本发明涉及茶皂苷，特别涉及一种茶皂苷锗配合物、茶皂苷锗纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
免疫低下或免疫缺陷可导致病毒感染、肿瘤及多种免疫性疾病。采用免疫调节剂可增强或恢复正常人体的免疫力。常用的免疫调节药物有化学药物、生物制剂和中药成分，但是化学药物和生物制剂多为被动免疫，副作用多；中药成分副作用小，但起效慢，效价低，一般需要长期使用，价格较高。
茶皂苷是茶籽提油后的废弃物茶粕中提取的中一种五环三萜化合物，其价格低廉。茶皂苷具有增强免疫的功效。但茶皂苷的分子量较大，不易吸收，且体内易降解，稳定性较差。
锗是人体中重要的保健微量元素，吸收后在体内停留数小时后排出，无蓄积毒性。锗具有脱氢富集氧，清除体内氧自由基，清除血液垃圾，还具有增强免疫、抗肿瘤、调节内分泌等多种功效。但相比于无机锗，有机锗具有更高的生物利用度和生物活性、更低的生物毒性等特点，但是天然的有机锗化合物非常少。
技术实现要素：
为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的之一在于提供一种茶皂苷锗配合物，能够有效地降低无机锗的生物毒性，发挥茶皂苷和锗的协同作用，增强免疫功能。
本发明的目的之二在于提供一种茶皂苷锗纳米颗粒的制备方法，水溶性好，易吸收，生物利用度高。
本发明的目的之三在于提供一种上述制备方法制备得到的茶皂苷锗纳米颗粒。
本发明的目的之四在于提供上述茶皂苷锗纳米颗粒的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种茶皂苷锗配合物，具有如下结构：
式中，n＝100～600。
一种包含所述的茶皂苷锗配合物的茶皂苷锗纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)茶皂苷加入其质量15～30倍水溶解，再加入淀粉酶，35～55℃保温4～12h；静置分层，收集沉淀物；
(2)沉淀物用乙醇水溶液溶解，加入沉淀物质量2～5％的二氧化锗碱溶液和5～20％的聚乙烯醇，55～65℃反应8～10h；
(3)用盐酸调节ph值至5～6，减压浓缩蒸出乙醇，过0.22～0.45μm的滤膜，真空干燥，得到茶皂苷锗纳米颗粒。
步骤(1)所述的淀粉酶的加入量为每100克茶皂苷加入500～5000u的淀粉酶。
步骤(2)所述乙醇水溶液的体积分数为70～85％，加入量为与沉淀物的液固比为(10～20)ml/g。
步骤(2)所述二氧化锗碱溶液中的二氧化锗的质量分数为5～10％。
步骤(2)所述二氧化锗碱溶液包含二氧化锗和氢氧化钠或氢氧化钾，其中二氧化锗和氢氧化钠或氢氧化钾的摩尔比为1:(1～2)。
步骤(2)所述聚乙烯醇的分子量为17000～100000da。
步骤(3)所述减压浓缩条件为0.01～0.1mpa，温度50～70℃，时间1～3h；所述真空干燥的温度为40～60℃，干燥时间为8～10h。
所述的茶皂苷锗纳米颗粒的制备方法制备得到的茶皂苷锗纳米颗粒。
所述的茶皂苷锗纳米颗粒的应用，用于制备增强免疫功能的免疫调节药物。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明通过生物酶法水解茶皂苷，得到去除了糖基的小分子量皂苷，使其生物活性进一步增强。
(2)本发明的茶皂苷有机锗，能够有效地降低无机锗的生物毒性，发挥茶皂苷和锗的协同作用，增强免疫功能。
(3)本发明的茶皂苷有机锗纳米颗粒水溶性好，易吸收，生物利用度高。
(4)本发明的制备工艺简单，反应条件温和，便于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)取1kg茶皂苷加入30kg水溶解，再加入50000u淀粉酶，35℃保温8h；静置分层，收集沉淀；
(2)取沉淀物100g用2l体积分数为70％的乙醇水溶液溶解，加入2g质量分数为10％的二氧化锗碱溶液(二氧化锗和氢氧化钠的摩尔比为1:1)和5g的聚乙烯醇(分子量为17000da，n≈100)，55℃反应10h；
(3)用盐酸调节ph值至5，0.01mpa50℃减压浓缩1h蒸出乙醇，过0.22μm的滤膜，60℃真空干燥8h，得到茶皂苷锗纳米颗粒104g。
实施例2
(1)取1kg茶皂苷加入15kg水溶解，再加入5000u淀粉酶，55℃保温4h；静置分层，收集沉淀；
(2)取沉淀物100g用1l体积分数为85％的乙醇水溶液溶解，加入5g质量分数为5％的二氧化锗碱溶液(二氧化锗和氢氧化钾的摩尔比为1:2)和10g的聚乙烯醇(分子量为51000da，n≈300)，65℃反应8h；
(3)用盐酸调节ph值至6，0.1mpa70℃减压浓缩3h蒸出乙醇，过0.45μm的滤膜，50℃真空干燥10h，得到茶皂苷锗纳米颗粒109g。
实施例3
(1)取1kg茶皂苷加入20kg水溶解，再加入20000u淀粉酶，45℃保温12h；静置分层，收集沉淀；
(2)取沉淀物100g用1.5l体积分数为80％的乙醇水溶液溶解，加入3g质量分数为8％的二氧化锗碱溶液(二氧化锗和氢氧化钠的摩尔比为1:1)和20g的聚乙烯醇(分子量为34000da，n≈200)，55℃反应10h；
(3)用盐酸调节ph值至6，0.02mpa60℃减压浓缩2h蒸出乙醇，过0.3μm的滤膜，50℃真空干燥9h，得到茶皂苷锗纳米颗粒117g。
实施例4
(1)取1kg茶皂苷加入17kg水溶解，再加入10000u淀粉酶，40℃保温10h；静置分层，收集沉淀；
(2)取沉淀物100g用1l体积分数为76％的乙醇水溶液溶解，加入4g质量分数为12％的二氧化锗碱溶液(二氧化锗和氢氧化钾的摩尔比为1:2)和8g的聚乙烯醇(分子量为100000da，n≈600)，65℃反应9h；
(3)用盐酸调节ph值至5.5，0.04mpa65℃减压浓缩2h蒸出乙醇，过0.4μm的滤膜，55℃真空干燥10h，得到茶皂苷锗纳米颗粒107g。
实施例5
(1)取1kg茶皂苷加入22kg水溶解，再加入40000u淀粉酶，48℃保温6h；静置分层，收集沉淀；
(2)取沉淀物100g用1.4l体积分数为78％的乙醇水溶液溶解，加入2.5g质量分数为6.5％的二氧化锗碱溶液(二氧化锗和氢氧化钠的摩尔比为1:1.5)和15g的聚乙烯醇(分子量为58000da，n≈400)，58℃反应9.5h；
(3)用盐酸调节ph值至5.7，0.02mpa60℃减压浓缩2.5h蒸出乙醇，过0.22μm的滤膜，60℃真空干燥8h，得到茶皂苷锗纳米颗粒114g。
实施例6
(1)取1kg茶皂苷加入27kg水溶解，再加入30000u淀粉酶，39℃保温11h；静置分层，收集沉淀；
(2)取沉淀物100g用1.3l体积分数为82％的乙醇水溶液溶解，加入4.5g质量分数为9％的二氧化锗碱溶液(二氧化锗和氢氧化钾的摩尔比为1:1.2)和12g的聚乙烯醇(分子量为85000da，n≈500)，58℃反应10h；
(3)用盐酸调节ph值至5.8，0.01mpa55℃减压浓缩3h蒸出乙醇，过0.45μm的滤膜，50℃真空干燥10h，得到茶皂苷锗纳米颗粒111g。
实施例7
取实施例1～6的茶皂苷锗纳米颗粒10g，与淀粉、乳糖、结晶纤维素按7:2:1混合物30g、1％硬脂酸镁混合均匀，经压片机制成片剂。
实施例8
取实施例1～6制得的茶皂苷锗纳米颗粒10g，加入药用淀粉30g，混合均匀，湿法制粒，用乙醇调节，制得颗粒松散过20目筛，晾干。干燥后填充胶囊，即得油茶皂苷元衍生物的胶囊剂。
测试1：
实施例1～6制得的茶皂苷锗纳米颗粒的粒径及结构表征
方法：实施例1～6制得的茶皂苷锗纳米颗粒经水分散后，用马尔文纳米粒度仪测定其粒径；用dmso为溶剂配成1mg/ml的样液，采用紫外分光光度仪扫描；制备kbr薄片，进行红外光谱扫描；对各组成元素进行分析。
结果：实施例1～6制得的茶皂苷锗纳米颗粒平均粒径分别为174nm、203nm、264nm、186nm、235nm、214nm。紫外扫描显示，茶皂苷的特征峰发生红移；红外光谱显示，配位物的醛基峰(1721cm-1)消失，并在793cm-1新增一个宽峰，该峰为锗与氧成键的伸缩振动峰，说明ge4+与油茶皂苷的醛基发生了配位反应。元素分析结果表明，茶皂苷和锗原子及聚乙烯醇的配比为2:1:1，具有以下结构：
式中，n＝100～600。
测试2：
取实施例1～6的茶皂苷锗纳米颗粒10g，用多乙氧基醚1000ml溶解后，灌入小瓶，制成注射针剂。
本发明的茶皂苷锗纳米颗粒具有显著免疫调节作用，通过以下实验得以证实：
茶皂苷锗纳米颗粒的对免疫低下小鼠的免疫调节作用实验：
方法：取100只小鼠，体重(20±2)g，随机分为正常对照组、模型组、实施例1茶皂苷锗纳米颗粒高低剂量组、实施例2～6茶皂苷锗纳米颗粒组、茶皂苷组，每组10只。模型组和药物组小鼠腹腔注射环磷酰胺(80mg/kg)后，各实验组灌胃相应药物，每天1次连续7天，第8天脱颈椎致死后，分离胸腺和脾脏，称重，计算胸腺指数和脾指数。胸腺或脾指数＝(胸腺或脾重量)/体重。
另无菌取脾，分离单个脾细胞，用rpmi1640培养液调整细胞浓度为1×107个/ml。37℃5％co2培养箱内培养72h，按mtt法用酶标仪，以570nm波长测定光密度(od值)。用加cona(刀豆蛋白a，10μg/ml)孔的od值减去不加cona孔的od值表示淋巴细胞的增殖能力。比较给药组和对照组的差异情况。
结果：与正常对照相比，模型组的胸腺指数和脾指数及淋巴增殖能力明显下降，但给药组显著增强，效果优于茶皂苷原药组。说明本发明的茶皂苷锗纳米颗粒有更好的免疫增强作用。结果见表1。
表1茶皂苷锗纳米颗粒对免疫低下小鼠免疫调节能力
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。