用于检测实蝇CG5210基因表达量的引物对的制作方法

本发明涉及生物技术领域中，用于检测实蝇cg5210基因表达量的引物对。

背景技术

橘小实蝇bactroceradorsalis(hendel)隶属双翅目diptera、实蝇科tephritidae、果实蝇属bactrocera，该虫为多食性害虫，可取食柑橘、番石榴、芒果等46科250多种水果蔬菜。以幼虫在水果、蔬菜的果实内部取食以及成虫在果实表皮产卵形成孔洞，造成落果或整个果实腐烂为害，这不仅给果蔬生产带来严重危害，而且给进出口贸易带来严重影响。由于该虫寄主范围广，繁殖力高，适应能力强，许多国家都将其列为重点检疫对象(张彬等，2008)。

橘小实蝇原产于亚洲的热带地区，现分布范围广，涉及亚太地区和非洲地区的热带、亚热带和温带地域。此虫的种群发生数量大，往往对新入侵地的果蔬生产造成严重损失(陈乃中，2009)。自2012年以来，来自澳大利亚等国家和地区的实蝇工作者从形态测量学、遗传学、行为学、化学生态学等方面研究了橘小实蝇复合体中的橘小实蝇、木瓜果实蝇b.papayaedrew&hancock、菲律宾果实蝇b.philippinensisdrew&hancock、入侵果实蝇b.invadensdrew和杨桃果实蝇b.carambolaedrew&hancock，结果显示，木瓜果实蝇、菲律宾果实蝇和入侵果实蝇均为橘小实蝇，是其同物异名，而杨桃果实蝇为另一物种(schutzeetal,2012；2014a；2014b)。此研究已于2014年10月被fao官方网站进行了报道。这一“四合一”的新发现，使橘小实蝇的分布范围有了更大的拓展，形成了全球性的扩散，这对全球实蝇类害虫的科学研究产生了重要影响，对入侵防控工作也提出了进一步的要求。

番石榴果实蝇b.correcta(bezzi)原产于亚洲热带和亚热带地区(汪兴鉴及赵明珠，1989)，现主要分布于泰国、越南、缅甸、尼泊尔、印度、巴基斯坦等国家。在国内仅发生于云南省(梁广勤等，1996)。多食性害虫，以热带和亚热带果蔬为主(梁广勤等，1996)，包括番石榴、芒果、樱桃等30科60余种瓜果蔬菜(whiteimetal,1992)。其危害在于成虫产卵于果皮内侧，幼虫蛀果，引发真菌感染并导致果实腐烂脱落。该虫早在1992年就被列入《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》，且在口岸检疫截获频率较高，对番石榴果实蝇的重要基因相关研究和有效检测存在重要的经济意义。

昆虫表皮由几丁质和表皮蛋白组成，其主要功能是保持身体结构，抑制水分蒸发和抵御外界不良环境的影响，在抗药性方面，昆虫表皮作为化学杀虫剂进入昆虫体内的第一道防线，发挥着不可忽视的重要作用。cg5210基因(idgf6基因)和idgf4基因隶属于对表皮发育起重要作用的糖苷水解酶18家族，两个基因作为成虫盘生长因子(imaginal-disc-growth-factor)对于实蝇的正常发育和羽化起着重要的作用。在近似种果蝇drosophila中两个基因的沉默均被证明会造成果蝇幼虫时期的表皮损伤以及畸形发育，甚至会造成发育过程中的死亡。在家蚕bombyxmori翅芽发育的重要阶段一种idgf基因一直呈现一个非常高的水平，并且idgf基因与翅形成的细胞分化与发育相关。在害虫防治的研究中，鉴于两种基因在昆虫类群中的保守性及其在生长发育中的重要作用，两种基因均可为新杀虫剂的研究提供特异性靶标基因位点。生产的相应双链产品或者制剂会使昆虫因上皮屏障受损而导致过早死亡，并且增加昆虫对于致病菌的感染率，可作为开发害虫防治的新型农药的目标基因。

橘小实蝇和番石榴果实蝇作为重要经济性检疫害虫，对果蔬生产贸易危害巨大。且两种实蝇均具有较强的扩散能力与抗药性，所以研究cg5210基因和idgf4基因的表达水平可以为两种重要经济实蝇的入侵防控提供重要参考。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供橘小实蝇和番石榴果实蝇cg5210基因的实时荧光pcr定量检测方法。

为解决上述技术问题，本发明首先提供一种引物对，所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链dna组成。

所述引物对可用于检测实蝇cg5210基因表达量。

所述引物对中的两条单链dna的摩尔比可为1:1。两条单链dna可独立包装。

为解决上述技术问题，本发明还提供了用于检测实蝇cg5210基因表达量的系统，所述系统所述引物对。

上述系统中，所述系统还包括进行定量pcr检测基因表达量所需的其他试剂和/或仪器。

所述进行定量pcr检测基因表达量所需的其他试剂可为北京华博德亿生物技术有限公司的takaraextaq^tmii(tlirnasehplus)试剂盒中试剂。

所述仪器可为appliedbiosystems7500real-timepcrsystem。

所述可由所述引物对和进行定量pcr检测基因表达量所需的其他试剂和/或仪器组成。

所述系统可为仅包括试剂的试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明还提供了检测实蝇cg5210基因表达量的方法，所述方法包括：利用所述引物对检测待测实蝇的cg5210基因表达量，得到所述待测实蝇cg5210基因表达量。

上述方法中，所述待测实蝇可为橘小实蝇和/或番石榴果实蝇。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述引物对或所述系统的下述任一应用：

x1)在检测实蝇cg5210基因表达量中的应用；

x2)在制备检测实蝇cg5210基因表达量产品中的应用；

x3)在检测实蝇cg5210基因中的应用；

x4)在制备检测实蝇cg5210基因产品中的应用；

x5)在防治实蝇中的应用；

x6)在鉴定实蝇中的应用；

x7)在制备鉴定实蝇产品中的应用；

x8)在检测实蝇cg5210基因干扰效率中的应用；

x9)在检测实蝇防治产品对实蝇cg5210基因干扰效率中的应用；

x10)在检测实蝇防治效果中的应用；

x11)在检测实蝇防治产品对实蝇防治效果评估中的应用。

本发明中，所述实蝇可为橘小实蝇和/或番石榴果实蝇。所述实蝇具体可为所述实蝇的幼虫、蛹和/或成虫。

实验证明，本发明提供的用于检测实蝇cg5210基因表达量的引物对可以特异、快速、准确地对橘小实蝇和番石榴果实蝇的cg5210基因进行定量检测，可用于实蝇cg5210基因干扰效率的评价。另外，定量检测过程中的成本低、操作简单，解决了同一基因在不同实蝇之间表达量的比较问题，并且在实际生产中两种实蝇同一基因使用同一对引物检测更加方便、快捷、成本低。本发明还能够为cg5210基因的研究和实蝇的防治提供工具及相关靶点，对实蝇的防治具有重要的意义，并为有效控制危险性实蝇的扩散、保护农业生产和生态安全、促进我国经济贸易发展提供潜在靶标基因参考。

附图说明

图1为内参基因(18srrna)在橘小实蝇(bd)和番石榴果实蝇(bc)中的检测结果。

图2为cg5210-rt在橘小实蝇(bd)和番石榴果实蝇(bc)中的特异性检测结果。

图3为idgf4-rt在橘小实蝇(bd)和番石榴果实蝇(bc)中的特异性检测结果。

图4为cg5210-rt在橘小实蝇(bd)和番石榴果实蝇(bc)1龄幼虫(l1)、3龄早期幼虫(l3-1)、3龄末期幼虫(l3-3)、早期蛹(p-e)、中期蛹(p-m)、末期蛹(p-l)、刚羽化未性成熟成虫(a1)和十日龄性成熟成虫(a10)中的表达量检测分析结果。相同字母间表示无显著差异，不同字母间表示有显著差异(p<0.05)。

图5为idgf4-rt在橘小实蝇(bd)和番石榴果实蝇(bc)1龄幼虫(l1)、3龄早期幼虫(l3-1)、3龄末期幼虫(l3-3)、早期蛹(p-e)、中期蛹(p-m)、末期蛹(p-l)、刚羽化未性成熟成虫(a1)和十日龄性成熟成虫(a10)中的表达量检测分析结果。相同字母间表示无显著差异，不同字母间表示有显著差异(p<0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次技术重复实验和六组生物学重复，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。

实施例1、用于检测实蝇cg5210和idgf4基因表达量的引物对的制备

本实施例提供了用于检测实蝇cg5210和idgf4基因表达量的引物对，分别记为cg5210-rt和idgf4-rt。cg5210-rt由序列表中序列1和序列2所示的两条单链dna组成，该引物对中两条单链dna的摩尔比为1:1，且两条单链dna均独立包装。idgf4-rt由序列表中序列3和序列4所示的两条单链dna组成，该引物对中两条单链dna的摩尔比为1:1，且两条单链dna均独立包装。

实施例2、利用实施例1的引物对检测实蝇cg5210和idgf4基因表达量

待测实蝇：采自云南的番石榴果实蝇和采自广州的橘小实蝇，每种实蝇一龄幼虫50头、二龄幼虫30头、三龄早期幼虫(自卵孵化后5日龄幼虫)30头、三龄末期幼虫(自卵孵化后7日龄幼虫)20头、早期蛹(自化蛹后1日龄蛹)6头、中期蛹(自化蛹后5日龄蛹)6头、末期蛹(自化蛹后9日龄蛹)6头、羽化后未性成熟成虫10头、十日龄性成熟成虫10头。

利用天根生化科技(北京)有限公司的rnasimple总rna提取试剂盒提取各实蝇的总rna，然后反转录得到cdna。以橘小实蝇和番石榴果实蝇反转录得到的cdna为模板，采用北京华博德亿生物技术有限公司的takaraextaq^tmii(tlirnasehplus)试剂盒，分别利用实施例1的cg5210-rt和idgf4-rt进行实时荧光pcr定量检测cg5210和idgf4基因表达量，所用仪器为appliedbiosystems7500real-timepcrsystem仪器，以ddh2o代替模板作为阴性对照。

实时荧光pcr的反应体系如下：

其中，序列1和序列3所示的单链dna均为正向引物，序列2和序列4所示的单链dna均为反向引物。

实时荧光pcr的反应程序为：预变性95℃30sec；然后95℃5sec，52℃34sec循环40次；95℃15sec；52℃1min；95℃30sec。

内参基因为18srrna，引物序列(huetal.,2014)为：

正向引物18srrna-rt-f：5’-gcgagaggtgaaattcttgg-3’；

反向引物18srrna-rt-r：5’-cgggtaagcgactgagagag-3’。

结果(图1-5)显示，两个引物对均能在橘小实蝇和番石榴果实蝇中进行相关基因的扩增定量，并能有效针对包括幼虫、蛹、成虫等不同发育时期进行检测，且结果稳定、重复性好、特异性高。结果表明两个基因均在两种实蝇的八个发育时期表达，cg5210-rt在橘小实蝇中除三龄末期幼虫与性成熟成虫中有显著性提升外其余时期表达均没有显著性差异，而在番石榴实蝇中表达量的显著性提升集中在中末期蛹以及性成熟成虫。两种实蝇该基因cg5210的表达量主要区别在蛹的中后期和性成熟成虫中。idgf4-rt在橘小实蝇中早期蛹与性成熟成虫中有显著性提升，其余时期表达均没有显著性差异，而在番石榴实蝇中表达量的显著性提升集中在蛹后期和成虫期。两种实蝇该基因idgf4的表达量主要区别在蛹的前后期和早期成虫中。以上结果表明，这两个引物对可以检测比较两种实蝇三个不同虫态涉及八个不同时期相关基因的表达。

将成功进行扩增的扩增产物不同样品不同时期进行双向测序，结果显示，cg5210-rt对橘小实蝇进行扩增得到的产物的序列为序列表中序列5，对番石榴果实蝇进行扩增得到的产物的序列为序列表中序列7；idgf4-rt对橘小实蝇进行扩增得到的产物的序列为序列表中序列6，对番石榴果实蝇进行扩增得到的产物的序列为序列表中序列8。两种引物对均能准确扩增到相应基因的dna片段。

实施例3、实施例1的引物对所需模板量的优化

将实施例2得到的cdna分别进行10倍梯度稀释，得到各实蝇特定发育时期的稀释10倍、100倍、1000倍和10000倍的cdna稀释液(cdna的含量分别为100μg/μl，10μg/μl，1μg/μl和0.1μg/μl)，然后以此为模板利用实施例2的反应体系与反应程序确定最佳模板量，并利用水设置阴性对照。

结果显示，以100μg/μl即稀释10倍后的cdna为模板，两种引物对均可以在橘小实蝇和番石榴果实蝇中得到阳性扩增曲线，并且内参基因和目标基因的扩增曲线为单峰同时同时满足内参基因ct保持在10左右说明各个样品处理中cdna质量达标并且重复性好，检测目标基因的ct值在20—30的合理范围内；而以10μg/μl，1μg/μl和0.1μg/μl的cdna为模板，两种引物对均不能在橘小实蝇和番石榴果实蝇中得到目标基因合理范围内的ct值，即目标基因ct＞30，阴性对照中也无阳性扩增曲线。

对比例1、其它引物对对cg5210和idgf4基因表达量的检测

1、针对cg5210利用进行其他引物对进行扩增，所用引物为：

cg5210-rt-f-1：ggctgaggaacataaggaa；

cg5210-rt-r-1：gcgggcacatcatagaa。

扩增体系与扩增条件同实施例2。

该引物对对橘小实蝇和番石榴果实蝇的cdna中扩增效果均不好，在部分样品与部分时期ct值大于30，溶解曲线不为单峰，并且无法得到成功测序结果。

2、针对idgf4利用其他引物对进行扩增，所用引物对为idgf4-rt-1和idgf4-rt-2。

idgf4-rt-1的两条引物的序列如下：

idgf4-rt-f-1：ccaaatcccgccaatca；

idgf4-rt-r-1：atgccgcccaaacctct。

idgf4-rt-2的两条引物的序列如下：

idgf4-rt-f-2：taccaaatcccgccaatc；

idgf4-rt-r-2：atgccgcccaaacctct。

这两个引物对对橘小实蝇和番石榴果实蝇的cdna中扩增效果均不好，在部分样品与部分时期溶解扩增曲线不为单峰，且ct值大于30，并且无法得到成功测序结果。

<110>中国农业大学

<120>用于检测实蝇cg5210基因表达量的引物对

<160>8

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<213>人工序列

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