一种多孔复合多糖水凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及一种复合多糖水凝胶及其制备方法，属生物质化学化工技术领域。

背景技术：

细菌纤维素(bacteria cellulose，简称BC纤维素)是一种由特定微生物合成的由超微纤维组成的天然超微纤维网，它具有独特的三维纳米纤维网状结构，高持水性和良好的机械强度及生物相容性。细菌纤维素是由β-吡喃葡萄糖残基以β-1,4糖苷键连接而成的链状高分子聚合物，分子内和分子间存在大量的氧键，并含有大量的羟基和醚键，拥有许多有效的反应活性位点。与自然植物纤维素相比，有更多优良的特性，如高纯度、高结晶度、比表面积大、良好的亲水性以及生物相容性，并易于在环境中降解。目前，在发达国家，细菌纤维素产业已初步形成年值上亿美元的市场，涉及食品、化工、医药、纺织、造纸等行业，而我国在这个产业领域的研究尚处于初级阶段。在世界人口不断增长、资源日益短缺的情况下，细菌纤维素作为一种对环境友好、可再生的生物材料，蕴藏着极大的商业价值和良好的发展前景。

木薯产业是我西部地区的重要支柱产业之一，仅广西木薯种植面积就达30万hm2，鲜木薯产量700多万t。木薯渣是木薯淀粉生产的固体废料，主要成分为碳水化合物，包括淀粉、纤维素、半纤维素、蛋白质及少量的木素。目前仅有少部分用作饲料、生产酒精和单细胞蛋白等，其处置问题已成为制约木薯产业发展的一个重要因素。可以利用生物技术策略将其转化为生物能源，继而对固体废弃物木薯渣进行减量化，解决木薯渣的处置问题，既达到减轻环境污染的目的，又可以生产高附值的生化产品。利用淀粉酶和纤维素酶等对木薯渣进行酶解是高效生物利用的有效途径之一，这样一方面可以做到无害化处理，降低环境污染，另一方面也可以有效利用残余淀粉和纤维素，增加生物质资源利用率。目前，生物细菌纤维素培养基碳源主要是葡萄糖、蔗糖等商业糖原料。将纤维原料水解后得到的单糖用作培养基中的碳源，以实现材料的绿色制备和清洁生产，将农林废弃物有效的应用在生物医药材料方面，使得生物材料的生产和制备具有更多选择性。木薯渣糖化后的糖化液也可以作为一种有效碳源，用以替换培养基中的葡萄糖或蔗糖。水凝胶生产过程最重要的两点是控制成本和提高产量，若采用木薯渣为碳源，处理好酶用量、底物浓度和产率的关系，不仅解决了工业上处理木薯渣的难题，还为细菌纤维素原料的缺乏提供了一种新的选择，可有效降低原料成本。此外，木薯渣的优势在于无需预处理，这不仅减少了设备投入，而且降低了能源损耗。虽然研究者们对复合细菌纤维素的制备生产做了大量的工作，但总的来说都还处于基础研究阶段，要实现规模化生产还存在产品纯度低或生产成本高、可操作性差等问题。因此有必要开展复合细菌纤维素生产新方法的研发，以获得低成本、高纯度、操作简便、绿色环保的生产手段。再通过测试其机械性能等理化性质以找到较好的复合工艺和原料配比，推动绿色生物工艺的规模化生产与应用示范，显著降低物耗能耗、工业固体废物排放等，建立生态安全、绿色低碳和循环发展的生物法工艺体系。

作为天然水凝胶材料，细菌纤维素水凝胶也存在明显的缺点，其湿态强度较差，并且在受力时持水力较差，影响了材料的使用性能。因此，利用原位复合的方法，在培养基里加入天然高分子材料，如海藻酸、透明质酸等，在其合成过程中形成细菌纤维素复合物，以期得到性能优异的水凝胶材料。透明质酸是另一种常存在于大多数哺乳动物组织的聚氨基葡萄糖，基本结构是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类，与其它粘多糖不同，它不含硫。它的透明质分子能携带500倍以上的水分，被广泛应用在保养品和化妆品中，还可促进伤口愈合。如果以细菌纤维素为基体，利用其超精细的三维纳米网络结构，选择透明质酸作为一种良好的大分子物质与细菌纤维素进行复合，结合其良好的生物可降解性和生物相容性，通过原位合成路线合成新的复合材料，在网络结构中引入易分散且稳定聚合物分子，生产的复合水凝胶材料赋予了细菌纤维素更加优异的持水性能，并具备较高的力学强度，有望作为新型组织工程支架，在创伤辅料等医学领域得到应用。这种复合过程可以改善水凝胶由于纤维网络的致密性而难以使细胞渗透的难题，进而作为实用性较高的医药材料。现有技术中有多种通过细菌纤维素和其他大分子物质复合制备水凝胶的方法，但是通常是先通过发酵得到细菌纤维素，然后后再与其他大分子物质复合来进行制备，如专利CN104130424和CN 103044694 A中公开的方法，这种方法制备得到的水凝胶的强度有限，不能满足高强度的需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种多孔复合多糖水凝胶的制备方法，其主要改进点为，采用以木薯渣糖化液作为碳源的液体培养基，对可产细菌纤维素的微生物进行培养，培养完成后在培养液表面形成的细菌纤维素膜即为所述多孔复合多糖水凝胶。

本发明研究发现，以木薯渣糖化液替代微生物培养基中的常用碳源如葡萄糖，与采用葡萄糖为碳源发酵产水凝胶相比，所得水凝胶的拉伸强度、溶胶倍数等指标均有明显的改善。

优选的，所述木薯糖化液中单糖的浓度为260～265g/L。研究发现，单糖浓度越高，产品的得率越高。

优选的，所述木薯糖化液由高温淀粉酶和糖化酶依次对木薯渣进行酶解后制备得到。高温淀粉酶可使原料快速液化，糖化酶可使液化物进一步降解为单糖。

优选的，所述木薯渣糖化液由如下方法制备得到：木薯渣按质量体积比20％加入到45～55℃水中，保温0.5～1h，按20U/g淀粉加入商业化耐高温淀粉酶，在85～90℃搅拌液化2～2.5h；再后用10％稀硫酸调节体系pH为3.8-4.5，按150U/g淀粉加入糖化酶60℃糖化1～1.5h，然后再真空浓缩使单糖的浓度为260～265g/L。

优选的，本申请所述的木薯渣中淀粉含量为45～50％、纤维素含量22～27％。

作为优选的方案，本申请的改进点还包括在培养基中直接添加透明质酸的操作，包括如下步骤：采用添加有透明质酸，以木薯渣糖化液作为碳源的液体培养基，对可产细菌纤维素的微生物进行培养，培养完成后在培养液表面形成的膜即为所述多孔复合多糖水凝胶。

通过添加透明质酸，透明质酸与细菌纤维素耦合交联，可进一步提高所得凝胶的强度和其他各项指标。

优选的，所述可产细菌纤维素的微生物为木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。

进一步优选的，所述可产细菌纤维素的微生物为木醋杆菌。

优选的，所述透明质酸在所述液体培养基中的添加量为7.5～15g/L。

作为优选的操作，透明质酸在添加前将其配成水溶液。

作为优选的操作方式，本发明的方法包括如下步骤：

1)用高温淀粉酶和糖化酶依次对木薯渣进行酶解，得木薯渣糖化液，并调节其中单糖的浓度为260～265g/L；

2)采用添加有浓度为7.5～15g/L的透明质酸，且以木薯渣糖化液作为碳源的液体培养基，对木醋杆菌在温度30℃的条件下静态培养10～12d，培养完成后在培养液表面形成的膜即为所述多孔复合多糖水凝胶。

优选的，所述液体培养基的组成为透明质酸7.5～15g/L、木薯渣糖化液18～22g/L，蛋白胨4.5～5.5g/L，4.5～5.5g/L酵母提取物，2.5～3g/L磷酸氢二钠，1.1～1.2g/L一水柠檬酸；起始pH 5.5。

优选的，所述液体培养基的组成为透明质酸10～15g/L、木薯渣糖化液18～22g/L，蛋白胨4.5～5.5g/L，4.5～5.5g/L酵母提取物，2.5～3g/L磷酸氢二钠，1.1～1.2g/L一水柠檬酸；起始pH 5.5。

进一步优选的，将制备得到的多孔复合多糖水凝胶与培养液进行分离后造粒，然后在90～110℃流化床干燥，最后得到多孔复合多糖水凝胶产品。

本发明的另一个目的是保护本发明的方法制备得到的多孔复合多糖水凝胶。

本发明的最后一个目的是保护本发明所述的多孔复合多糖水凝胶在制备生物医学材料中的应用，优选在制备创伤辅料中的应用。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过酶解将木薯渣中的淀粉进行降解，可直接替代培养基中的碳源，既可提高所得凝胶的性能，而且可将木薯渣转化为高附值的化学品或材料，实现固体废弃物木薯渣的减量化处理，而且木薯渣资源量大、价格低廉，通过酶解法对其进行转化可降低生物转化成本。

(2)本发明在培养的过程中，直接利用木薯渣糖化液碳源发酵培养木醋杆菌，无需进行任何前处理，是一种绿色、低能耗高产量的培养方式。

(3)利用糖化液替换葡萄糖纯品制备细菌纤维素水凝胶为木质纤维原料“糖平台”提供了新的发展思路，将农林废弃物有效地应用在在生物医药材料方面，使得生物材料的生产和制备具有更多选择性。

(4)本发明采用生物“原位合成”的方式形成透明质酸与细菌纤维素的复合水凝胶，培养基中的透明质酸随着木醋杆菌的生长与其形成的细菌纤维素结合在一起，从而得到结构稳定的复合多糖水凝胶，与现有的技术中分步制备相比，制备得到的水凝胶具有很好的生物安全性及生物相容性。

(5)透明质酸的添加还赋予了细菌纤维素水凝胶较高的湿强度，并具备一定韧性，改善了水凝胶在受力时较差的持水力，提高了材料的使用性能。

(6)本发明所制备的复合多糖水凝胶，成孔丰富且均匀，良好的网络结构可以很好解决水凝胶由于纤维网络的致密性而难以使细胞渗透的难题，进而作为新型组织工程支架，作为一种实用性较高的医药材料。

(7)本发明采用造粒和流化床干燥水凝胶，大幅度提高了干燥速率，克服了水凝胶产品干燥时间长和能耗高等缺点。

附图说明

图1为实施例4制得的多孔复合多糖水凝胶的扫描电镜图；

图2为对比例制得的多孔复合多糖水凝胶的扫描电镜图；

图3为实施例2～4操作的流程图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中涉及的木薯糖化液由如下方法制备得到：

将木薯渣按20％(w/v)加入到50℃水中，保温0.5h，按20U/g淀粉加入商业化耐高温淀粉酶，在85～90℃搅拌液化2h；再后用10％稀硫酸调节体系pH为3.8-4.5，按150U/g淀粉加入糖化酶60℃糖化1h。对得到的糖化液进行真空浓缩，至浓缩液中的单糖浓度为263.67g/L。

实施例1

本实施例涉及通过单独发酵培养木醋杆菌来制备多糖水凝胶的方法，包括如下步骤：

用单糖浓度为263.67g/L的木薯渣糖化液替换培养基中的葡萄糖，木醋杆菌液体培养基的组成为：20g/L木薯渣糖化液，5g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，2.7g/L磷酸氢二钠，1.15g/L一水柠檬酸，调整起始pH 5.5。接种体积分数为10％的活化好的木醋杆菌种子液，在温度为30℃的条件下，静置培养10天后，在培养液的表面形成的膜即为细菌纤维素多糖水凝胶。

将制备得到的多糖水凝胶与培养液进行分离后造粒，然后在90～110℃流化床干燥，最后得到多糖水凝胶产品。

水凝胶的固体得率(水凝胶的固体得率的计算方法为，水凝胶干基质量/原料木薯渣干基质量)22.48％，结晶度为28.1°，溶胀平衡后的溶胀倍数为678.4，拉伸强度为0.28N，扫描电镜下观察到多束密实而交错的丝状物。

实施例2

本实施例涉及通过细菌纤维素与透明质酸耦合来制备多糖水凝胶的方法，用木薯渣糖化液替换培养基中的葡萄糖，并在培养基中添加透明质酸，包括如下步骤：

配制透明质酸50g/L的水溶液，加入培养基之前在60℃下加热1h；

用单糖浓度为263.67g/L的木薯渣糖化液替换培养基中的葡萄糖，木醋杆菌液体培养基的组成为：20g/L木薯渣糖化液，5g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，2.7g/L磷酸氢二钠，1.15g/L一水柠檬酸，透明质酸7.5g/L，调整起始pH 5.5。接种体积分数为10％的活化好的木薯杆菌种子液，在温度为30℃的条件下，静置培养10天后，在培养液的表面形成的膜即为多糖水凝胶。

将制备得到的多孔复合多糖水凝胶与培养液进行分离后造粒，然后在90～110℃流化床干燥，最后得到复合多糖水凝胶产品。

多糖水凝胶固体得率(多糖水凝胶的固体得率的计算方法为，多糖水凝胶干基质量/原料木薯渣干基质量)23.57％，结晶度为27.4°，溶胀平衡后的溶胀倍数为742.6，拉伸强度为0.62N，扫描电镜下观察到较细的丝状物开始形成网状。本实施例的操作流程图见图3。

实施例3

本实施例涉及通过细菌纤维素与透明质酸耦合来制备多糖水凝胶的方法，用木薯渣糖化液替换培养基中的葡萄糖，并在培养基中添加透明质酸，包括如下步骤：

配制透明质酸50g/L的水溶液，加入培养基之前在60℃下加热1h；

用单糖浓度为263.67g/L的木薯渣糖化液替换培养基中的葡萄糖，木醋杆菌液体培养基的组成为：20g/L木薯渣糖化液，5g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，2.7g/L磷酸氢二钠，1.15g/L一水柠檬酸，透明质酸10g/L，调整起始pH 5.5。接种体积分数为10％的活化好的木薯杆菌种子液，在温度为30℃的条件下，静置培养10天后，在培养液的表面形成的膜即为多糖水凝胶。

将制备得到的多孔复合多糖水凝胶与培养液进行分离后造粒，然后在90～110℃流化床干燥，最后得到复合多糖水凝胶产品。

多糖水凝胶固体得率27.79％，结晶度为27.0°，溶胀平衡后的溶胀倍数为872.6，拉伸强度为0.75N，扫描电镜下观察到丝状物更加强壮，网状结构明显，具有一定孔隙率。本实施例的操作流程图见图3。

实施例4

本实施例涉及通过细菌纤维素与透明质酸耦合来制备多糖水凝胶的方法，用木薯渣糖化液替换培养基中的葡萄糖，并在培养基中添加透明质酸，包括如下步骤：

配制透明质酸为50g/L的水溶液，在配制培养基之前在60℃下加热1h；

用单糖浓度为263.67g/L的木薯渣糖化液替换培养基中的葡萄糖，木醋杆菌液体培养基的组成为：20g/L木薯渣糖化液，5g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，2.7g/L磷酸氢二钠，1.15g/L一水柠檬酸，透明质酸15g/L，调整起始pH 5.5。接种体积分数为10％的活化好的木薯杆菌种子液，在温度为30℃的条件下，静置培养10天后，在培养液的表面形成的膜即为多糖水凝胶。

将制备得到的多孔复合多糖水凝胶与培养液进行分离后造粒，然后在90～110℃流化床干燥，最后得到复合多糖水凝胶产品。

多糖水凝胶固体得率28.14％，结晶度为26.8°，溶胀平衡后的溶胀倍数为944.1，拉伸强度为0.93N。扫描电镜下观察到层层堆叠的网状结构，其形态均一、分布均匀，如图1所示。本实施例的操作流程图见图3。

对比例

本对比例在相同的条件下用葡萄为碳源发酵培养木醋杆菌。培养基成分：20g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，2.7g/L磷酸氢二钠，1.15g/L一水柠檬酸，起始pH 5.5，培养温度为30℃，培养10天后得多糖水凝胶。

将制备得到的多孔复合多糖水凝胶与培养液进行分离后造粒，然后在90～110℃流化床干燥，最后得到复合多糖水凝胶产品。

所述多糖水凝胶的固体得率21.24％，结晶度为28.3°，溶胀平衡后的溶胀倍数为464.6，拉伸强度为0.15N，扫描电镜下观察到多束丝状物，如图2所示。图1和图2中扫描电镜的放大倍数相同，由图可知，实施例4中所得凝胶的交联程度明显优于对比例中的交联程度。

由以上数据可以看出，本申请用木薯渣水解液替代葡萄糖作为碳源后，可明显地提高所得水凝胶的拉伸强度等指标，在其中添加透明质酸后，其各个指标有了更明显得提升。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。