本发明属于多肽纯化领域，具体涉及一种脂肽的纯化方法。
技术背景
美容肽或美容胜肽,是属于降解的小分子胶原蛋白，含氨基酸基团，一般由2-10个氨基酸组成。胜肽也是人体中原本就存在的成分，是一种由氨基酸组成的链状结构。我们所熟悉的蛋白质，就是一种多胜肽链。胜肽的生物学活性取决于其氨基酸组成和序列，人体内各种生理进程几乎都是由特定的氨基酸序列组成的多肽或者蛋白质调控的。因此，生物活性肽成为了化妆品研发和应用的全新方向和思路，并且功能越来越细分，如：抗衰老、抗过敏、修复、抗氧化、抗水肿、促进毛发再生、抑制黑色素生成、丰胸、减肥等。
脂肽（棕榈酰六肽）即为美容肽的一种，是一种属于matrikine系列的信号肽，特别与修复年龄相关性皮肤损伤有关。在弹力蛋白的整个分子结构中六肽vgvapg片段重复了六次之多，因此被称作“springfragment”。棕榈酰六肽具有趋化作用，可以促进真皮成纤维细胞迁移、增殖和基质大分子合成（如弹力蛋白，胶原蛋白等）,为皮肤提供支撑。同时它还可以诱导成纤维细胞和单核细胞到特定的位置以达到伤口修复和组织更新。棕榈酰六肽具有类似能抑制神经传导物质，阻断神经肌肉间的传导功能，避免肌肉过度收缩，就能防止细纹形成,能够减缓肌肉收缩的力量，让肌肉放松，减少动态纹的发生与消除细纹；有效重新组织胶原弹力，可以增加弹力蛋白的活性，使脸部线条放松，皱纹抚平改善松弛。可用于化妆品内，作为抗皱成分，且效果极佳。
因此这条脂肽在美容品中得到了广泛的应用，但因这条多肽的氨基酸都是疏水性的，同时含有一个溶解性很差的棕榈酸，使其溶解性很差，造成目前常规的纯化方式存在收率低，成本高的缺点。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种低成本、高收率、适合产业的难溶性脂肽的纯化方法，主要解决目前的纯化方法中粗产品难溶，收率低的问题。
本发明的技术方案为：一种难溶性脂肽的纯化制备方法，包括以下步骤：
（1）将脂肽粗品溶于氨水中，放于水浴锅中加热搅拌直至溶液呈澄清状态，冷却，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
（2）用反相高效液相色谱法进行纯化，填料为反相聚合物色谱柱，流动相a为质量百分比为0.05%~0.1%的碳酸氢铵水溶液，流动相b为纯乙腈溶液，梯度洗脱，流动相梯度为a:b由（60~40）:（40~60）到（40~20）:（60~80），收集主峰；
（3）用反相高效液相色谱法进行二次纯化同时转盐，填料为c4反相硅胶柱，流动相c为体积百分比为1~5%的冰醋酸水溶液，流动相d为体积百分比为1~5%的冰醋酸乙腈溶液，梯度洗脱，流动相梯度为c:d由（50~40）:（50~60）到（30~20）:（70~80），收集检测合格后的主峰，减压蒸馏，冷冻干燥，得到纯度大于98%以上的脂肽。
上述步骤（1）中，氨水的浓度为质量百分比10%，粗品的溶解浓度为20mg/ml~40mg/ml，优选为30mg/ml，粗品的溶解需要水浴加热搅拌，温度为35~45℃，优选40℃；
上述步骤（2）中，填料为ps/dvb基质的反相聚合物填料，粒径为10-15μm，优选10μm，流动相a优选质量百分比为0.1%的碳酸氢铵水溶液，流动相梯度为a:b优选为60:40到40:60；
上述步骤（3）中，填料为四烷基硅烷键合硅胶的反相填料，粒径为10-15μm，优选为10μm，，流动相c优选体积百分比为2%的冰醋酸水溶液，流动相d优选体积百分比为2%的冰醋酸乙腈溶液，流动相梯度为c:d优选为45:55到35:65。
本发明的有益效果为：
（1）本发明打破了多肽纯化常规的以酸性或中性体系为流动相的传统，利用碱性溶剂及体系成功解决了脂肽难溶的难题，有效提高了多肽的溶解性，降低了纯化的难度，极大的提高了纯化的收率，同时也使第一步纯化得到的溶液已经呈弱碱性，为后续转盐节省了大量的时间和溶剂，有效降低了成本；
（2）本发明在转盐时使用c4色谱柱使极性很大的脂肽保留时间大大缩短，同时通过梯度洗脱将二次纯化也一并同时完成，仅一步就得到合格产品，极大的降低了有机溶剂的使用量，同时节省了时间，有效降低了成本。
附图说明
图1是纯化后得到的精品的hplc图。
图2是纯化后得到的精品的ms图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
（1）称取300mg脂肽溶于10ml的质量百分比为10%的氨水中，放于40℃水浴锅中加热搅拌直至溶液呈澄清状态，冷却，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
（2）用填料为ps/dvb基质的反相聚合物色谱柱进行纯化，填料粒径为10μm，色谱柱内径：21.6mm*250mm，流速为20ml/min，流动相a为质量百分比为0.1%的碳酸氢铵水溶液，流动相b为纯乙腈溶液，梯度洗脱，0到40min分钟流动相梯度为a:b由60:40到40:60，收集主峰，经检测主峰纯度在70%以上的液体合并，减压蒸馏，去除乙腈后收集待用；
（3）将步骤（2）收集的液体用c4反相色谱柱进行二次纯化同时转盐，c4填料粒径为10μm，色谱柱内径30mm*250mm，流速为30ml/min，流动相c为体积百分数为2%的冰醋酸水溶液，流动相d为体积百分比为2%的冰醋酸乙腈溶液，梯度洗脱，0到60min分钟流动相梯度为c:d由45:55到35:65，收集主峰，经检测主峰纯度在98%以上的液体合并，减压浓缩，冷冻干燥，得到合格的精品，收率为78%。产品的hplc图和ms图见图1、2。
实施例2
（1）称取1g脂肽溶于40ml的质量百分比为10%的氨水中，放于35℃水浴锅中加热搅拌直至溶液呈澄清状态，冷却，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
（2）用填料为ps/dvb基质的反相聚合物色谱柱进行纯化，填料粒径为12μm，色谱柱内径：50mm*250mm，流速为80ml/min，流动相a为质量百分比为0.08%的碳酸氢铵水溶液，流动相b为纯乙腈溶液，梯度洗脱，0到40min分钟流动相梯度为a:b由60:40到40:60，收集主峰，经检测主峰纯度在70%以上的液体合并，减压蒸馏，去除乙腈后收集待用；
（3）将步骤（2）收集的液体用c4反相色谱柱进行二次纯化同时转盐，c4填料粒径为12μm，色谱柱内径50mm*250mm，流速为60ml/min，流动相c为体积百分数为2%的冰醋酸水溶液，流动相d为体积百分比为2%的冰醋酸乙腈溶液，梯度洗脱，0到60min分钟流动相梯度为c:d由50:50到35:65，收集主峰，经检测主峰纯度在98%以上的液体合并，减压浓缩，冷冻干燥，得到合格的精品，收率为70%。产品的hplc图和ms图见图1、2。
实施例3
（1）称取7g脂肽溶于250ml的质量百分比为10%的氨水中，放于40℃水浴锅中加热搅拌直至溶液呈澄清状态，冷却，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
（2）用填料为ps/dvb基质的反相聚合物色谱柱进行纯化，填料粒径为15μm，色谱柱内径：100mm*250mm，流速为180ml/min，流动相a为质量百分比为0.1%的碳酸氢铵水溶液，流动相b为纯乙腈溶液，梯度洗脱，0到40min分钟流动相梯度为a:b由55:45到35:65，收集主峰，经检测主峰纯度在70%以上的液体合并，减压蒸馏，去除乙腈后收集待用；
（3）将步骤（2）收集的液体用c4反相色谱柱进行二次纯化同时转盐，c4填料粒径为15μm，色谱柱内径100mm*250mm，流速为150ml/min，流动相c为体积百分数为3%的冰醋酸水溶液，流动相d为体积百分比为3%的冰醋酸乙腈溶液，梯度洗脱，0到60min分钟流动相梯度为c:d由45:55到40:60，收集主峰，经检测主峰纯度在98%以上的液体合并，减压浓缩，冷冻干燥，得到合格的精品，收率为75%。产品的hplc图和ms图见图1、2。
实施例4
（1）称取15g脂肽溶于500ml的质量百分比为10%的氨水中，放于45℃水浴锅中加热搅拌直至溶液呈澄清状态，冷却，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
（2）用填料为ps/dvb基质的反相聚合物色谱柱进行纯化，填料粒径为15μm，色谱柱内径：150mm*250mm，流速为300ml/min，流动相a为质量百分比为0.1%的碳酸氢铵水溶液，流动相b为纯乙腈溶液，梯度洗脱，0到40min分钟流动相梯度为a:b由60:40到40:60，收集主峰，经检测主峰纯度在70%以上的液体合并，减压蒸馏，去除乙腈后收集待用；
（3）将步骤（2）收集的液体用c4反相色谱柱进行二次纯化同时转盐，c4填料粒径为15μm，色谱柱内径150mm*250mm，流速为250ml/min，流动相c为体积百分数为5%的冰醋酸水溶液，流动相d为体积百分比为5%的冰醋酸乙腈溶液，梯度洗脱，0到60min分钟流动相梯度为c:d由50:50到40:60，收集主峰，经检测主峰纯度在98%以上的液体合并，减压浓缩，冷冻干燥，得到合格的精品，收率为72%。产品的hplc图和ms图见图1、2。
实施例5
（1）称取15g脂肽溶于500ml的质量百分比为10%的氨水中，放于40℃水浴锅中加热搅拌直至溶液呈澄清状态，冷却，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
（2）用填料为ps/dvb基质的反相聚合物色谱柱进行纯化，填料粒径为15μm，色谱柱内径：150mm*250mm，流速为300ml/min，流动相a为质量百分比为0.1%的碳酸氢铵水溶液，流动相b为纯乙腈溶液，梯度洗脱，0到40min分钟流动相梯度为a:b由60:40到40:60，收集主峰，经检测主峰纯度在70%以上的液体合并，减压蒸馏，去除乙腈后收集待用；
（3）将步骤（2）收集的液体用c4反相色谱柱进行二次纯化同时转盐，c4填料粒径为15μm，色谱柱内径150mm*250mm，流速为250ml/min，流动相c为体积百分数为2%的冰醋酸水溶液，流动相d为体积百分比为2%的冰醋酸乙腈溶液，梯度洗脱，0到60min分钟流动相梯度为c:d由45:55到35:65，收集主峰，经检测主峰纯度在98%以上的液体合并，减压浓缩，冷冻干燥，得到合格的精品，收率为75%。产品的hplc图和ms图见图1、2。
实施例6
（1）称取15g脂肽溶于500ml的质量百分比为10%的氨水中，放于40℃水浴锅中加热搅拌直至溶液呈澄清状态，冷却，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
（2）用填料为ps/dvb基质的反相聚合物色谱柱进行纯化，填料粒径为15μm，色谱柱内径：150mm*250mm，流速为300ml/min，流动相a为质量百分比为0.1%的碳酸氢铵水溶液，流动相b为纯乙腈溶液，梯度洗脱，0到40min分钟流动相梯度为a:b由50:50到40:60，收集主峰，经检测主峰纯度在70%以上的液体合并，减压蒸馏，去除乙腈后收集待用；
将步骤（2）收集的液体用c4反相色谱柱进行二次纯化同时转盐，c4填料粒径为15μm，色谱柱内径150mm*250mm，流速为250ml/min，流动相c为体积百分数为2%的冰醋酸水溶液，流动相d为体积百分比为2%的冰醋酸乙腈溶液，梯度洗脱，0到60min分钟流动相梯度为c:d由45:55到35:65，收集主峰，经检测主峰纯度在98%以上的液体合并，减压浓缩，冷冻干燥，得到合格的精品，收率为72%。产品的hplc图和ms图见图1、2。