沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌O157的检测引物及方法与流程

文档序号：16016689发布日期：2018-11-20 21:38阅读：595来源：国知局

本发明涉及微生物分子生物学检测技术，特别是涉及肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的多重pcr检测引物及方法。

背景技术

肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157属于who认定的四大食源性致病菌之列，公共卫生和食品安全意义重大。

肠出血性大肠杆菌o157是一种对人致病的大肠杆菌，以引起肠道出血为特点，症状包括腹痛、血性腹泻、败血症、严重胃肠炎等，严重者可并发溶血性尿毒综合症，引起急性肾衰竭、溶血性贫血和血小板减少甚至死亡。潜伏期为1-10日，通常为48-72小时。o157还是重要的人畜共患性和食源性致病菌。o157主要寄生在牛、羊等家畜和其它反刍动物体内。人主要通过食用被人畜粪便污染的食物，如烹煮不彻底的肉馅制品或未经消毒的牛奶、受粪便污染的水和蔬菜等被感染。美国cdc调查表明，每年约有70000人感染肠出血性大肠杆菌病例。o157：h7主要见于婴幼儿，以爆发流行性为主，美国在1982、1984、1993年曾三次发生o157:h7的爆发性流行。日本曾在1996年爆发过波及9000多人的大流行。o157的主要毒力因子有黏附因子(菌毛、外膜蛋白、紧密素等)、肠毒素(志贺毒素stx、溶血素、ⅲ型分泌系统)等。

单增李斯特菌(listeriamonocytogenes，lm)是一种重要的人畜共患性致病菌和食源性致病菌。lm感染或通过食用污染lm的食品，能引起人和动物的脑膜炎、败血症、严重胃肠炎及孕妇流产等，死亡率高达30％～70％。常见于老人、孕妇或免疫缺陷的人群。lm在4℃能生长繁殖，因此又被成为“冰箱杀手”。2011年夏秋季美国科罗拉多州jensen农场的甜瓜污染lm引起李斯特菌病的流行，造成146人发病，其中30例死亡。

沙门菌(salmonella)是一种革兰氏阴性菌，菌体呈两端钝圆杆状结构，无芽孢结构，多数的沙门菌有菌毛结构，能够运动。人们对沙门菌普遍易感，沙门菌能够引起急性传染病，常在温度较高时的夏秋季节在整个家庭或者用膳团体但闻爆发性流行。多表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻及发热等临床征候群。沙门菌常常通过食物进行传播。大自然界中沙门菌常寄生于家禽家畜的肠腔内，所以屠宰、加工过程中肉类有可能感染该菌。沙门菌的致病性来自染色体上的毒力基因，少量的基因存在于质粒上。目前对毒力岛的研究主要是研究spi-1、spi-2、spi-3、spi-4和spi-5这五个毒力岛，其中的spi-2是沙门菌起致病作用的主要原因，其中包含inva、hut、fim、spv、hns等基因是主要的致病毒力因子。这些基因具有高特异性，常用来设计引物用于沙门菌的检测和鉴定。

对细菌鉴定方法有微生物分离培养法、形态观察法、生化反应、免疫学方法、分子生物学方法等。传统的微生物分离培养要经过增菌培养、选择培养、鉴别培养等步骤，操作繁琐，耗时长，一般需要5-15天的培养鉴定时间，不能满足食源性微生物快速检测的需求。生化特性鉴定法和血清学鉴定法是基于表型特征进行鉴定的，但这些方法鉴定能力有限，区分度差，常因表型发生变异而导致鉴定失败，因此依据表型特征往往不能准确鉴定微生物，尤其是对血清型众多的大肠杆菌。如已发现山梨醇发酵阳性和β-葡糖醛酸糖苷酶活性阳性的大肠杆菌o157菌株，沙门菌的n群、小肠结肠炎耶尔森氏菌等菌的菌体抗原也能与o157菌体抗原的抗体发生交叉反应，因此，也不能通过生化反应和免疫学方法来鉴定o157菌株。

分子生物学检测法是基于核酸检测的方法，具有特异、灵敏等优点，能准确鉴定微生物的种属关系，在微生物的分类鉴定中应用广泛。该类方法又以pcr、多重pcr、荧光定量pcr、基因芯片等检测技术应用较广泛。

已公开的检测eheco157:h7的方法很多，包括pcr、荧光pcr等。这些方法均基于o157的志贺样毒素基因、鞭毛基因flic、溶血素基因hly和eae基因等之中的一到二种基因而建立的。但许多非o157血清型的ehec，如o26、o111、o91、o103、o146等血清型的大肠杆菌以及志贺氏菌、霍乱弧菌、枸橼酸杆菌等的部分菌株也具有志贺样毒素基因，因此，单纯使用一对志贺样毒素基因引物检测无法区分o157与epec、ehec的不同血清型。epec和ehec的eae基因有高度的同源性。eheco26、o111等也有溶血素基因hly，因此对eae、hly基因的鉴定也不能特异检测o157菌株。o157大肠杆菌具有多种鞭毛抗原，而许多非o157血清型菌株，尤其是大肠杆菌o55:h7菌株也有h7鞭毛基因flic，因此flic基因检测只能作为辅助检测手段用于大肠杆菌o157:h7菌株的鉴定。

到目前为止还没有针对三种毒力基因同时鉴定eheco157:h7的多重pcr的报道。与现有的o157的pcr检测法比较，本发明通过一次扩增o157的stx1、rfbe、flic三个携带率最高的毒力基因，检测特异性比常规的检测其中一种或二种基因的pcr方法高，可用于o157的精准鉴定，不会发生错检和漏检的情况。

本发明所述的五重pcr引物及检测方法能够通过一次pcr检测同时鉴定肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157三种食源性病原微生物。

技术实现要素：

为解决上述背景技术中提到的肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的鉴定耗时长、特异性差、灵敏度低等问题，本发明提供了一种同时检测肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157三种食源性病原微生物的灵敏度高的多重pcr检测引物及检测方法。

本发明是通过以下方式实现的：

沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌o157的检测引物及检测方法，其特征在于包括5对引物，引物序列如下：

rfbe上游引物f1：5’-cgtaagagggaccgtaga-3’(seqidno.1)，

rfbe下游引物f2：5’-tggctggattatcgtttg-3’(seqidno.2)，

flic上游引物f3：5’-gctgtcgagttctatcgag-3’(seqidno.3)，

flic下游引物f4：5’-gtgactttatcgccattcc-3’(seqidno.4)，

stx1上游引物f5：5’-acgagggcttgatgtcta-3’(seqidno.5)，

stx1下游引物f6：5’-gtaaggcttctgctgtga-3’(seqidno.6)，

inva上游引物f7：5’-tttcaatgggaactctgc-3’(seqidno.7)，

inva下游引物f8：5’-aacgacgacccttctttt-3’(seqidno.8)，

hlya上游引物f9：5’-tgatttgccaggtatgac-3’(seqidno.9)，

hlya下游引物f10：5’-tttcccttcactgattgc-3’(seqidno.10)。

设计多重pcr引物时应尽量避免引物二聚体、发卡结构的形成。

上述引物分别是针对肠出血性大肠杆菌o157的rfbe、flic、stx1基因、沙门菌的inva基因、单增李斯特菌的hlya基因的保守区，所以引物能够识别所有的o157的rfbe、flic、stx基因、沙门菌的inva基因、单增李斯特菌的hlya基因，因而能检测所有的肠出血性大肠杆菌o157、沙门菌、单增李斯特菌。

本发明所述的多重pcr检测方法，其特征在于其特征在于每25μlpcr反应体系中含有以下组分：10×pcrbuffer2.5ul，25mmol/lmgcl20.5-2μl，taqdna聚合酶1.5-2u，2.5mmol/ldntps2-5ul，dna模版1-2ul，每条引物各0.15-0.5ul，灭菌双蒸水补足体积至25ul，设阳性对照、阴性对照和空白对照(蒸馏水)，将上述pcr反应液添加到反应管中，置pcr仪中进行扩增，扩增程序为94℃变性5min，然后94℃预变性45s，50-55℃退火45s，72℃延长45s，共扩增30-35个循环，最后72℃延伸5min，反应结束后取pcr产物，在1-2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结束后将凝胶置紫外成像仪中观察结果。

结果判定标准：利用本发明所述的引物及检测方法对菌液进行多重pcr检测，如果在琼脂糖凝胶电泳后的紫外成像时观察到五个条带，对应大小分别为172、261、347、568、617bp左右，可判定该菌为肠出血性大肠杆菌o157、沙门菌、单增李斯特菌；如果未出现大小为172、261、347、568、617bp左右的五条带，则判定该菌不是肠出血性大肠杆菌o157、沙门菌、单增李斯特菌。其中172bp的条带为沙门菌的目的基因inva的条带，261bp的条带为单增李斯特菌的目的基因hlya的条带，347、568、617bp为肠出血性大肠杆菌o157的rfbe、flic、stx1基因的条带。

本发明的有益效果：本发明提供的肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的多重pcr检测引物及检测方法，能够特异、灵敏地检测出绝大多数肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157，不会发生误诊、漏诊现象。本试剂盒可应用于食品中携带肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的检测。

附图说明

图1肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的多重pcr检测结果。inva、hlya、stx1、flic、rfbe的引物分别只能扩增出inva、hlya、stx1、flic、rfbe基因，pcr扩增出的目的片段大小分别为172、261、347、568、617bp，不能扩增出其它基因的片段，多重pcr检测肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的灵敏度分别为3.28ng/ul、2.08ng/ul、0.46ng/ul。

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明的有关内容。

实施例1：肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的多重pcr引物的设计、合成

引物是在genbank中查找肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的inva、hlya、stx1、flic、rfbe基因的序列，用clustal、dnaman等生物学软件进行基因序列的比对、分析，找到各靶基因的保守区序列，以保守区序列作为pcr扩增区域，使用primerspremier、oligo等生物学软件设计引物，在线blast验证引物的特异性和可行性，并按照本领域常规的方法合成。

引物序列为：

rfbe上游引物f1：5’-cgtaagagggaccgtaga-3’(seqidno.1)，

rfbe下游引物f2：5’-tggctggattatcgtttg-3’(seqidno.2)，

flic上游引物f3：5’-gctgtcgagttctatcgag-3’(seqidno.3)，

flic下游引物f4：5’-gtgactttatcgccattcc-3’(seqidno.4)，

stx1上游引物f5：5’-acgagggcttgatgtcta-3’(seqidno.5)，

stx1下游引物f6：5’-gtaaggcttctgctgtga-3’(seqidno.6)，

inva上游引物f7：5’-tttcaatgggaactctgc-3’(seqidno.7)，

inva下游引物f8：5’-aacgacgacccttctttt-3’(seqidno.8)，

hlya上游引物f9：5’-tgatttgccaggtatgac-3’(seqidno.9)，

hlya下游引物f10：5’-tttcccttcactgattgc-3’(seqidno.10)。

扩增的stx、flic、rfbe、inva、hlya基因的目的片段大小分别约为350、620、570、172、261bp。

设计多重pcr引物时应尽量避免引物二聚体、发卡结构的形成。

引物由生物测序公司合成。

实施例2：肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的多重pcr检测退火温度优化

1.细菌dna提取

沙门菌、肠出血性大肠杆菌o157的dna提取采用煮沸法裂解细菌，采用酚-氯仿-异戊醇试剂抽提细菌dna。具体步骤为：取o157菌液1ml，于1.5ml的离心管内，置水浴锅中煮沸10分钟。10000r/min离心5min，取上清液，分别加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，然后轻微混匀，在室温条件下放置5-10min后，12000rpm离心10min。重复抽提2-3次。吸取上清液，加入等体积的无水乙醇，在低温条件下放置30min，然后12000r/min离心10min，留沉淀。用预冷的70％乙醇洗涤dna，除去多余的杂质。12000r/min离心10min，轻轻倒掉上层液体，在超净工作台上进行风干，用20-50ul双蒸水或te缓冲液重溶dna，-20℃保存备用。

李斯特菌的dna提取采用溶菌酶-蛋白酶k法裂解细菌，采用酚-氯仿-异戊醇试剂抽提细菌dna。具体步骤为：取李斯特菌液1000ml，于1.5ml的离心管内，与12000r/min的条件下离心10min，倒掉上清液，加入1000ul的无菌双蒸水，使其重新悬浮，加入4ul的溶菌酶后37℃条件下温浴20min，然后加入1ul的蛋白酶k(20mg/ml)，震荡后，于37℃下继续温浴一个小时。取温浴后的溶液，在95℃水浴条件下加热8分钟使蛋白酶灭活。然后取上清液于10000r/min离心5min，取上清液，分别加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，然后轻微混匀，在室温条件下放置5-10min后，12000rpm离心10min。抽提之后，吸取上清液，然后加入等体积的无水乙醇。然后在低温条件下，放置30min。后在12000r/min条件下离心10min，离心后轻微倒去上清液，留沉淀。洗涤：向离心管底部加入70％乙醇，用于洗涤dna，主要作用是除去多余的杂质。洗涤后轻轻倒掉上层液体，在超净工作台上进行风干备用。

2.pcr检测步骤

pcr反应体系为25ul。每25μlpcr反应体系中含有以下组分：10×pcrbuffer2.5ul，25mmol/lmgcl20.5-2μl，taqdna聚合酶1.5-2u，2.5mmol/ldntps2-5ul，dna模版1-2ul，每条引物各0.15-0.5ul，灭菌双蒸水补足体积至25ul，设阳性对照、阴性对照和空白对照(蒸馏水)。

将上述pcr反应液添加到反应管中，置pcr仪中进行扩增，扩增程序为94℃变性5min，然后94℃预变性45s，50-55℃退火45s，72℃延长45s，共扩增30-35个循环，最后72℃延伸5min，反应结束后取pcr产物，在1-2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结束后将凝胶置紫外成像仪中观察结果。

本申请实施例中实际使用的taqdna聚合酶购自takara。

本申请实施例中实际使用pcr仪进行pcr反应。

3.结果判定

电泳结束，将pcr反应产物在1-2％琼脂糖凝胶上电泳，电泳结束，将凝胶置紫外成像仪中观察有无条带及条带大小，来判定pcr扩增是否成功。如果有条带且大小与目的条带的大小一致，则判定检测结果为阳性；如果无条带，则判定检测结果为阴性。详见附图1。

具体说，如果在琼脂糖凝胶电泳后的紫外成像时观察到五个条带，对应大小分别为172、261、347、568、617bp，可判定该菌为肠出血性大肠杆菌o157、沙门菌、单增李斯特菌阳性；如果未出现大小为172、261、347、568、617bp左右的五条带，则判定该菌不是肠出血性大肠杆菌o157、沙门菌、单增李斯特菌。其中172bp的条带为沙门菌的目的基因inva的条带，261bp的条带为单增李斯特菌的目的基因hlya的条带，347、568、617bp为肠出血性大肠杆菌o157的rfbe、flic、stx1基因的条带。

实验结果发现，在退火温度设置为48-52℃时，采用本发明所述的引物和pcr检测方法，均能扩增出肠出血性大肠杆菌o157的三个目的基因条带和沙门菌、单增李斯特菌的各一个条带，说明退火温度对本发明的检测影响小。

实施例3：引物比例对多重pcr检测的影响

肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的dna提取、pcr反应体系和扩增程序参照实施例2。在pcr反应体系中只变换引物对的比例一个变量，每对引物间的上下游引物的摩尔比为1:1，stx1、flic、rfbe、inva、hlya的引物对之间的摩尔比分别设置为1:1:1:1:1、1:2:1:1:1、2:3:1:1:1，研究引物对肠出血性大肠杆菌o157的多重pcr检测的影响。

实验结果发现，stx1、flic、rfbe、inva、hlya的引物对之间的摩尔比为1:2:1:1:1时五条带的亮度最高，说明这五对引物对各自靶基因的扩增效率不同。

实施例4：镁离子浓度对多重pcr检测的影响

肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的dna提取、pcr反应体系和扩增程序参照实施例2。在pcr反应体系中只变换镁离子浓度一个变量，在25μl的pcr反应体系中分别添加25mmol/l的mgcl2的体积为0.25、0.5、1、1.5、2μl，研究镁离子浓度对肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的五重pcr检测的影响。

实验结果发现，镁离子浓度对肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的五重pcr检测的影响较大，在25μl的pcr反应体系中分别添加25mmol/l的mgcl2的体积为1.5-2μl时pcr扩增效果最好，五条带都清晰可辨。

实施例5：循环数对多重pcr检测的影响

肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的dna提取、pcr反应体系和扩增程序参照实施例2。在pcr检测时只变换扩增循环数一个变量，将pcr反应程序中的循环数分别设置为25、30、35，研究循环数对肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的多重pcr检测的影响。

实验结果发现，扩增循环数对肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的多重pcr检测的影响较大，在pcr反应扩增循环数为30和35时的pcr扩增效果好于25个循环，五条带都清晰可辨，粗细相当。

实施例6：多重pcr检测的特异性验证

用本发明所述的多重pcr引物及检测方法对本实验室保存的各种细菌进行特异性验证，细菌dna提取、pcr反应体系和扩增程序参照实施例2。本实验室保存的实验菌有单增李斯特菌分离菌、肠炎沙门菌、大肠埃希氏菌(o1、o2、o78、o16、o9、o10、o104、o157、o111、o126等血清型)、肠致病性大肠杆菌(epec)、肠出血性大肠杆菌(ehec)、肠产毒性大肠杆菌(etec)、肠侵袭性大肠杆菌(eiec)、肠聚集性大肠杆菌(eaec)、志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、马兽疫链球菌、猪链球菌等，每种菌都有多个分离株，提取各种细菌的dna，进行多重pcr检测，设阳性对照(肠出血性大肠杆菌o157的atcc35150株的dna)、空白对照组。检测结果表明只有肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157检测阳性，而其它种类的细菌dna样品检测结果均为阴性，表明本发明的检测引物及检测方法的特异性强，不受其它菌株的干扰。

实施例7：多重pcr检测的灵敏度验证

用微量分光光度计测定各种细菌dna模板的浓度，将细菌dna的浓度进行倍比稀释，然后取各梯度浓度的dna模板进行反应。反应体系和反应程序参照实施例2，研究本发明所述的引物和检测方法的检测灵敏度。

多重pcr检测结果表明本发明的引物及其检测方法能够检测到肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的灵敏度分别为3.28ng/ul、2.08ng/ul、0.46ng/ul。。

上述实施例的实验结果表明，本发明提供的肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的多重pcr引物及其检测方法的特异性强、灵敏度高，能够实现对肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌o157的准确鉴定。

序列表

<110>齐鲁工业大学

<120>沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌o157的检测引物及方法

<130>0

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna