一种米尔贝霉素合成正调控基因kelR、编码蛋白、基因工程菌及其制备方法和应用与流程

本发明属于微生物制药领域，具体涉及一种米尔贝霉素合成正调控基因kelr、该基因编码的蛋白、过表达kelr的基因工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

生物药物尤其是大环内酯类正在并且越来越多地应用于兽医学和农业。米尔贝霉素(milbemycin)是其中一个有代表性的对害虫具有广谱抑制同时具有较好的生态友好性的商业化农药及兽药。米尔贝霉素是一类十六元大环内酯类抗生素，化学结构与阿维菌素相似。米尔贝霉素1967年首次在日本被发现，并最先在日本登记为杀螨剂，用于农作物及经济作物等的害虫防治。之后在2006年于澳大利亚被登记用作集中花卉的二斑叶螨的杀螨剂。到现在，米尔贝霉素已在美国、中国、意大利等43个国家和地区被批准用于共24种农作物、经济作物及花卉的害虫防治。米尔贝霉素(a3：a4＝30:70)比销售量最多的高效杀螨剂阿维菌素(avermectin)杀螨活性略高，同时对大鼠的毒性比阿维菌素低40倍。其因此被美国环保署认定为危险性小的杀虫剂。而荷兰批准其成为作物生产过程中的天然产物，属于生态友好型农药。在美国、加拿大等许多国家中米尔贝霉素也已成为一种非常受欢迎的杀螨剂，具有很好的应用前景。还有一些米尔贝霉素的衍生物也表现出非常好的生物活性，并进行了商业化的应用。如米尔贝肟是米尔贝霉素半合成产品，为米尔贝霉素a3、a4的5-肟衍生物(a3：a4＝20:80)，具有抗微丝蚴活性，它被欧美评价为最安全的抗寄生虫药物。其通常被用来预防恶丝虫病以及治疗钩虫和线虫等引起的猫和犬类疾病，同时还可以控制犬类的鞭虫病。米尔贝肟的销售额为欧美市场抗寄生虫药物中的第2位，应用前景十分好。此外，还有米尔贝霉素半合成药物乐平霉素(lepimectin)被登记用于蔬菜和水果的鳞翅目、半翅类等害虫的防治，另外还有研究认为乐平霉素的衍生物可以用于治疗人类的皮肤病；半合成拉替菌素(latidectin)也已商业化，用于防治动物寄生虫。

尽管米尔贝霉素系列产品有巨大的商业价值，世界各国也争相研发产米尔贝霉素菌株，但都没有成功，近半个世纪来全球现仅日本sankyo公司垄断生产米尔贝霉素原药。1999年课题组筛选出了产米尔贝霉素新菌株(授权发明专利4项：cn101100651b、cn10046743c、cn100467472c、cn100490648c)，被命名为冰城链霉菌。这一菌株为我国工业化生产米尔贝霉素提供了基础。除已知的米尔贝霉素类化合物外，冰城链霉菌还产生12个未报道的米尔贝霉素类化合物、环五肽、一个大环内酯类化合物及聚醚类的杀虫剂南昌霉素。

冰城链霉菌在2010年完成了全基因组测序，genebank登录号为cp002047，其基因组大小为11，936，683bp。基因组中至少有47个与聚酮类、非核糖体肽类或萜类等化合物生物合成相关的基因簇，其中包括米尔贝霉素生物合成基因簇，从而对米尔贝霉素的生物合成基因簇的结构、分布以及生物合成过程有了更好的了解(wangxetal.genomesequenceofthemilbemycin-producingbacteriumstreptomycesbingchenggensis.jbacteriol.2010；192:4526-4527)。冰城链霉菌中米尔贝霉素生物合成基因簇有4个主要的开放阅读框(mila1,mila2,mila3,mila4)，这四个开放阅读框共编码12个模块负责米尔贝霉素的聚酮合成。在米尔贝霉素生物合成基因簇中仅有一个正调控基因milr，已研究证实milr通过直接调控mila4和milf的转录来控制米尔贝霉素的生物合成，但直接调控mila1，mila2和mila3的调控基因仍未找到(zhangyetal.characterizationofapathway-specificactivatorofmilbemycinbiosynthesisandimprovedmilbemycinproductionbyitsoverexpressioninstreptomycesbingchenggensis.microbialcellfactories.2016；15,152)。

技术实现要素：

针对如何确定米尔贝霉素生物合成基因簇中直接调控mila1，mila2和mila3的调控基因的问题，本发明提供了一种米尔贝霉素合成正调控基因kelr，所述kelr基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明提供了一种米尔贝霉素合成的正调控蛋白kelr，是由权利要求1所述的米尔贝霉素合成正调控基因kelr所编码的，所述kelr蛋白由274个氨基酸组成，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供了一种高产米尔贝霉素基因工程菌，所述基因工程菌过表达权利要求1所述的米尔贝霉素合成正调控基因kelr，其核苷酸序列如seqidno.1所示，出发菌株为冰城链霉菌streptomycesbingchenggensis、米尔贝霉素链霉菌、吸水链霉菌金泪亚种、灰色产色链霉菌中的一种。

优选地，所述冰城链霉菌为streptomycesbingchenggensisbcwt或streptomycesbingchenggensisbc-120-4。

上述高产米尔贝霉素基因工程菌的制备方法，包含以下步骤：

1)构建米尔贝霉素合成正调控基因kelr过表达载体，所述过表达载体含有米尔贝霉素合成正调控基因kelr，其序列如seqidno.1所示；以及米尔贝霉素合成正调控基因kelr上游启动子，其序列如seqidno.3所示；

2)将步骤1)中构建的米尔贝霉素合成正调控基因kelr过表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，得到含有米尔贝霉素合成正调控基因kelr过表达载体的转化子；

3)将步骤2)所得的转化子与链霉菌进行属间接合和转移，即得到高产米尔贝霉素基因工程菌。

优选地，步骤1)所述米尔贝霉素合成正调控基因kelr的过表达载体的构建过程为：

以冰城链霉菌基因组为模板，pcr扩增得到含有米尔贝霉素合成正调控基因kelr完整编码区和上游启动子的基因片段，所述pcr扩增用的上游引物序列如seqidno.4所示，下游引物序列如seqidno.5所示；用限制性内切酶xbai和ecori进行酶切，获得的酶切产物连接入经xbai和ecori酶切处理的pset152载体，得到的重组质粒pset152::kelr即为米尔贝霉素合成正调控基因kelr过表达质粒；所述冰城链霉菌为streptomycesbingchenggensisbcwt或streptomycesbingchenggensisbc-120-4。

优选地，步骤3)所述链霉菌为streptomycesbingchenggensisbcwt、streptomycesbingchenggensisbc-120-4、米尔贝霉素链霉菌、吸水链霉菌金泪亚种、灰色产色链霉菌中的一种。

所述冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbcwt，记载在高爱丽,王相晶,etal.(2007)."吸水链霉菌新种的筛选和鉴定."东北农业大学学报38(3):361-364.

所述冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbc-120-4，记载在wang,h.y.,j.zhang,etal.(2014)."combinedapplicationofplasmamutagenesisandgeneengineeringleadsto5-oxomilbemycinsa3/a4asmaincomponentsfromstreptomycesbingchenggensis."appliedmicrobiologyandbiotechnology98(23):9703-9712.

其他菌株均记载在林秀萍,刘永宏,李季伦.米尔贝霉素的产生菌、理化性质、生物学活性及应用研究进展[j].中国抗生素杂志,2013,38(04):314-322。

优选地，步骤2)所述的大肠杆菌宿主细胞为e.coliet12567\puz8002。

本发明所述的米尔贝霉素合成正调控基因kelr在微生物发酵生产米尔贝霉素中能够提高米尔贝霉素产量。

所述的高产米尔贝霉素基因工程菌可应用在发酵生产米尔贝霉素中，培养高产米尔贝霉素的基因工程菌株，从培养物中分离米尔贝霉素。

本领域技术人员应理解，对seqidno.1所示的kelr基因进行一个或多个核苷酸的突变，例如替换、增加、缺失等得到的基因，如果仍能够编码具有正调控米尔贝霉素合成的活性，甚至是相比于seqidno.2所示蛋白增强的活性时，仍适用于本发明。

本领域技术人员应理解，对seqidno.2所示的kelr蛋白进行一个或多个氨基酸的突变和/或修饰，例如替换、增加、缺失等得到的多肽，如果仍具有正调控米尔贝霉素合成的活性，甚至是相比于seqidno.2所示蛋白增强的活性时，仍适用于本发明。编码该多肽的基因则同样可用于本发明来构建提高米尔贝霉素产量的工程菌。

有益效果

本发明首次发现直接调控米尔贝霉素合成的正调控基因kelr以及其编码蛋白的功能。该蛋白可正调控米尔贝霉素的合成。所述米尔贝霉素合成的正调控基因kelr在冰城链霉菌中对应于基因sbi_06842(genebank登录号)，本发明的研究显示，kelr的缺失直接导致米尔贝霉素的合成终止，重新引入一个拷贝的kelr则恢复米尔贝霉素的合成，过表达kelr能促进米尔贝霉素产量提升。表明kelr基因编码的调控蛋白为米尔贝霉素合成基因簇的正调控蛋白。

通过同源重组双交换考察了kelr的功能，确定其能够正调控米尔贝霉素的生物合成，在米尔贝霉素合成过程中起着决定性作用。

在此基础上，本发明构建了高产米尔贝霉素基因工程菌，通过提高冰城链霉菌中kelr基因拷贝数，过表达kelr能促进米尔贝霉素产量提升，因此，降低了生产成本，提高了经济效益。

附图说明

图1中a为卡那霉素抗性基因质粒puc119::neo；b为基因阻断用质粒pkc1139；c为过表达用质粒pset152的物理谱图。

图2为kelr阻断突变株及回补突变株构建示意图，wt为野生型。

图3为对kelr阻断突变株及其回补突变株发酵液进行高效液相色谱分析的谱图；横坐标为保留时间，单位为分钟，纵坐标为吸光度，单位为mau。

图4为kelr基因过表达菌株构建示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所述的载体puc119::neo，购买自普如汀生物技术(北京)有限公司。

质粒小量制备试剂盒购买自axyprep，货号：ap-mn-p-250g。

凝胶回收试剂盒购买自axyprepdna，货号：ap-gx-250。

载体pkc1139，购买自biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。

lb培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l，ph7.2-7.5。121℃，1.01×105pa灭菌20分钟。

2×yt培养基配方为：胰蛋白胨16g，酵母浸粉10g，氯化钠5g，蒸馏水1l，ph7.2-7.5。121℃，1.01×105pa灭菌20分钟。

实施例1.米尔贝霉素合成正调控基因kelr功能的研究。

一、构建米尔贝霉素合成正调控基因kelr阻断突变株

利用引物6842up-f/6842up-r从冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbcwt(所述streptomycesbingchenggensisbcwt记载在高爱丽,王相晶,etal.(2007)."吸水链霉菌新种的筛选和鉴定."东北农业大学学报38(3):361-364.)基因组上pcr扩增得到kelr基因同源重组左臂片段，即kelr的上游片段。

利用引物6842down-f/6842down-r从冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbcwt基因组上pcr扩增得到kelr基因同源重组右臂片段，即kelr的下游片段。

所述冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbcwt基因组dna的提取按照链霉菌遗传操作手册(kieser,t.,m.j.bibb,etal.(2000).practicalstreptomycesgenetics,johninnesfoundationnorwich)所述方法操作。.

引物序列由北京六合华大基因科技股份有限公司合成(下同)，下划线代表限制性内切酶酶切位点(下同)：

6842up-f：5’cccaagcttgtggcgtggaagcagttgaggaaggc3’

(aagctt：hindiii酶切位点)

6842up-r：5’gctctagacaccgggagcatctggttggcgta3'

(tctaga：xbai酶切位点)

6842down-f：5'cggaattcgacgatgtcgaggcttcgtttctgttcc3'

(gaattc：ecori酶切位点)

6842down-r：5'gctctagatactcggtgtccaggctggtggtgg3'

(tctaga：xbai酶切位点)

pcr反应体系：10×kod-plus缓冲液5μl，2mmdntps5μl，25mmmgso42μl，kod-plus(1u/μl)1μl(以上试剂购自toyobo，japan)；10μm引物6842up-f和6842up-r各1.5μl，(或10μm引物6842down-f和6842down-r各1.5μl)，基因组模板1μl(1-50ng)，32μl，dmso2.5μl，加ddh2o至50μl。

pcr循环条件：预变性：94℃，2min。变性：94℃，15sec；退火：60℃，30sec。延伸：68℃，1min，30个循环；68℃，2min，4℃，保存。

扩增得到kelr的上游片段1875bp和下游片段2076bp，上游片段经hindiii和xbai双酶切(限制性内切酶均购自takara，下同)，下游片段经xbai和ecori双酶切，利用天根琼脂糖dna回收试剂盒进行回收。上游片段连入用hindiii和xbai酶切的质粒puc119::neo骨架(该质粒的物理谱图如图1中a所示)，得到的重组质粒为puc6842upneo。用hindiii和ecori双酶切puc6842upneo，回收2874bp的upneo片段，将upneo片段及kelr2076bp下游片段的酶切产物连入经hindiii和xbai酶切的pkc1139(该质粒的物理谱图如图1中b所示，pkc1139)，得到kelr阻断质粒pkc6842。将kelr阻断质粒pkc6842转化e.coliet12567\puz8002感受态细胞，进而通过属间接合转移转入冰城链霉菌bcwt中。筛选具有安普霉素(apramycin,apr)或卡那霉素(kanamycin,kan)抗性的接合子。将得到的接合子转接至含有卡那霉素和安普霉素的液体培养基sspy中培养，所述卡那霉素在sspy培养基中的终浓度为25ug/ml，所述安普霉素在sspy培养基中的终浓度为30ug/ml，本申请中其他涉及卡那霉素和安普霉素的培养基，抗生素浓度均按此浓度添加。经质粒提取和酶切验证的接合子挑取6个转接至含有卡那霉素的sspy平板上，28℃培养7天，制备孢子悬液，以每个平皿约10⁴个孢子的浓度涂布在含有卡那霉素的sspy平板上，于37℃培养。本申请中所述质粒提取均采用axyprep质粒小量制备试剂盒进行。

pkc1139具有温度敏感型复制子，在高于34℃条件下培养不能自主复制，重组质粒只有与冰城链霉菌染色体dna发生同源重组，才能在含有卡那霉素的ms培养基上生长。若发生双交换，则卡那霉素抗性基因正确地插入到靶基因内部，此时菌落表现为kan^rapr^s(卡那霉素抗性，安普霉素敏感)。将表现kan^rapr^s的菌落同时影印到sspy/kan和sspy/apr平板上，于28℃培养。随机挑选突变株，接种在没有任何选择压力的sspy培养基上，28℃培养。转接3代后重新接种到分别含有卡那霉素和安普霉素的sspy培养基上，结果仍然表现kan^rapr^s，说明通过双交换得到了遗传稳定的kelr阻断突变株，命名为δkelr，参见图2第二排所示δkelr。

按照链霉菌遗传操作手册所述方法提取kelr阻断突变株基因组，并利用引物con6842-f/con6842-r进行pcr扩增鉴定。

con6842-f：5'tgctcgtcgaacggatcgcagacc3'

con6842-r：5'tggaacgacaggacccacggaacg3'

pcr反应体系和循环条件同上。发生双交换之后，以kelr阻断突变株δkelr的基因组dna为模板，用引物con6842-f/con6842-r扩增得到的片段理论大小为3902bp，用出发菌株bcwt基因组做模板扩增得到的片段大小则为3144bp。

二、构建米尔贝霉素合成正调控基因kelr回补突变株

以冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbcwt基因组为模板，利用引物6842self-f/6842self-r扩增调控基因kelr及其启动子区域共计1653bp，对应的核苷酸序列如seqidno.6所示。

6842self-f：5'gctctagaggtgcggggagaagcccaatg3'

(tctaga：xbai酶切位点)

6842self-r：5'ggaattcccgacaggacccacggaacg3'

(gaattc：ecori酶切位点)

pcr反应体系：10×kodbuffer5μl，dntps(2mm)5μl，模板dna(冰城链霉菌bcwt基因组)10pg-1000ng，10μm上游引物6842self-f、下游引物6842self-r(seqidno.4所示，seqidno.5所示；10μm)各2μl，25mmmgso42μl，kodplusdnapolymerase(1u/μl)1μl，dmso2.5μl，ddh2o补足到50μl。反应条件：94℃4min，94℃1min，65℃30sec，68℃3min，31个循环，68℃10min。对1653bp的pcr产物切胶回收，本申请中所述胶回收均采用axyprepdna凝胶回收试剂盒进行。用xbai和ecori内切酶分别对上述胶回收产物和载体pset152进行双酶切处理，胶回收产物双酶切产物大小为1651bp，pset152双酶切产物大小为5685bp：

酶切体系：kelr片段或载体pset1521-2μg，10×mbuffer10μl，xbai2.5μl，ecori2.5μl，ddh2o补足到100μl)(pset152质粒物理谱图见图1中c所示)。(所述pset152质粒记载在biermanmetal.plasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofdnafromescherichiacolitostreptomycesspp.gene.1992；116:43-9)。

然后将酶切产物进行连接：

所述连接体系：载体pset15210-20ng，kelr片段50-100ng，10×t4dnaligasebuffer1μl，t4dnaligase0.8μl，ddh2o补足到10μl。

将以上的连接产物在22℃水浴3h后转化到大肠杆菌dh5α中，在lb培养基平板上37℃过夜培养后挑取单克隆，37℃，小试管中lb培养基进行过夜培养，提质粒后得到重组质粒pset152::kelr，载体图谱如图4所示。将pset152::kelr转化e.coliet12567\puz8002感受态细胞，通过属间接合转移转入kelr阻断突变株中。

用安普霉素的抗性标记筛选转化子，pset152为整合型载体，不能在链霉菌中自主复制，只能通过pset152载体上携带的噬菌体фc31attp位点与链霉菌基因组attb位点发生特异性重组而整合到染色体上，与染色体组合从而得到kelr阻断突变株的回补突变株δkelr::kelr，如图2第三排所示δkelr::kelr。

实施例2.米尔贝霉素合成正调控基因kelr阻断突变株及回补突变株的米尔贝霉素合成分析。

一、发酵培养采用如下培养基

种子培养基(1l)：蔗糖10g，脱脂奶粉1g，蛋白胨3.5g，酵母浸粉5g，k2hpo4·3h2o0.5g，蒸馏水1l，ph7.0。121℃，1.01×10⁵pa灭菌20分钟。

发酵培养基(1l)：蔗糖80g，黄豆饼粉20g，脱脂奶粉1g，k2hpo4·3h2o1g，feso4·7h2o0.1g，caco33g，蒸馏水1l，ph7.0-7.2。121℃，1.01×10⁵pa灭菌30分钟。

二、发酵工艺

将预先准备好的冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbcwt、上述构建好的敲除突变株δkelr和回补突变株δkelr::kelr的孢子在ms平板分别进行划线活化，铲取约2cm²菌丝块接种到内装25ml上述种子培养基的三角瓶中，28℃，250r/min振荡培养2天后。将所得的种子菌液按5％(体积分数)接种量转接到发酵培养基中，28℃、250r/min振荡培养10天。

三、发酵液中米尔贝霉素的高效液相色谱分析

取0.5ml发酵料液，加入1.5ml无水乙醇，振荡15min，之后4000rpm离心15min。将上清用0.22μm滤膜过滤后，滤液保存于-20℃冰箱。

hplc测定条件如下：

色谱柱：agilenttc-c18，5μm，150×4.6mm。

流动相：a:mecn-h2o-meoh(350:50:100,v/v/v)，b:meoh。

流速：1ml/min。

检测波长：242nm。

进样体积：10μl。

分析：0-15min，b相从0％梯度洗脱到100％。

如图3所示，以冰城链霉菌野生型bcwt发酵液为对照，培养发现kelr阻断突变株δkelr米尔贝霉素合成终止，即检测不到任何米尔贝霉素的生成；而回补突变株δkelr::kelr又能够恢复合成米尔贝霉素，说明kelr为米尔贝霉素合成途径中的正调控基因，是决定米尔贝霉素合成的开关。

实施例3.高产米尔贝霉素基因工程菌的构建。

将实施例1中回补使用的重组载体pset152::kelr转化e.coliet12567\puz8002感受态细胞中，得到含有pset152::kelr的e.coliet12567\puz8002转化子，通过属间接合转移将pset152::kelr转入冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbc-120-4菌株(所述bc-120-4菌株记载在wanghetal.combinedapplicationofplasmamutagenesisandgeneengineeringleadsto5-oxomilbemycinsa3/a4asmaincomponentsfromstreptomycesbingchenggensis.appliedmicrobiologyandbiotechnology.2014；98:9703-9712)中，具体过程为：

制备大肠杆菌et12567\puz8002的感受态，所述制备方法按照链霉菌遗传操作手册所述。构建好的质粒转化入et12567\puz8002的感受态细胞中；涂布于含apr抗生素的lb培养基平板上，37℃过夜培养，挑取lb平板上的转化子单菌落转接于4ml含筛选所用apr抗生素的lb小试管中，37℃条件下过夜培养；按1:50的体积比例将小试管中的菌液接种于含apr抗生素的三角瓶中，37℃，250rpm培养直到od600为0.4左右；4000rpm离心10min，弃去上清后收集菌体，等体积lb液体培养基洗涤两次，6000rpm离心10min收集菌体，将沉淀菌体重悬于0.1倍体积的lb液体培养基中。同时，制备链霉菌bc-120-4孢子悬液，刮取成熟孢子至含玻璃珠三角瓶，5只5-15ml的斜面培养基培养的孢子用大约20ml水，250rpm，30min震荡打散孢子；4000rpm离心10min，弃上清回收孢子沉淀，加入等体积2×yt液体培养基洗涤一次后收集孢子沉淀，再重悬浮于5ml2×yt液体培养基中；在45℃下热激10分钟后，28℃，250rpm孵育2小时；含有重组载体pset152::kelr的e.coli和冰城链霉菌bc-120-4孢子悬液混匀，3000rpm离心10min，弃去上清，用残液重悬浮沉淀，涂布于含终浓度为10mmmgcl2的ms平板；在28℃进行培养20-24h，用含有1.5mg萘啶酮酸和终浓度为4～6μg/ml安普霉素的灭菌1mlddh2o涂布；空干后，在28℃继续培养4-5天，挑取具有安普霉素抗性的接合子可得到高产米尔贝霉素基因工程菌。

从中挑选8株工程菌，按照实施例2的方法对其进行发酵及米尔贝霉素液相色谱检测，与出发菌株冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbc-120-4进行比较，结果表明高产米尔贝霉素基因工程菌米尔贝霉素产量平均达到4676mg/l，出发菌株冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbc-120-4的米尔贝霉素产量为3833mg/l，产量提高了约22％。说明kelr过表达基因工程菌能够获得比出发菌株更高的米尔贝霉素产量。

实施例4.与实施例1的区别在于：本实施例中所用的基因组模板，是将冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbcwt替换为冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbc-120-4。其他步骤同实施例1。

获得的米尔贝霉素合成正调控基因kelr阻断突变株及回补突变株经米尔贝霉素合成分析，表明来自于冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbc-120-4的kelr为米尔贝霉素合成途径中的正调控基因，是决定米尔贝霉素合成的开关。

实施例5.与实施例3的区别在于：将米尔贝霉素基因工程菌的出发菌株冰城链霉菌streptomycesbingchenggensisbc-120-4替换为生产米尔贝霉素的任何适宜的菌株，如米尔贝霉素链霉菌、冰城链霉菌、吸水链霉菌如吸水链霉菌金泪亚种和灰色产色链霉菌等,其他步骤同实施例3，最终得到高产米尔贝霉素基因工程菌株。

所述生产米尔贝霉素的任何适宜的菌株均记载在林秀萍,刘永宏,李季伦.米尔贝霉素的产生菌、理化性质、生物学活性及应用研究进展[j].中国抗生素杂志,2013,38(04):314-322。

sequencelisting

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>一种米尔贝霉素合成正调控基因kelr、编码蛋白、基因工程菌及其制备方法和应用

<130>

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>825

<212>dna

<213>kelr基因

<400>1

atggaaatcaaggtgttggggccgctgagcgtcgaggcctgcggtcagtcgatcgtgccc60

agcgcgggcaagccgcggcagatcctcgcattgctttccgtgtacgccaaccagatgctc120

ccggtgcccacccttatggaggaaatctggggcgcgcagatgccgcgcagtgcgttgacc180

acgctccagacgtacatccttcagctccggcggagactggccacggcctacggtccgcag240

gcgcccgaggcatcgaagagcgtgctggctacgcgatacggcggatatgtgctggaggcc300

cagccgggcgcggtggacatccacgagtacgaccggctggtggccgccgggcgggacgcg360

ctcgacgtcggcgacgatgtcgaggcttcgtttctgttccgcgaggcgctggcggtctgg420

cgcggtcccgcgctcgtggacgtacgcgtcggaccgatcctggagatcgagctggcccgg480

ctggaggagagccgtctcggggtcctggagcgtcggatcgaggccgatctgcgcctggga540

cgccacgccgaactcctcaccgagctcaccgaactgacggcccggcatccgctccacgag600

gggctgcacgcccagtgcatggctgccctgtaccggtccggccgcccatggcaggcgctg660

gaggtgtaccaggggctgcgcggccggctcgtcgaggacctggggctcgaaccctccccg720

cggctgcagaagctgcagcaggcggtgctcgcctcggaccccgcgctcgacctggagtcg780

ggcgggcagtggcgccgcccggtgctcgacctgttcgccgcgtag825

<210>2

<211>274

<212>prt

<213>kelr蛋白的氨基酸序列

<400>2

metgluilelysvalleuglyproleuservalglualacysglygln

151015

serilevalproseralaglylysproargglnileleualaleuleu

202530

servaltyralaasnglnmetleuprovalprothrleumetgluglu

354045

iletrpglyalaglnmetproargseralaleuthrthrleuglnthr

505560

tyrileleuglnleuargargargleualathralatyrglyprogln

65707580

alaproglualaserlysservalleualathrargtyrglyglytyr

859095

valleuglualaglnproglyalavalaspilehisglutyrasparg

100105110

leuvalalaalaglyargaspalaleuaspvalglyaspaspvalglu

115120125

alaserpheleupheargglualaleualavaltrpargglyproala

130135140

leuvalaspvalargvalglyproileleugluilegluleualaarg

145150155160

leuglugluserargleuglyvalleugluargargileglualaasp

165170175

leuargleuglyarghisalagluleuleuthrgluleuthrgluleu

180185190

thralaarghisproleuhisgluglyleuhisalaglncysmetala

195200205

alaleutyrargserglyargprotrpglnalaleugluvaltyrgln

210215220

glyleuargglyargleuvalgluaspleuglyleugluproserpro

225230235240

argleuglnlysleuglnglnalavalleualaseraspproalaleu

245250255

aspleugluserglyglyglntrpargargprovalleuaspleuphe

260265270

alaala

<210>3

<211>611

<212>dna

<213>基因kelr上游启动子

<400>3

gaggtgcggggagaagcccaatgtgcccatcagccgacgctgatggtgcagatgcagatg60

cccggcgcgggagcgggcgacggctcggcggagaggtcctcgatgaccaagtcgtcgacg120

cccaagcggcctcggggaggtggggtgcgttcccgcgtcgtccggtgcggtgcatcgcaa180

ggcggagcggcgccctcgtactgggcgtactcgggtgctgcgacaacgcggcgaggtgcc240

gtgccgggcggcgcgggggcgtgcctcacttccccgaggtcgcttgggtcggcggggccg300

gggcccgcggcgcagagggccgaagggctcgcggggagcggggatgtgtcggtcattgtg360

ggctctcctcggggtgagaggcggtcctggcaaggagtctgcgatgacggatccacggct420

tgccagtgctttcctcataaccagggtgtgaacttgtcatgacctccgcctcacaggact480

catgcacggttcgggagtccggcactggccgtgtccaccacccgcacgcgaggctcatat540

gtgcctcaatggcagggccgcgcggccaaagaggcacctggtggaccgtctgacggaggt600

gtgacaggacc611

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>上游引物6842self-f

<400>4

gctctagaggtgcggggagaagcccaatg29

<210>5

<211>27

<212>dna

<213>下游引物6842self-r

<400>5

ggaattcccgacaggacccacggaacg27

<210>6

<211>1653

<212>dna

<213>基因kelr及其启动子区域

<400>6

gctctagaggtgcggggagaagcccaatgtgcccatcagccgacgctgatggtgcagatg60

cagatgcccggcgcgggagcgggcgacggctcggcggagaggtcctcgatgaccaagtcg120

tcgacgcccaagcggcctcggggaggtggggtgcgttcccgcgtcgtccggtgcggtgca180

tcgcaaggcggagcggcgccctcgtactgggcgtactcgggtgctgcgacaacgcggcga240

ggtgccgtgccgggcggcgcgggggcgtgcctcacttccccgaggtcgcttgggtcggcg300

gggccggggcccgcggcgcagagggccgaagggctcgcggggagcggggatgtgtcggtc360

attgtgggctctcctcggggtgagaggcggtcctggcaaggagtctgcgatgacggatcc420

acggcttgccagtgctttcctcataaccagggtgtgaacttgtcatgacctccgcctcac480

aggactcatgcacggttcgggagtccggcactggccgtgtccaccacccgcacgcgaggc540

tcatatgtgcctcaatggcagggccgcgcggccaaagaggcacctggtggaccgtctgac600

ggaggtgtgacaggaccatggaaatcaaggtgttggggccgctgagcgtcgaggcctgcg660

gtcagtcgatcgtgcccagcgcgggcaagccgcggcagatcctcgcattgctttccgtgt720

acgccaaccagatgctcccggtgcccacccttatggaggaaatctggggcgcgcagatgc780

cgcgcagtgcgttgaccacgctccagacgtacatccttcagctccggcggagactggcca840

cggcctacggtccgcaggcgcccgaggcatcgaagagcgtgctggctacgcgatacggcg900

gatatgtgctggaggcccagccgggcgcggtggacatccacgagtacgaccggctggtgg960

ccgccgggcgggacgcgctcgacgtcggcgacgatgtcgaggcttcgtttctgttccgcg1020

aggcgctggcggtctggcgcggtcccgcgctcgtggacgtacgcgtcggaccgatcctgg1080

agatcgagctggcccggctggaggagagccgtctcggggtcctggagcgtcggatcgagg1140

ccgatctgcgcctgggacgccacgccgaactcctcaccgagctcaccgaactgacggccc1200

ggcatccgctccacgaggggctgcacgcccagtgcatggctgccctgtaccggtccggcc1260

gcccatggcaggcgctggaggtgtaccaggggctgcgcggccggctcgtcgaggacctgg1320

ggctcgaaccctccccgcggctgcagaagctgcagcaggcggtgctcgcctcggaccccg1380

cgctcgacctggagtcgggcgggcagtggcgccgcccggtgctcgacctgttcgccgcgt1440

aggtccctgccggtcccgctcggggctcaggcccttctgccccgcatcaccaccgcgtac1500

gacaaccgcccatcgcacctcccctgaacgcccggcgccgcccttcttgccgggtcggct1560

acggctccgctccccgacaccccccgcgcgggcgagcggagccgtagtgctgtccgcatg1620

cgtttccggacgttccgtgggtcctgtcgttcc1653

<210>7

<211>35

<212>dna

<213>6842up-f

<400>7

cccaagcttgtggcgtggaagcagttgaggaaggc35

<210>8

<211>32

<212>dna

<213>6842up-r

<400>8

gctctagacaccgggagcatctggttggcgta32

<210>9

<211>36

<212>dna

<213>6842down-f

<400>9

cggaattcgacgatgtcgaggcttcgtttctgttcc36

<210>10

<211>33

<212>dna

<213>6842down-r

<400>10

gctctagatactcggtgtccaggctggtggtgg33

<210>11

<211>24

<212>dna

<213>con6842-f

<400>11

tgctcgtcgaacggatcgcagacc24

<210>12

<211>24

<212>dna

<213>con6842-r

<400>12

tggaacgacaggacccacggaacg24