln的粒径分布图(a)和zeta电位图(b)。
图6为本发明姜黄素衍生物samc的固体脂质纳米粒samc-sln的透射电镜图。
图7为姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln的xrd图(a)和dsc图(b)。
图8为姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln体外释放48h的累积释放率图(n＝3)。
图9为姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln分别在24h(a)、48h(b)、72h(c)和96h(d)对人肝癌smmc-7721细胞的抑制率(％)(
图10为姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln分别在24h(a)、48h(b)、72h(c)和96h(d)对人肝癌sk-hep-1细胞的抑制率(％)(
图11为姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln分别在24h(a)、48h(b)、72h(c)和96h(d)对人肝癌hepg-2细胞的抑制率(％)(
图12为姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln分别在24h(a)、48h(b)、72h(c)和96h(d)对人肝细胞l02的抑制率(％)(
图13为姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln分别在24h(a)、48h(b)、72h(c)和96h(d)对人肺癌细胞a549的抑制率(％)(
图14为姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln分别在24h(a)、48h(b)、72h(c)和96h(d)对人肺癌细胞a549-t的抑制率(％)(
图15为姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln分别在24h(a)、48h(b)、72h(c)和96h(d)对人肺癌细胞h460的抑制率(％)(
图16为姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln分别在24h(a)、48h(b)、72h(c)和96h(d)的ic50值(
图17为姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln作用48h对人肝癌smmc-7721细胞的形态检查(a)空白对照组、(b)100μg/mlcu、(c)100μg/mlsamc、(d)100μg/mlsamc-sln。
图18为姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln作用48h对人肺癌a549细胞的形态检查(a)空白对照组、(b)100μg/mlcu、(c)100μg/mlsamc、(d)100μg/mlsamc-sln。
图19为通过激光扫描共聚焦显微镜检测姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln在人肝癌smmc-7721细胞内分布状态(a)对照组、(b)cu、(c)samc、(d)samc-sln。
图20为通过激光扫描共聚焦显微镜检测姜黄素cu、姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln在人肺癌a549细胞内分布状态(a)对照组、(b)cu、(c)samc、(d)samc-sln。
图21为本发明通过流式细胞仪检测药物在48h对人肝癌smmc-7721细胞的凋亡作用。
图22为本发明通过流式细胞仪检测药物在48h对人肺癌a549细胞的凋亡作用。
具体实施方式
本发明所采用的仪器与材料：agilent-1260高效液相色谱仪(美国agilent科技有限公司)；sh-2磁力搅拌器(成都华衡仪器有限公司)；re3000旋转蒸发仪(上海科兴仪器有限公司)；a390型紫外可见分光光度计(上海翱艺仪器有限公司)；艾柯超纯水机(成都唐氏康宁科技发展有限公司)；inova-600核磁共振波谱仪(美国varian有限公司)；shb-iiia循环水式真空泵(北京中兴伟业仪器有限公司)；scientz-iid超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司)；lgj-18c冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)；zetasizernanos90粒度测定仪(英国malvern仪器有限公司)；s-3000n透射电镜(日本hitachi公司)；d/max2500型x射线衍射仪(日本东京rigaku公司)；sta-449f3差式扫描量热仪(德国netzsch公司)；zrs-8g智能溶出试验仪(天津市天大天发科技有限公司)；spectramaxm3多功能酶标仪(美国moleculardevices公司)；evos倒置显微镜(美国amg公司)；leicatcssp8激光共聚焦扫描显微镜(德国徕卡有限公司)；facscantoii流式细胞仪(美国bd有限公司)。姜黄素(成都贝斯特试剂有限公司，纯度>98％)；丁二酸单甲酯酰氯(成都贝斯特试剂有限公司，纯度>98％)；三乙胺(成都金山化学试剂有限公司，纯度>98％)；hspc(德国lipoidgmbh公司)；pvpk15(山东优索化工科技有限公司)；dapi染色液(碧云天生物科技有限公司)；annexinv-fitc/pi双染凋亡检测试剂盒(江苏凯基有限公司)。
实施例1：姜黄素衍生物samc的制备
将40ml浓度为0.7mol/l的姜黄素的二氯甲烷溶液加入反应器中，冰浴条件下加入7ml浓度为10mol/l的三乙胺的二氯甲烷溶液，避光搅拌混匀得溶液m。将13ml浓度为8mol/l的丁二酸单甲酯酰氯的二氯甲烷溶液，缓慢滴加入溶液m中，冰浴条件下避光反应25min，用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂得物质n。准备直径为3cm，高度为45cm的硅胶柱，采用湿法上样的方法，将二氯甲烷溶剂中加入适量的硅胶粉末(300目)，用玻璃棒充分搅拌溶解均匀，超声除去气泡；往硅胶柱中填入约20cm高的硅胶液，洗耳球轻敲柱子两边使得柱子装平稳；同时，将硅胶柱的下口打开，待液面缓缓下降后，加压，使得柱子装结实，完成装柱。待分离的样品取2ml上样，用二氯甲烷加压淋洗2～3个柱体积平衡体系，将二氯甲烷和乙酸乙酯分别按体积比180:1、190:1、130:1混合成三种混合液，将物质n依次用前述顺序的三种混合液作洗脱剂洗脱，出现黄色溶液时，开始收集洗脱液，每10ml为一管，用hplc检测洗脱液成分，保留时间一致的合并为一管，再用减压旋转蒸发仪去除溶剂，45℃烘干，得到黄色物质——黄素衍生物samc。
实施例2：姜黄素衍生物samc的制备
将60ml浓度为1.2mol/l的姜黄素的二氯甲烷溶液加入反应器中，冰浴条件下加入13ml浓度为5mol/l的三乙胺的二氯甲烷溶液，避光搅拌混匀得溶液m。将7ml浓度为4mol/l的丁二酸单甲酯酰氯的二氯甲烷溶液，缓慢滴加入溶液m中，冰浴条件下避光反应35min，用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂得物质n。准备直径为3cm，高度为45cm的硅胶柱，采用湿法上样的方法，将二氯甲烷溶剂中加入适量的硅胶粉末(400目)，用玻璃棒充分搅拌溶解均匀，超声除去气泡；往硅胶柱中填入约20cm高的硅胶液，洗耳球轻敲柱子两边使得柱子装平稳；同时，将硅胶柱的下口打开，待液面缓缓下降后，加压，使得柱子装结实，完成装柱。待分离的样品取2ml上样，用二氯甲烷加压淋洗2～3个柱体积平衡体系，将二氯甲烷和乙酸乙酯分别按体积比220:1、150:1、170:1混合成三种混合液，将物质n依次用前述顺序的三种混合液作洗脱剂洗脱，出现黄色溶液时，开始收集洗脱液，每10ml为一管，用hplc检测洗脱液成分，保留时间一致的合并为一管，再用减压旋转蒸发仪去除溶剂，35℃烘干，得到黄色物质——黄素衍生物samc。
实施例3：姜黄素衍生物samc的制备
将50ml浓度为0.9mol/l的姜黄素的二氯甲烷溶液加入反应器中，冰浴条件下加入10ml浓度为8mol/l的三乙胺的二氯甲烷溶液，避光搅拌混匀得溶液m。将10ml浓度为6mol/l的丁二酸单甲酯酰氯的二氯甲烷溶液，缓慢滴加入溶液m中，冰浴条件下避光反应30min，用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂得物质n。准备直径为3cm，高度为45cm的硅胶柱，采用湿法上样的方法，将二氯甲烷溶剂中加入适量的硅胶粉末(200目)，用玻璃棒充分搅拌溶解均匀，超声除去气泡；往硅胶柱中填入约20cm高的硅胶液，洗耳球轻敲柱子两边使得柱子装平稳；同时，将硅胶柱的下口打开，待液面缓缓下降后，加压，使得柱子装结实，完成装柱。待分离的样品取2ml上样，用二氯甲烷加压淋洗2～3个柱体积平衡体系，将二氯甲烷和乙酸乙酯分别按体积比200:1、170:1、150:1混合成三种混合液，将物质n依次用前述顺序的三种混合液作洗脱剂洗脱，出现黄色溶液时，开始收集洗脱液，每10ml为一管，用hplc检测洗脱液成分，保留时间一致的合并为一管，再用减压旋转蒸发仪去除溶剂，40℃烘干，得到黄色物质——黄素衍生物samc。
实施例4：姜黄素衍生物samc结构通过uv、hplc、1hnmr及ms表征
结果由图1可见，本发明姜黄素衍生物samc在200～700nm的紫外分光光度计进行全波长扫描，samc的最大吸收波长为413nm，而姜黄素cu的最大吸收波长为424nm，说明姜黄素cu一端的酚羟基被掩蔽，由于基团的吸电子作用，出现蓝移。高效液相色谱条件为：色谱柱：inertsilods-spc18(5μm，4.6×250mm，madeinjapan)；保护柱：phenomenexc18(4.0mm×3.0mm)；柱温：25℃；进样量：20μl；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液(65:35，v/v,ph3.5)；流速：1.0ml/min；检测波长：424nm。由图2可见，姜黄素cu的出峰保留时间为5.58min，姜黄素衍生物samc的保留时间为8.32min，出峰时间较为理想，峰形无拖尾。说明在该hplc条件下，姜黄素cu和姜黄素衍生物samc之间明显可区分。同时根据归一化法姜黄素衍生物samc的纯度大于98％，说明该硅胶柱柱层析条件可用于分离纯化姜黄素衍生物samc单体。1hnmr(500mhz,dmso):16.25(s,1h),9.70(s,1h),7.61(d,j＝3.5hz,1h),7.58(d,j＝4.0hz,1h),7.51(s,1h),7.34(s,1h),7.31(d,j＝8.5hz,1h),7.17(d,j＝8.0hz,1h),7.12(d,j＝8.5hz,1h),6.95(d,j＝16.0hz,1h),6.84(s,1h),6.81(d,j＝4.5hz,1h),6.78(s,1h),3.84(s,6h),3.63(s,3h),2.84(t,j＝13hz,2h),2.66(t,j＝13.5hz,2h)。esi-msm/z482[m+h]+。
实施例5：姜黄素cu和姜黄素衍生物samc标准曲线的建立
称取10mg姜黄素cu置于100ml棕色容量瓶中，用甲醇-乙酸乙酯(4:1，v/v)溶解并稀释至刻度，配成浓度为100μg/ml(w/v)的对照品储备液。分别精密量取姜黄素对照品储备液适量，加甲醇-乙酸乙酯(4:1，v/v)稀释成浓度为10.0、8.0、5.0、3.0、1.2、0.8、0.32、0.08、0.04、0.02μg/ml(w/v)，于424nm处用uv测定吸光度，以药物浓度为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)，绘制姜黄素cu的标准曲线。
称取10mg姜黄素衍生物samc置于100ml棕色容量瓶中，用甲醇-乙酸乙酯(4:1，v/v)溶解并稀释至刻度，配成浓度为100μg/ml(w/v)的对照品储备液。分别精密量取samc对照品储备液适量，加甲醇-乙酸乙酯(4:1，v/v)稀释成浓度为50.0、30.0、25.0、20.0、12.0、10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5μg/ml(w/v)的系列溶液，在413nm处用uv测定吸光度，以药物浓度为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)，绘制姜黄素衍生物samc的标准曲线。
结果由图3可见，姜黄素的线性回归方程为y＝0.1853x-0.0069(r2＝0.9999)，在0.02-10μg/ml范围内具有良好的线性关系。姜黄素衍生物samc的线性回归方程为y＝0.0198x-0.0043(r2＝0.9999)，在0.5-50μg/ml范围内具有良好的线性关系，且方程拟合参数显示线性拟合方法可靠。
实施例6：姜黄素衍生物固体脂质纳米粒samc-sln的制备
称量6mg姜黄素衍生物samc、35mghspc和15mgpvpk15于圆底烧瓶中，用3ml三氯甲烷溶解，放于旋转蒸发仪于37℃，150r/min，旋转8min成膜，减压除去有机溶剂，加入6mlup水将膜溶解后转移至离心管中，经超声波破碎仪超声5min，强度50％，得到亮黄色水溶液。经0.22μm滤膜过滤后，加入1.25％蔗糖(w/v)作为冻干保护剂，放-20℃冰箱预冻，冷冻干燥机-80℃干燥24h，得到亮黄色冻干粉末(samc-sln)。空白sln制备时，除不加samc外，其余操作同上。
实施例7：姜黄素衍生物固体脂质纳米粒samc-sln表征
1、紫外吸收行为
分别取适量的samc-sln和空白sln加入适量的甲醇-乙酸乙酯(4:1，v/v)稀释，超声10min破乳，离心(4000×g，3min)，取上清液在200-700nm进行uv波长扫描。
结果由图4可见，空白固体脂质纳米粒有且只有一个最大吸收波长为210nm，samc-sln在200-700nm范围内，最大吸收波长为210nm和416nm，说明辅料在416nm处不干扰samc-sln的测量。结合图1可知，samc溶液在413nm处有最大吸收峰，说明samc吸收峰在413nm处专一性良好，溶剂和辅料对samc的测定无干扰。
2、samc-sln的粒径、pdi、zeta电位、包封率和载药量
取samc-sln冻干粉末适量，用蒸馏水溶解并稀释适当浓度，用马尔文激光粒度仪测定其粒径、pdi和zeta电位。
平行取3份samc-sln溶液各2.0ml，加入到离心管中，离心(4000×g，3min)，精密吸取上清液1.0ml至10ml棕色容量瓶中，加甲醇-乙酸乙酯(4:1，v/v)稀释定容至刻度，超声10min，离心(4000×g，3min)取上清，用uv测定其吸光度a1。同时，精密吸取1.0mlsamc-sln溶液于10ml棕色容量瓶中，加甲醇-乙酸乙酯(4:1，v/v)稀释定容至刻度，超声10min，离心(4000×g，3min)取上清，用uv测定其吸光度a0，根据公式计算包封率(ee)。
ee(％)＝a1/a0×100％
平行取3份samc-sln冻干粉wg，置10ml棕色容量瓶中，用甲醇-乙酸乙酯(4:1，v/v)稀释至刻度，超声破乳10min；离心(4000×g，3min)取上清，用uv测定吸光度，通过标准曲线，计算出实际含药量w1g，根据公式计算载药量(dl)。
dl(％)＝w1/w×100％
结果由图5和表1可见，本发明制得的samc-sln粒径和pdi分别为(104.1±2.43)nm和0.22±0.008，粒径分布较窄且呈正态分布。zeta电位为(28.3±1.60)mv，包封率为(95.5±0.38)％，载药量为(4.28±0.02)％。
表1samc-sln的粒径
3、samc-sln的形态、xrd和dsc
取适量samc-sln用蒸馏水溶解并稀释到一定倍数，滴于铜网上，2％磷钨酸染色，空气中自然晾干，用透射电镜(tem)观察samc-sln的形态。x射线衍射分析(xrd)用xd/max-2500/pc衍射仪(日本东京rigaku公司)对样品进行测定。电流：40ma，电压：40kv，扫描步长：0.016％/步，10s/步，铜靶，石墨单色器，测量0θ和90θ室温之间的衍射行为。差热扫描量热法(dsc)分析操作如下：取样品10mg置于铝盘内并密封，升温速率10℃/min，于氮气(40ml/min)保护下测定样品的热性能。
结果由图6可见：tem显示该samc-sln形态呈类球形，大小均匀，粒子间基本无粘连。结果由图7可见：xrd的结果显示samc呈晶形，包裹到固体脂质纳米粒中后无特征峰出现，说明samc在固体脂质纳米粒中呈无定形态或非晶形。dsc的结果显示samc在100-150℃之间有一个吸热峰，包裹到固体脂质纳米粒中后该峰消失，说明samc在固体脂质纳米粒中呈无定形态或非晶形，与xrd结果一致。
实施例8：cu、samc和samc-sln体外释药行为
取适量cu甲醇溶液、samc的甲醇溶液和samc-sln水溶液装入透析袋，置于200ml生理盐水(含40％甲醇和2％吐温80)，于(37±0.5)℃恒温溶出仪中，100r/min匀速搅拌，于0、10min、15min、30min、45min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h取出透析液4ml，同时补充等量的释放介质维持总体积不变。用uv测定药物的吸光度，根据标准曲线计算不同时间的累积释放度并绘制体外释放曲线。
结果由图8可见：姜黄素cu和姜黄素衍生物samc具有相似的累积释放，在相同释放介质中48h释放完全，而samc-sln在48h仅释放约50％，与姜黄素cu比较，具有显著性差异(p<0.05)，说明本文制备的samc-sln具有良好的缓释作用。
实施例9：抗肿瘤活性测定
采用mtt法测定samc和samc-sln的抗肿瘤活性。各种细胞均培养在37℃，5％co2条件下常规培养传代。人肝癌细胞smmc-7721、人肝细胞l02、人肺癌细胞(a549、a549-t和h460)用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基培养，人肝癌细胞(hepg2和sk-hep-1)用含10％胎牛血清的dmem高糖培养基培养。取对数生长期细胞，胰酶消化，接种于96孔板内，每孔加100μl细胞液(5×104个/ml)，隔夜贴壁。药物母液用培养基稀释至所需浓度，每孔加100μl，每一浓度5个平行孔，同时设置空白对照组。24h、48h，72h及96h后，每孔加入20μl新鲜配制的mtt溶液(5mg/ml)，孵育3h，弃上清液，每孔加入150μldmso，震荡10min，用酶标仪测定在490nm处的吸光度(a)。根据公式计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率，再以药物浓度(μg/ml)为横坐标对抑制率(％)作量效曲线图，进行回归分析，计算药物的ic50值。
细胞生长抑制率(％)＝(1-(a实验组-a空白组)/(a对照组-a空白组)×100％
结果由图9-图16和表2-表5可见，7种细胞株(人肝癌细胞smmc-7721、sk-hep-1、hepg2、正常肝细胞l02，以及人肺癌细胞a549、a549-t、h460)分别给予不同浓度的cu、samc、samc-sln作用96h。姜黄素衍生物samc对癌细胞均有抑制作用，抗肿瘤活性与姜黄素cu接近，而对正常肝细胞的毒性更小，说明samc对人肝癌细胞有一定的选择抑制作用。而姜黄素衍生物的固体脂质纳米粒samc-sln在三种药物中显示了最强的抗癌作用，尤其是对人肝癌细胞smmc-7721和肺癌细胞a549，极大地提高了cu和samc对癌细胞的杀伤作用且对正常肝细胞的毒性小。说明samc-sln有较强的抗肿瘤活性且对人肝癌细胞的选择性抑制作用在samc的基础上进一步增强。
表2药物对细胞作用24h的ic50值(
*与cu抑制率比较，p<0.05有显著性差异，-没有抑制效果或没有测出
表3药物对细胞作用48h的ic50值(
*与cu抑制率比较，p<0.05有显著性差异
表4三种药物对细胞作用72h的ic50值(
*与cu抑制率比较，p<0.05有显著性差异
表5三种药物对细胞作用96h的ic50值(
*与cu抑制率比较，p<0.05有显著性差异
实施例10：药物在癌细胞内形态观测
根据mtt结果，选择人肝癌smmc-7721细胞和人肺癌a549细胞各一株，显微镜下观察给药48h后癌细胞的形态。结果由图17和图18可见，未给药的空白对照组肝癌smmc-7721细胞和肺癌a549细胞体积饱满，呈不规则形，生长良好；给予100μg/ml的cu、samc和samc-sln作用48h后，两癌细胞形态显著变化，细胞开始变圆、皱缩、脱落、死亡，活细胞数量明显减少。镜下观察，cu和samc细胞数量差别不大，而samc-sln细胞数量比cu少，抑制效果更好。
实施例11：药物在癌细胞内分布状态测定
根据mtt结果，采用激光扫描共聚焦显微镜观测药物在人肝癌smmc-7721细胞和人肺癌a549细胞内分布状态。将24孔专业玻璃爬片(厚度为0.17mm)放置于24孔板内，向每孔滴加浓度为6×104个/ml的肿瘤细胞液400μl于爬片上，于37℃，5％co2培养箱中培养。贴壁后，向每孔加入400μl配制好的cu、samc和samc-sln药液，给药浓度为40μg/ml，并设置未给药空白对照组，给药后，将细胞板继续放在37℃，5％co2培养箱中，药物作用时间为24h。给药24h后，除去每孔含药培养基，用pbs溶液清洗2次；每孔加入4％的多聚甲醛400μl固定15min；吸出固定液，用pbs溶液清洗2次；每孔加入100μl的dapi液，避光染色5min；弃去染色液，用pbs溶液清洗4次；载玻片上滴加一滴抗荧光衰减封片剂，取出爬片，将其盖在载玻片上，封片，激光扫描共聚焦显微镜(388/488nm紫外光激发)下观测药物在肝癌smmc-7721细胞和肺癌a549细胞内分布状态。
结果由图19和图20可见，肝癌smmc-7721细胞和肺癌a549细胞的细胞核被pi染料染成蓝色，分别给予cu、samc和samc-sln作用24h出现了药物的绿色荧光，说明药物主要进入到癌细胞的细胞核内发挥抗癌作用，同时，药物在胞浆内也有少量分布，推测原因可能是胞核破裂，释放出胞核内物质与药物结合；也可能药物能与细胞质中的某些物质结合，发挥抑制增殖作用。
实施例12：细胞凋亡检测
annexinv-fitc分装小份冻存-20℃，避免反复冻融，避光；pi和bindingbuffer放4℃保存，避光；细胞融合长满至90％左右，将人肝癌smmc-7721细胞和人肺癌a549细胞分别接种于6孔板内培养。贴壁后，用高、中、低(20、15、10μg/ml)浓度的cu、samc和samc-slns药液分别干预对数生长期的细胞，同时设置不给药的对照组。作用48h后，弃上清液，用胰酶消化，pbs洗涤2次，收集6×105个细胞；加入500μlbindingbuffer，吹匀细胞，转移到5ml培养管中；加入5μlannexinv/fitc混匀后，加5μlpi，轻轻摇晃试管，室温避光染色5min；1h内用流式细胞仪检测，激发波长为488nm，发射波长为530nm，fitc通道(fl1)检测绿色荧光，pi通道(fl2)检测红色荧光。
结果由图21和表6可见，高、中、低浓度(20μg/ml、15μg/ml、10μg/ml)浓度的cu、samc和samc-sln作用48h，凋亡率分别为10.96％、9.54％、8.45％；12.17％、10.71％、9.70％和22.02％、16.46％、10.06％。说明三种药物均能促进人肝癌smmc-7721细胞凋亡，且凋亡作用具有浓度依赖性，浓度越高，凋亡作用越强。而相同浓度药物的凋亡作用大小为：cu<samc<samc-sln。与cu相比，samc-sln主要诱导人肝癌smmc-7721细胞早期凋亡。
结果由图22和表7可见，高、中、低浓度(20μg/ml、15μg/ml、10μg/ml)的cu、samc和samc-sln作用48h，凋亡率分别为15.12％、10.82％、8.41％；17.14％、11.31％、8.41％和22.75％、19.92％、9.73％。说明三种药物均能促进人肺癌a549细胞凋亡，且凋亡作用具有浓度依赖性，浓度越高，凋亡作用越强。而相同浓度药物的凋亡作用大小为：cu<samc<samc-sln。与cu相比，samc-sln主要诱导人肺癌a549细胞晚期凋亡。
表6药物作用48h对人肝癌smmc-7721细胞的凋亡作用
表7药物作用48h对人肺癌a549细胞的凋亡作用
综上所述，本发明公开了一种姜黄素衍生物samc及其制备方法，该方法后处理方法简单，三废少。同时，将该姜黄素衍生物samc制备成固体脂质纳米粒，粒径小(104.1±2.43nm)、分布较窄且呈正态分布、包封率较高(95.1±0.38％)、48h体外释放50％。此外，姜黄素衍生物samc及其固体脂质纳米粒samc-sln主要进入人肝癌细胞和肺癌细胞的细胞核，对癌细胞有良好的抑制作用，诱导癌细胞凋亡。由此，本发明的姜黄素衍生物samc具有抗癌用途，在癌症治疗方面具有较大的潜在价值。