本发明属于微生物领域，具体涉及一种改善骨质疏松的植物乳杆菌。
背景技术：
骨质疏松症是一种以骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质比例不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折危险升高为症状的骨代谢障碍性疾病。全世界约有2亿以上人群患有骨质疏松症，我国骨质疏松患者居于世界首位，现有约9000万，占总人数的7.1％。在美国，50岁以上妇女有三分之一确诊为骨质疏松症患者，平均每年有1.5亿人患上骨质疏松症。
骨质疏松性骨折是该病症的严重后果，由于骨强度减低，日常生活中不慎跌倒或发生碰撞后极易出现髋部骨折，包括股骨颈及粗隆间骨折，腰椎压缩性骨折。在骨折治疗期间，由于卧床、活动受限等，极易出现坠积性肺炎、压疮、深静脉血栓、泌尿系感染及便秘等一系列并发症。据统计，50％女性与20％男性在他们的一生中，至少并发一次骨质疏松性骨折。该病症的发病是由20-30岁时所达到的骨量峰值以及随年龄增长而发生的骨丢失两方面因素决定的。人体骨量峰值50％-85％是由遗传决定，而环境因素在随年龄增长而发生的骨量减少中起到更加重要的作用。骨质疏松症已成为威胁中老年人及绝经期妇女正常生活的主要疾病之一。因此，开发一种能够有效改善骨质疏松的植物乳杆菌，具有非常重要的意义。
技术实现要素：
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种改善骨质疏松的植物乳杆菌。
本发明提供了一种改善骨质疏松的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ar495菌株，具有这样的特征：植物乳杆菌ar495菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14004。
本发明还提供了植物乳杆菌ar495菌株在发酵制备用于改善骨质疏松的乳酸菌产品中的应用。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的改善骨质疏松的植物乳杆菌，能够有效改善因去卵巢而引起的小鼠骨质疏松，经统计学分析可显著增加其骨小梁密度、骨小梁数目和骨小梁厚度，从而显著增加弹性模量以降低骨折风险。
附图说明
图1是本发明的实施例中的sham组的股骨骨小梁μct图像；
图2是本发明的实施例中的ovx组的股骨骨小梁μct图像；
图3是本发明的实施例中的ar495组的股骨骨小梁μct图像；
图4是本发明的实施例中的e2组的股骨骨小梁μct图像。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。
下述实施例中，所采用的试剂如无特殊说明均从一般商业途径获得，未注明的实验条件均参照常规实验条件或遵照供应商建议的条件。
实施例一：植物乳杆菌ar495的分离、培养及保藏
1、1、菌种分离与培养
步骤1，采集黄酒酒槽，以浓度梯度稀释法进行稀释，得到稀释液。
步骤2，取100ul的稀释液涂布于mrs培养基平板上进行40-56h的37℃的厌氧培养后，根据菌落的形状、大小、颜色等，将不同性状的分别挑至新的mrs培养基平板，进行划线分离纯化，得到分离菌株。
其中，每升mrs培养基的制作方法为：取牛肉浸出粉10g、酪蛋白胨10g、酵母浸粉5g、葡萄糖20g、三水乙酸钠8.3g、磷酸氢二钾2g、七水合硫酸镁0.58g、一水合硫酸锰0.25g，吐温-801ml，使用去离子水定容至1l，然后在115℃的条件下进行20min的灭菌。
步骤3，将分离菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶触试验，然后根据乳酸菌革兰氏染色阳性和无过氧化氢酶的特点来选取革兰氏染色阳性和过氧化氢酶触阴性的菌株。
步骤4，提取菌株的dna，使用乳酸菌16srdna片段通用引物27f/1492r，经pcr扩增后进行测序，然后与ncbi基因库中基因序列进行同源比较，得到植物乳杆菌ar237菌株。
其中，27f为5'-agagtttgatcctggctcag-3'，1492r为5'-ggttaccttgttacgactt-3'。
2、菌种保藏与活化
将植物乳杆菌ar495菌株配置成植物乳杆菌ar495菌液，在菌液中加入终浓度20％的甘油，混匀后置于-80℃冰箱，可保存2-3年，在活化时将甘油冻存管取出，冰浴条件下融化，用无菌接种环将菌液接种到事先准备好的mrs培养皿中，置于厌氧培养箱中生长40h左右直至培养皿中长出完整菌落，即可进行传代。
另外，植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ar495菌株已经于2017年04月07日在中国普通微生物菌种保藏管理中心进行保藏，其保藏编号为cgmccno.14004。
实施例二：植物乳杆菌ar495改善骨质疏松功效评价
1、建立动物模型
spf级雌性c57bl/6小鼠适应环境1周后，取体重18g±1g小鼠32只，禁食12小时(不禁水)，随机分组，每组8只，对每组的小鼠的腹腔注射70mg/kg麻醉剂戊巴比妥钠，并对其中8只在相应部位只作手术切口，不摘除卵巢作为假手术组，其余24只进行双侧卵巢摘除术，小鼠术后可正常活动，自行饮水摄食，术后伤口愈合正常，没有红肿、渗出、化脓等现象。
1.1双侧卵巢摘除术的方法
在对小鼠进行麻醉且麻醉成功后进行背位固定，在距最末肋骨下约1cm的位置剪毛，切开约1.5-2cm的皮肤，将距切口处左右两侧2cm范围内的背肌和皮肤分离，视野中可见背肌下面白色的脂肪团，卵巢即包埋其中；用弯头眼科镊轻夹脂肪团拉到切口外，即可见到粉红色蜂窝状卵巢；用4号手术缝合线扎紧连接卵巢的输卵管，以防出血，再将卵巢完整摘除，同法摘除另一侧卵巢最后将子宫顺势送回原位，依次缝合背肌和皮肤。
2、动物分组及给药
将假手术组小鼠记为sham组，术后恢复正常的小鼠随机分为3组，分别记为ovx组，ar495组和e2组，sham组和ovx组给予0.9％生理盐水，ar495组给予植物乳杆菌ar495菌悬液，e2组给予0.02％17β-雌二醇溶液，然后灌胃给药，给药体积为100μl/10g体重，每天给药，连续8周，并在给药过程中，每天称量一次体重，根据体重调整灌胃量。
其中，植物乳杆菌ar495菌悬液的配制方法为：在温度为4℃，速度为6000rpm的条件下离心传至第三代的菌液，每代接种量为2％，生长时间为16h，弃上清，0.9％生理盐水重悬，重复上述步骤3次，直至离心后的上清液无色透明，根据ar495od600的吸光值与cfu/ml的关系，用紫外可见分光光度计调节菌浓度，使得菌悬液最终浓度为10^9cfu/ml。
3、样品采集
4组小鼠均在末次给药后禁食12小时(不禁水)，然后称量体重，收集尿液和粪便，存放于-80℃冰箱，接着腹腔注射70mg/kg麻醉剂戊巴比妥钠，小鼠心脏穿刺取血并处死小鼠，完整分离小鼠双侧股骨及胫骨，在10％福尔马林溶液中固定。
4、股骨骨小梁参数测定
图1是本发明的实施例中的sham组的股骨骨小梁μct图像，图2是本发明的实施例中的ovx组的股骨骨小梁μct图像，图3是本发明的实施例中的ar495组的股骨骨小梁μct图像；图4是本发明的实施例中的e2组的股骨骨小梁μct图像。
用micro-ct扫描左侧股骨，测定股骨骨密度、骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度和骨小梁分离度，结果如表1和图1-图4所示。
表1：股骨骨小梁参数
5、股骨材料力学强度测定
使用万能材料试验机对右侧股骨进行三点弯曲试验，测定股骨最大弯曲应力、最大弯曲载荷和弹性模量，结果如表2所示。
表2：股骨材料力学参数
实施例的作用与效果
本发明的上述实施例中，通过小鼠骨质疏松模型，测定植物乳杆菌ar495干预前后股骨骨小梁参数：骨密度、骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度和骨小梁分离度；股骨材料力学强度：最大弯曲应力、最大弯曲载荷和弹性模量。
通过ovx组与sham组相比，骨小梁参数以及弹性模量方面均具有显著性差异，ar495干预后较ovx组，显著改善了股骨骨密度、骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度以及弹性模量，并且骨小梁厚度恢复到假手术组的水平，弹性模量显著优于sham组，与此同时，阳性对照组在上述参数中同模型组相比，均显著提高，说明植物乳杆菌ar495可有效改善由雌激素缺乏引起的骨质疏松症状。
因此，本发明实施例所筛选出的植物乳杆菌ar495能够有效改善因去卵巢而引起的小鼠骨质疏松，经统计学分析可显著增加其骨小梁密度、骨小梁数目和骨小梁厚度，从而显著增加弹性模量以降低骨折风险，所以该植物乳杆菌ar495可以用来制备用于改善骨质疏松的乳酸菌产品，从而保证机体的健康。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。