本发明涉及发酵工程及代谢工程领域，尤其是一种实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法。
背景技术
在各种氨基酸的发酵生产中，及时的获取发酵过程中底物、产物以及副产物的信息，有针对性的调整发酵控制参数，对细胞的正常生长和目的产物的高效积累具有重要的意义。代谢流分析(metabolicfluxanalysis)是通过建立细胞内生化反应的化学计量模型和线性优化，预测细胞内代谢流量分布的技术。利用代谢流分析技术可获得大量的细胞内部代谢信息，更好的指导发酵过程。对于产氨基酸微生物进行代谢流分析，需要对发酵液中的多种物质(氨基酸、有机酸、还原糖等)进行检测，通常的方法包括液相色谱、气相色谱以及生物传感分析仪等，但由于不同物质性质不同，无法用单一方法对所有物质进行同时测定。同时，传统分析检测方法存在分析周期长，测试方法繁琐，需要多种仪器结合，且获得的信息量有限等缺点，不易对发酵过程进行实时监控和代谢流分析，容易导致发酵不稳定甚至发酵失败。因此，建立一种快速、准确、多组分同时分析发酵过程中各物质变化的方法，实现微生物细胞氨基酸代谢流的实时测定，对于氨基酸的发酵生产具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种低成本的实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法，利用近红外光谱检测分析技术与代谢流分析调控技术结合快速检测并反映出细胞代谢状态，根据检测结果对发酵过程做出即时调整，具体步骤如下：
(1)针对某种谷氨酸棒杆菌的发酵，在不同发酵条件下，进行多批次的发酵，在每一批发酵过程中按照周期密集地对发酵液样品进行采集；
(2)利用分析设备对样品中的底物和代谢产物含量进行精确测定，并以此数据为基础，建立近红外分析模型和细胞代谢流分析模型，将近红外分析模型和细胞代谢流分析模型分别与发酵控制设备偶联，用来对发酵过程进行控制和调整；
(3)对模型的预测能力进行检验，包括模型的灵敏度、准确度、及对于异常状态的预警能力；
(4)将近红外分析模型、细胞代谢流分析模型与发酵控制设备相关联，实现对发酵过程中细胞代谢状态的实时监控与调整。
优选的，上述实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法，所述步骤(1)中周期为每30min一周期。
优选的，上述实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法，所述步骤(2)中分析设备为近红外分析仪、高效液相色谱仪。
优选的，上述实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法，所述步骤(3)中近红外分析模型的建立步骤如下：
(1)样品的采集：在谷氨酸棒杆菌发酵生产过程中，从发酵开始时，用10mlep管收集发酵液样品，收集时间间隔为20-30min；将收集好的样品存放于-80℃保存，用于扫描近红外光谱以及测定发酵液中各代谢产物浓度；
(2)近红外光谱扫描：在2mm比色杯中加入1ml发酵液样品，在25℃左右室温下，波长范围833-2500nm处，利用tensor37近红外扫描仪对发酵液样品进行扫描，对发酵液样品的近红外光谱进行采集(在扫描过程中，以去离子水作为扫描背景，扫描次数为32次)；
(3)近红外光谱前处理：对采集得到的发酵液样品近红外光谱进行预处理，利用opus7.0软件进行分析预处理，除去噪音等外部条件对光谱的影响；
(4)近红外校正模型的建立：采用偏最小二乘(partialleast-squares，pls)的方法建立谷氨酸棒杆菌发酵过程中各代谢产物浓度的校正模型；以交叉检验(cross-validation)的方法作为模型的检验方法，此种检验方法适用于样品数量较少或适中的样品模型的建立；
模型处理过程中，以rmsecv(交叉验证均方根，rootmeansquareerrorofcrossvalidation)值作为模型准确性的参考指标，rmsecv值越小，则该模型的准确性越高；rmsep值则作为检验模型的参考指标用于完善所建立的预测模型，其值表示真实值与预测值之间的相近程度，数值越小则证明其预测能力越高；rpd(剩余预测偏差)同样是模型准确性和可靠性的参考指标，rpd值越大说明模型越好；所建模型的预测值与样品的实际值之间的关系用r2(决定系数)来表示，其值越接近1，说明所建模型的拟合度越好；
以a、b、c、d……代表发酵液中测定出的代谢产物，则根据上述近红外分析模型建立方法可以建立a、b、c、d……等多个近红外预测模型。
优选的，上述实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法，所述步骤(3)中细胞代谢流分析模型的建立步骤如下：
(1)代谢网络的建立
建立代谢网络需基于以下原则或假设：a：细胞应处于稳定期或细胞浓度变化可以忽略；b：nadph供需平衡，即反应消耗的nadph总量与ppp、tca循环产生的nadph相等；c：大量“无效”循环的存在，atp的消耗量和细胞维持的总能量并不相等，因此不考虑atp总量的平衡；d：无分支点的中间反应及按照固定比例进行的反应，可简化为一个反应方程；
(2)代谢流计算
根据代谢产物各步酶促反应的化学计量平衡式和各代谢节点处的化合物平衡关系，构建该产物合成的代谢网络模型；根据模型所需代谢物(如a、b、c、d、e、f六种代谢物)速率，只需通过扫描近红外光谱，带入上述建立的近红外预测模型中，并从中选择a、b、c、d、e、f代谢物的浓度值，计算出其反应速率，带入到代谢流中就可算出整个合成途径代谢流量。
上述实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法，为保证模型的可靠性和准确性，一方面，需要对尽可能多批次、多时间段的发酵液进行样品采集，以保证建立模型所需的样品数量；另一方面，在对样品中的各物质的实际浓度进行分析时，需要使用高精度的分析设备，以保证用于建立模型的数据的准确。
本发明的有益效果是：
上述实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法，利用近红外光谱检测分析与代谢流分析相结合的方法，建立近红外分析模型、细胞代谢流分析模型，从而达到仅通过近红外分析仪对发酵液的扫描即可反应出当前细胞代谢状态的目的；然后将该模型与发酵控制模型相关联，实现对发酵过程中细胞代谢状态的实时监控与调整。
所述方法将近红外光谱检测分析技术、代谢流分析调控技术以及发酵过程控制技术相结合，最终实现了仅通过近红外分析仪对发酵液的扫描即可反应出当前细胞代谢状态，并根据该结果快速地反馈到发酵控制参数的调整，确保发酵过程中细胞代谢始终处于最有利于目的产物积累的状态，保证发酵过程稳定。
附图说明
图1为l-亮氨酸代谢网络分布图。
图2为l-亮氨酸发酵过程图。
图3为l-亮氨酸发酵液的近红外光谱扫描图谱。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
近红外光谱分析模型的建立
对谷氨酸棒杆菌发酵过程中发酵液样品进行采集，通过对样品进行近红外光谱扫描，得到样品的近红外光谱图。利用高效液相色谱分析技术对样品中各代谢产物的浓度进行准确定量，通过近红外分析软件建立一个包含各个代谢产物浓度的近红外分析模型。
近红外分析模型的建立步骤如下：
(1)样品的采集：在谷氨酸棒杆菌发酵生产过程中，从发酵开始时，用10mlep管收集发酵液样品，收集时间间隔为20-30min。将收集好的样品存放于-80℃保存，用于扫描近红外光谱以及测定发酵液中各代谢产物浓度。
(2)近红外光谱扫描：在2mm比色杯中加入1ml发酵液样品，在25℃左右室温下，波长范围833-2500nm处，利用tensor37近红外扫描仪对发酵液样品进行扫描，对发酵液样品的近红外光谱进行采集(在扫描过程中，以去离子水作为扫描背景，扫描次数为32次)。
(3)近红外光谱前处理：对采集得到的发酵液样品近红外光谱进行预处理，利用opus7.0软件进行分析预处理，除去噪音等外部条件对光谱的影响。
(4)近红外校正模型的建立：采用偏最小二乘(partialleast-squares，pls)的方法建立谷氨酸棒杆菌发酵过程中各代谢产物浓度的校正模型。以交叉检验(cross-validation)的方法作为模型的检验方法，此种检验方法适用于样品数量较少或适中的样品模型的建立。
模型处理过程中，以rmsecv(交叉验证均方根，rootmeansquareerrorofcrossvalidation)值作为模型准确性的参考指标，rmsecv值越小，则该模型的准确性越高。rmsep值则作为检验模型的参考指标用于完善所建立的预测模型，其值表示真实值与预测值之间的相近程度，数值越小则证明其预测能力越高；rpd(剩余预测偏差)同样是模型准确性和可靠性的参考指标，rpd值越大说明模型越好；所建模型的预测值与样品的实际值之间的关系用r2(决定系数)来表示，其值越接近1，说明所建模型的拟合度越好。
以a、b、c、d……代表发酵液中测定出的代谢产物，则根据上述近红外分析模型建立方法可以建立a、b、c、d……等多个近红外预测模型。
实施例2
细胞代谢流分析模型的建立
(1)代谢网络的建立
建立代谢网络需基于以下原则或假设：a：细胞应处于稳定期或细胞浓度变化可以忽略；b：nadph供需平衡，即反应消耗的nadph总量与ppp、tca循环产生的nadph相等；c：大量“无效”循环的存在，atp的消耗量和细胞维持的总能量并不相等，因此不考虑atp总量的平衡；d：无分支点的中间反应及按照固定比例进行的反应，可简化为一个反应方程。
(2)代谢流计算
根据代谢产物各步酶促反应的化学计量平衡式和各代谢节点处的化合物平衡关系，构建该产物合成的代谢网络模型。根据模型所需代谢物(如a、b、c、d、e、f六种代谢物)速率，只需通过扫描近红外光谱，带入上述建立的近红外预测模型中，并从中选择a、b、c、d、e、f代谢物的浓度值，计算出其反应速率，带入到代谢流中就可算出整个合成途径代谢流量。
实施例3
操作方法同实施例1和2，只需要将l-亮氨酸发酵液进行近红外扫描，就可以得到多种组分的含量，将其化学值带入到实施例2中的代谢流模型，代谢流模型如图1所示，就可以计算出具体代谢流分布。
近红外模型的建立方法中，校正集和检验集的数值选择原则是校正集要包含检验集，模型的建立方法为近红外模型的建立方法，本发明中将二者巧妙进行结合，通过对近红外模型和代谢流模型进行大量的参数完善，以保证模型的准确性，同时达到对发酵过程的监控指导目的，最终实现准确测量相应物质浓度，从而计算产物代谢流量。
表1l-亮氨酸代谢平衡方程组
表1为l-亮氨酸平衡方程组，从以上图表可以看出，共有26个未知数，20个平衡方程，自由度f＝26-20＝6，即只需要得到6种代谢物的生成或消耗速率，即可得到整个代谢流量。相应代谢物浓度值根据之前建立的近红外模型进行，将发酵液放入近红外扫描仪扫描，将得到的光谱带入建立好的模型即可。近红外模型与代谢流模型是两个系统，通过结合将近红外预测得到的浓度值带入到代谢流模型中即可快速分析出细胞内部代谢流分布情况。
通过对发酵液进行近红外扫描带入模型后得到的数值与将发酵液进行传统的液相分析得到的实际数值进行对比验证，如图2所示，具有高度准确性。
在l-亮氨酸发酵上的应用
(1)近红外分析模型和细胞代谢流分析模型的建立
根据“实施例1”所述，对多批次、多种条件的l-亮氨酸发酵过程中的发酵液样品按一定周期进行采集，并利用近红外分析仪采集其近红外光谱，建立近红外分析模型并对其预测能力进行检验；根据“实施例2”所述，建立l-亮氨酸的细胞代谢流分析模型，计算出方程组的自由度f，并根据f的数值，选择相应的待测代谢物。
(2)l-亮氨酸发酵液的近红外光谱扫描，见图3。
(3)l-亮氨酸发酵液中代谢物浓度分析
将所得l-亮氨酸发酵液的近红外光谱带入所建立的近红外分析模型中，预测出相应代谢物的浓度(如葡萄糖、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、乳酸和异亮氨酸)。根据不同时间点代谢物的浓度不同，可以计算得出代谢产物的反应速率，将计算出的反应速率带入建立好的代谢流模型中，就可以计算出该产物合成途径的整个代谢流量。从而能够及时的调整发酵条件，从发酵控制上减少副产物的生成，提高目的产物的产量，对整个发酵过程实现实时监控。
(4)l-亮氨酸发酵的自动调控
“实施例1”建立的模型中即录入了成功批次的发酵实验过程参数又录入了失败批次的发酵过程参数，并且每一批次的发酵过程参数对应“实施例2”中唯一的代谢流模型，实现了将近红外光谱的检测数据与代谢流模型之间的关联；根据近红外检测器在线检测到的参数自动关联到代谢流模型，判断当前细胞代谢状态是否有利于目的产物合成，如果不利于目的产物合成，则对发酵条件作出相应调整。
综上所述，本发明所述方法通过将近红外光谱检测分析技术、代谢流分析调控技术、以及发酵过程控制技术相结合，利用近红外技术快速检测发酵过程中细胞的代谢状态，依据之前建立的发酵模型，根据检测结果对发酵过程参数做出即时调整，保证发酵始终处于最利于目的产物合成的状态。
该技术能够快速地检测不同发酵条件下的细胞代谢流变化，及时地了解发酵过程中细胞内部的生理状态，可应用于保证发酵过程的稳定，最大程度地缩小不同发酵批次之间的差异，保证生产的稳定性，在发酵过程监测和控制方面具有无可比拟的优势。
上述参照具体实施方式对该一种实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。