本发明属于植物分子生物学和植物基因工程技术领域，具体涉及一种主要参与合成丹参体内β-榄香烯的酶基因的克隆、鉴定及应用大肠杆菌进行β-榄香烯合成的方法。
背景技术
丹参(salviamiltiorrhizabunge)为唇形科、鼠尾草属双子叶药用植物，根部入药，在临床治疗心脑血管疾病有较高使用价值。丹参植物体内存在大量萜类次生代谢产物，其中部分萜类化合物具有显著的药理学活性，例如，丹参挥发性成分中含有微量的β-榄香烯。
β-榄香烯是具有榄香烷骨架的倍半萜，从温莪术的挥发油中分离出的β-榄香烯是我国自行开发研制的抗肿瘤药物榄香烯乳的主要成分，且常规剂量下不会伤害正常细胞，并具有提高免疫功能的功效。β-榄香烯呈光谱的抗肿瘤特点，毒副作用低，可激活淋巴细胞，诱发或促进机体对肿瘤的排斥反应，诱导肿瘤细胞凋亡；抑制端粒酶活性是β-榄香烯抗癌活性的重要机制之一；此外，还可提高超氧化歧化酶活性，改善微循环及抗血小板聚集。
萜类合酶(terpenesynthase，tps)是丹参基因组中一类重要的萜类次生代谢产物合成相关的基因家族。smtps21是丹参萜类合酶基因家族中的一员，属于tps-a亚家族。研究发现，该基因在大肠杆菌异源生物合成体系中主要催化β-榄香烯的生物合成。本发明为利用生物工程技术生产具有抗癌活性的β-榄香烯化合物提供有效且简便的方法，同时也为应用smtps21基因进行定向、大量合成β-榄香烯而用于医药产品研发提供研究基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于解析丹参倍半萜合酶基因在丹参萜类化合物合成过程中的功能，提供一种参与β-榄香烯等倍半萜合成的萜类合酶基因序列及其编码的蛋白质序列，其扩增引物、以及表达载体pet28a-smtps21、其催化产物及应用。
本发明的另一目的在于提供一种利用倍半萜合酶基因smtps21在大肠杆菌体系中大量合成β-榄香烯的合成方法；以及利用大肠杆菌异源体系实现大量合成β-榄香烯的方法。
本发明提供的smtps21基因，其核苷酸序列为seqidno.1所示。
本发明提供的smtps21基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.2所示。
本发明设计出了扩增smtps21基因的克隆引物，其碱基序列如seqidno.3和seqidno.4所示。
构建了表达载体pet28a-smtps21，其碱基序列含smtps21基因的cdna碱基序列。
本发明目的可通过如下技术方案实现：构建pet28a-smtps21，转化至大肠杆菌表达菌株，以0.5mmiptg(异丙基硫代半乳糖苷)进行诱导表达。通过固相微萃取技术和气质联用(gc-ms)技术检测基因在原核表达系统中的产物，获得smtps21的主要催化产物——β-榄香烯。
附图说明
图1所示为丹参tps-a亚家族成员构建的系统进化树；
图2所示为丹参smtps21在丹参根、茎、叶、花不同器官中的差异表达谱；
图3所示为丹参smtps21大肠杆菌原核表达体系中利用gc-ms检测的产物结果；
图4所示为丹参smtps21在原核表达体系中催化合成β-榄香烯等产物的质谱图结果。
具体实施方式
以下结合实例详细说明本发明。实施是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
实施例1丹参smtps21编码基因的克隆及结构分析
1)依据丹参基因组中的smtps21序列设计引物，以丹参cdna为模板进行pcr扩增，获得长度为1617bp的核苷酸序列，如seqidno.1。根据全长cdna序列翻译后获得丹参smtps21编码蛋白质的氨基酸序列，如seqidno.2。
2)采用rt-qpcr技术对smtps21基因在丹参不同组织器官中表达进行检测。结果如图2所示：发现smtps21在丹参叶中显著高丰度表达。
实施例2丹参smtps21的原核表达体系构建及催化产物检测
1)选取ncoi/ecori作为酶切位点，对smtps21和pet28a载体进行限制性酶切及连接反应，构建pet28a-smtps21基因表达载体。
2)分别将pet28a空载体和pet28a-smtps21转化至大肠杆菌bl21(de3)的感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有50mg/lkana(卡纳霉素)的lb固体培养基中筛选阳性克隆。挑选阳性单克隆菌落并接种于含相应抗生素(50mg/lkana)的lb液体培养基中，培养过夜；再将培养液按1∶50进行转接及扩大培养，待菌液的od600达到0.4-0.6之间时，加入0.5mm的iptg，于25℃摇床中避光诱导20h，转速设为110r/min。
3)取10ml诱导后菌液置于20ml顶空瓶中，萃取温度为60℃，震荡频率为500rpm，萃取时间约为30min，以固相微萃取柱(萃取纤维pdms，100μm)进行萃取。
4)gc-ms仪器为岛津qp2010ultra(hp-5ms：30m×0.25mm×0.25μm)，直接由固相微萃取柱进样。热脱附温度280℃，脱附时间：3min。色谱条件：40℃保持2min，以10℃/min涨至300℃保持5min，氦气流速1ml/min。质谱条件：离子源温度200℃，接口温度250℃，scan模式采集45-500。比对nist库，获得如下结果：相对于转化空载体(对照菌株)，含pet28a-smtps21的菌株在13.707min出现产物β-榄香烯，以β-榄香烯为主要产物(如图3所示)。其中β-榄香烯质谱图如图4所示。
本发明对smtps21进行基因克隆、功能验证并在大肠杆菌中进行β-榄香烯合成方法的发明和应用，发现smtps21可以在原核表达体系中主要催化合成β-榄香烯。本发明为smtps21倍半萜合酶的功能研究提供基础，有助于利用smtps21在大肠杆菌中快速、大量、定向合成具有显著抗癌活性的β-榄香烯，促进基于该化合物的新药研发。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。