本发明属于干细胞领域，具体涉及一种间充质干细胞的收集方法，尤其是涉及一种间充质干细胞脱离微载体的收集方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymalstemcells)是存在于各种组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的干细胞。间充质干细胞为贴壁细胞，在二维平皿或培养瓶底部贴壁生长，在三维培养总，依附于载体表面或载体内部生长。
微载体(microcarrier)是直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖、胶原或者聚苯乙烯等各种合成的聚合物组成。国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、phema微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体有三种：cytodex1、2、3，cytopore和cytoline。
微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术,其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞。培养后需要将细胞从微载体上脱离下来
目前细胞从微载体上脱离通常采取胰蛋白酶、胰酶替代物来消化细胞，经过30-60min的处理，促使微载体从细胞脱落。然而用胰蛋白处理间充质干细胞-微载体的时间过长，长时间用胰蛋白处理细胞，会导致细胞活力降低，造成细胞损伤。有文献报道，细胞长时间暴露的胰蛋白酶中，会降低间充质干细胞表面标记物cd105的表达量。同时目前采用的胰蛋白酶、胰酶替代物来消化细胞，处理微载体上间充质干细胞的收集方法，还存在处理后间充质干细胞收集率不高的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种间充质干细胞的收集方法，用于将间充质干细胞脱离微载体。本发明所述收集方法处理时间短，间充质干细胞收集率高，且收集的间充质干细胞损伤小，细胞活力高。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种间充质干细胞的收集方法为去除间充质干细胞微载体培养体系中的上层培养基，加入edta-胰蛋白酶在37℃条件下以100rpm-200rpm摇培5-10min，然后以200rpm-250rpm摇培5s-10s，细胞筛网过滤，收集细胞滤液，离心后收集沉淀。
本发明所述收集方法可用于脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等间充质干细胞脱离微载体的收集。
本发明所述微载体包括但不限于cytodex1、cytodex2、cytodex3、cytopore和cytoline。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞微载体培养体系为骨髓间充质干细胞微载体培养体系。
其中，在一些实施例中，所述骨髓间充质干细胞微载体培养体系的制备方法为骨髓间充质干细胞接种于含微载体的培养基中，保持30rpm-45rpm的搅拌速率，于5％co2，37℃、95％湿度的细胞培养箱内培养5-6天。
本领域技术人员可以理解，本发明所述收集方法不受间充质干细胞的代数的限定。在一些实施方案中，本发明所述的收集方法中所述骨髓间充质干细胞为p3-p5代骨髓间充质干细胞。
本发明所述收集方法在加入edta-胰蛋白酶前还包括用含edta的pbs清洗的步骤。
作为优选，本发明所述的收集方法中，所述edta-胰蛋白酶与所述间充质干细胞微载体体积比为(1-2)：1。
本发明所述收集方法在过滤前还加入培养基中止消化。培养基的加入量为20ml-100ml。
本发明所述收集方法在终止消化后采用细胞筛网过滤将间充质干细胞和微载体分离。优选的，所述细胞滤网为70μm滤网。
进一步，在过滤后细胞滤液离心收集沉淀的间充质干细胞。优选的，所述离心为200g离心5-10min。
作为优选，本发明所述的收集方法中，所述培养基为含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺、1％neaa的dmem/f12培养基。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种间充质干细胞脱离微载体的收集方法，为去除间充质干细胞微载体培养体系中的上层培养基，加入edta-胰蛋白酶在37℃条件下以100rpm-200rpm摇培5-10min，然后以200rpm-250rpm摇培5s-10s，细胞筛网过滤，收集细胞滤液，离心后收集沉淀。本发明所述收集方法通过降低胰蛋白酶和胰酶替代物处理时间，缩短间充质干细胞脱离微载体的时间。本发明所述收集方法处理时间短，间充质干细胞收集率高，且收集的间充质干细胞损伤小，细胞活力高，广泛适用于微载体培养的间充质干细胞的收集。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示收集的间充质干细胞细胞数量统计图，其中实验组对应实施例1组，对照组对应对比例组；
图2示收集的间充质干细胞细胞活力统计图，其中实验组对应实施例1组，对照组对应对比例组；
图3示实施例1收集的间充质干细胞表面标志物检测结果图；
图4示对比例1收集的间充质干细胞表面标志物检测结果图；
图5示实施例1收集后的间充质干细胞成骨诱导后茜素红染色结果图，其中图a为未经成骨诱导的结果图，图b为经成骨诱导的结果图；
图6示实施例1收集后的间充质干细胞成脂诱导后油红o染色结果图，其中图a为未经成脂诱导的结果图，图b为经成脂诱导的结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，实施例中所使用的培养基均为含有10％胎牛血清、1％谷氨酰胺、1％neaa的dmem/f12培养基。
实施例1：
将骨髓来源的间充质干细胞p3代细胞接种于含100ml培养基的125ml微载体培养瓶中，保持30rpm的搅拌速率，于5％co2，37℃、95％湿度的细胞培养箱内培养5天。
将微载体培养瓶取出，静置5min，吸去上层培养基，用50ml含edta的pbs清洗2次后，加入微载体体积2倍的edta-胰蛋白酶后，取出微载体瓶内搅拌锤，将微载体培养瓶放置在37℃恒温摇床上，以150rpm摇培8min，然后200rpm摇培10s，随后加入50ml培养基中止消化。
将细胞、微载体混合液用70μm的细胞筛网过滤，收集细胞滤液，以200g离心5min，收集沉淀，用培养基重悬细胞。
将重悬后的细胞用台盼蓝按照1:1染色后，放入自动细胞计数仪中，计数细胞收集的数量及细胞活力。结果见图1。
对比例1：
将骨髓来源的间充质干细胞p3代细胞接种于含100ml培养基的125ml微载体培养瓶中，保持30rpm的搅拌速率，于5％co2，37℃、95％湿度的细胞培养箱内培养5天，
将微载体培养瓶取出，静置5min，吸去上层培养基，用50ml含edta的pbs清洗2次后，加入微载体体积2倍的edta-胰蛋白酶后，取出微载体瓶内搅拌锤，将微载体培养瓶放置在37℃，孵育30min。随后加入50ml培养基中止消化。
将细胞、微载体混合液用70μm的细胞筛网过滤，收集细胞滤液，以200g离心5min，收集沉淀，用培养基重悬细胞。
实施例2收集的细胞数量及细胞活力测定
将实施例1和对比例1重悬后的细胞分别用台盼蓝按照1:1染色后，放入自动细胞计数仪中，计数细胞收集的数量及细胞活力，结果见图1和图2。
结果显示，实施例1收集的间充质干细胞细胞数量和活力均高于对比例1。
实施例3流式细胞仪检测收集后的间充质干细胞表面标志物检测
将实施例1与对比例1中收集的间充质干细胞进行流式检测。每管加入1×106细胞数，染色缓冲液洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入cd73、cd90、cd105、cd34、cd45及hla-dr抗体各2μl，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500μl的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。实施例1组的试验结果见图3，对比例1组的试验结果见图4。
由图3、图4可知，采用本发明所述的间充质干细胞收集方法，阴性表面标志cd34、cd45、hla-dr为均呈现阴性，间充质干细胞表面阳性标记物cd73、cd90、cd105均呈阳性，且cd105、cd90表达量高于对比例1组。表明本发明所述间充质干细胞收集方法可以保持良好的生物学特征。
实施例4收集后的间充质干细胞诱导成骨分化鉴定
将实施例1收集后的间充质干细胞按照5×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2-3天换液，28天后进行茜素红染色，结果见图5。
由图5可见，收集后的间充质干细胞，经过成骨诱导4周后，由茜素红染色可见钙化结节，表明经过本发明所述收集方法收集的间充质干细胞仍然保持向成骨分化的潜能。
实施例5收集后的间充质干细胞诱导成脂分化鉴定
将实施例1收集后的间充质干细胞按照5×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基dmem、10％胎牛血清、0.5mmibmx、1μm地塞米松、100μm吲哚美辛、5μg/ml胰岛素、2mm/l谷氨酰胺，每三天换液，四周后进行油红o染色，鉴定脂滴形成情况，结果见图6。
由图6可见，收集后的间充质干细胞，经过成脂诱导4周后，由油红o染色可见红色油滴，表明经过本发明所述收集方法收集的间充质干细胞仍然保持向脂肪分化的潜能。